一种适于二维电泳的猪肺炎支原体外膜蛋白的提取方法

摘要

本发明涉及一种适于二维电泳的猪肺炎支原体外膜蛋白提取方法，包括菌体培养与收集、液氮研磨、蛋白提取裂解、融冻、超声震荡和醋酸铵乙醇溶液处理等步骤，然后收集蛋白质沉淀并用丙酮漂洗，真空冷冻处理；再经样品裂解，最后离心处理后得到上清液。该发明能大大提高蛋白提取的效率和纯净度，具有操作简便、省工省时、提取效率高、干扰物少等特点，比较适合于蛋白提取困难、提取收率低、干扰杂质多的材料；同时所得蛋白易于二次溶解、杂质和干扰物少，完全满足双向电泳第一向和第二向的要求，可获得分辨率高、重复性好、蛋白点分布均匀、蛋白点清晰的图谱，对猪肺炎支原体组学研究及免疫蛋白的筛选和疫苗候选蛋白筛选的研究具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白的提取方法，具体涉及一种适于二维电泳的猪肺炎支原体外膜蛋白提取方法，属于生物技术领域。

背景技术

猪支原体肺炎(mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)，又称猪地方流行性肺炎，俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的一种慢性呼吸道传染病，主要临诊症状为咳嗽和气喘，主要病理变化特征是肺的尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈肉样或虾肉样实变。该病广泛分布于世界各地，患病猪长期生长发育不良，饲料转化率低，死亡率高，若继发感染可造成严重死亡，所致经济损失很大，对养猪业发展带来严重危害。猪支原体常与蓝耳病和猪圆环病毒混合感染，也常与其他多种细菌、病毒及环境因子协同作用，引起猪呼吸道疾病综合征(PRDC)，气喘病常常是PRDC的原发性病因。该病以肺间质淋巴管、结蹄组织和肺泡组织的渗出性炎症以及浆液性纤维素性胸膜肺炎为主要特征，广泛分布于世界各个国家，曾在许多国家的猪群中引起巨大经济损失。猪支原体已经在世界范围内广泛传播，给世界养猪业造成了严重的经济损失。

本病自然病例仅见于猪，不同年龄、性别和品种的猪均能感染，但乳猪和断乳仔猪易感性最高，发病率和死亡率较高，其次是怀孕后期和哺乳期母猪，肥育猪发病较少，母猪和成年猪多呈慢性和隐性。病猪和带毒猪是本病的传染源。很多地区和猪场由于从外地引进猪只时，未经严格检疫购入带菌猪，引起本病的爆发。仔猪从患病的母猪感染，本病一旦传入，如不采取严密措施，很难彻底扑灭。病猪与健康猪直接接触，或通过飞沫经呼吸道感染。本病一年四季均可发生，但在寒冷、多雨、潮湿或气候骤变时较为多见。饲养管理和卫生条件是影响本病发病率和死亡率的重要因素，尤以饲料质量、猪舍潮湿和拥挤、通风不良等因素影响较大。如继发或并发其他疾病，常引起临诊症状加剧和死亡率升高。该病近年来在我国发生呈逐年上升趋势，已成为危害养猪业最严重的疾病之一，给我国养猪业造成严重的经济损失。

近年来，由支原体所引起的猪支原体肺炎已成为影响养猪业发展的一种重要细菌性疾病。发病后及时采用抗生素进行治疗可显著降低动物死亡率，同时在生产过程中适当添加抗生素也可在一定程度上降低该病的发生率。但随着大量抗菌药特别是广谱抗菌药在养猪业中的广泛使用，细菌对抗菌药物的耐药性问题日趋突出，与此同时也有研究资料表明，亚抑制浓度的抗生素可以影响细菌的代谢过程而改变细菌的毒力或细菌对环境的适应能力等。

 20世纪人类对人的基因组进行了系统研究，对整个基因组进行了测序，其中大部分遗传密码被破译，还有些基因的功能未研究清楚，一些重大疾病的致病机理还未完全解析。随着人类现代科学技术的飞速发展，许多种类的生物基因组测序已经完成，现代生命科学技术研究的重点已经从结构基因组研究转移到后基因组时代即功能基因组的研究。蛋白质是基因功能的体现者，执行生理功能。在众多生物学机制研究中，许多问题在基因水平上不能完全被揭示，所以就要研究其功能，从其体现者蛋白质的角度来研究。蛋白质组起初由澳大利亚学者提出，它包含两个方面的含义，一个是蛋白质组方面的研究，一个是基因组方面的研究，它的具体含义是细胞或组织基因组所表达的全部蛋白质信息。蛋白质组学是以蛋白质组为研究中心，在整体水平上系统研究细胞或组织的全部蛋白质信息，它具有大规模、高通量的特点。21世纪是生命科学领域大发展时期，基因组学研究已进入后基因组学时代，即功能蛋白质组学。蛋白质组学的研究内容非常广泛，主要包括以下几个方面：即结构蛋白质组学、表达蛋白质组学、功能蛋白质组学、差异蛋白质组学等几个方面的内容。二维凝胶电泳(2-dementional gel electrophoresis, 2-DE)是目前蛋白质组学研究中最成熟最经典的蛋白分离技术。这项技术是建立在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上，从蛋白质的等电点和分子量这两个特征将复杂的蛋白质成分进行高通量的分离，首先根据等电点不同在固定pH梯度的干胶条中等电聚焦(IEF)，将蛋白进行第一向分离，然后再垂直方向按照分子量的大小进行第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，实现横向和纵向两个方向的分离，提高了蛋白分离的灵敏度。二维凝胶电泳是蛋白质组学研究中常用的一种蛋白质分离技术，其步骤较多，研究内容复杂，主要包括以下几个方面的内容：原料的采集与回收、蛋白质的提取、蛋白质的纯化、蛋白质的透析脱盐、第一向等电聚焦、第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱鉴定、生物信息学分析等内容。

目前，2-DE技术凭着高通量、高分辨率、高灵敏度和重复性好等特点，仍不失为蛋白质组学研究中最常用的蛋白质分离方法。虽然2-DE技术可以将组织或细胞或体液样品中绝大部分蛋白质分离，在生命科学研究领域中应用的也越来越广，但是仍存在许多问题需要解决，等电聚焦对样品的要求极其严格，若样品中含有过多杂质将使等电聚焦过程终止。目前有很多种蛋白质提取方法，但没有一种方法是通用的，因此要对不同的生物组织采取不同的措施。细菌中含有大量干扰物质，这些物质严重干扰等电聚焦及影响电泳图谱的分析。如对于极酸、极碱、过大过小、难溶蛋白质的分离以及电泳图谱的重复性和分辨率不佳，疏水性蛋白和大分子蛋白很难转入第二向电泳，痕量调控蛋白往往会被高含量的结构蛋白掩盖等问题，这些缺陷往往与蛋白的提取方法相关，这些缺陷在一定程度上使2-DE技术在蛋白质组学方面的应用受到了限制。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种适于二维电泳的猪肺炎支原体外膜蛋白的提取方法，本方法操作简便、蛋白提取效率高、杂质少，不干扰第一向等电聚焦和第二向的聚丙烯酰胺凝胶电泳，能大大提高了蛋白提取的效率和纯净度。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种适于二维电泳的猪肺炎支原体外膜蛋白的提取方法，包括以下步骤：

（1）菌体的培养与收集，将冷冻冻干保存的猪肺炎支原体在支原体培养基上进行复苏，挑取单菌落接种于支原体培养基上，经菌体培养，得到冷冻保存的菌体，备用；

（2）取冷冻菌体，经液氮研磨后，准确称取0.1 g的菌体至离心管中；

（3）往离心管中加入1.0 ml蛋白提取液；

（4）将上述溶液充分混匀后，放入-20℃冰箱中2 h，取出融化后，再次放入-20℃冰箱中2 h；

（5）融化后将上述溶液充分混匀后，恒温超声震荡；

（6）经12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液，向其中加入4倍上清液体积的醋酸铵乙醇溶液，其中醋酸铵乙醇溶液中含有0.5%的β-二巯基乙醇，-20℃沉淀过夜，然后于12000 rpm 4℃离心30 min，收集沉淀；

（7）将沉淀用所述的醋酸铵乙醇溶液漂洗三次，然后再用-20℃的丙酮漂洗三次， 12000rpm 4℃真空离心30 min，获得蛋白粉末；

（8）将蛋白粉末加入样品裂解液中进行裂解；

（9）将上述溶液充分混匀，12000 rpm 4℃离心15 min，保留上清液，去除沉淀，上清液保存于-80℃的冰箱中备用。

所述的提取方法中菌体培养过程为：在支原体培养基上37℃震荡培养，收集支原体培养基上生长的细菌，2000 rpm离心10 min，除去多余的培养基，用pH 为7.4的预冷PBS缓冲液清洗3次，清洗干净后将菌体移至1.5 ml的离心管中，离心管装入的细菌量为离心管总体积的1/3，用移液枪移出多余的PBS缓冲液，用封口膜封住管口，-80℃冷冻保存菌体。

所述的提取方法中，进一步采用以下优选条件：

其中恒温超声震荡时要求：震荡时间为20-25 min，恒温4℃，功率为110 W；

步骤（3）中所用蛋白提取裂解液的配比为：浓度为92.5 mM、pH为7.4的Tris-HCl以及1.5%的SDS、3.5%的巯基乙醇，其余为纯净水；

步骤（8）中样品裂解液的组成为：2%的 NP-40、5.4 M的尿素、65 mM 的DTT、0.002%的溴酚蓝、1.5%的载体两性电解质Bio-lyte。

本发明的积极有益效果：

1、本发明的适于二维电泳的猪肺炎支原体外膜蛋白的提取方法，对蛋白提取步骤和所使用试剂进行优化，增加了蛋白裂解液、液氮研磨和超声波处理方法，这样能对细胞内蛋白进行有效释放，大大提高了蛋白提取的效率和纯净度，有效除去了双向电泳中干扰第一向和第二向的杂质，建立了一种适于二维电泳的猪肺炎支原体外膜蛋白的提取方法。

2、本发明采用液氮研磨，可充分使细菌细胞壁破壁，研磨效果较好；同时优化了蛋白裂解液配方，可有效除去样品中的杂质，并且使蛋白质充分释放，使等电聚焦顺利进行；增加了在冰箱中反复冻融的步骤，提高了蛋白提取的效率；本发明采用的反复冻融是利用冻结-解冻过程中在细菌内部的冰晶体对细胞壁的机械作用而使其破裂的一种物理方法，反复冻融可以降低物质团聚体的水稳性，使其内部的平衡状态发生改变；同时采用在恒温4℃条件下超声震荡，防止蛋白变性并促进蛋白释放。

3、本发明在蛋白上清液中加入醋酸铵乙醇溶液和二巯基乙醇，经沉淀过夜、离心、收集沉淀等操作，可有效除去蛋白中的盐类、酸性杂质；反复用醋酸铵乙醇和丙酮漂洗，可有效除去样品中的杂质，提高蛋白收率。

4、本发明将蛋白质粉末加入样品裂解液中，能再次除去蛋白质中的杂质部分；经高速离心能进一步除去样品中的盐类、核酸、色素、油脂杂质，使蛋白更加纯净，可保证蛋白的二次溶解和提高样品的上样量及等电聚焦的顺利进行。

5、本发明方法有效提高了样品中的蛋白含量，省去了传统方法中的透析除盐等繁琐步骤；该方法整个过程在4 ℃条件下进行，减少了蛋白变性的可能。

6、本发明所得蛋白易于二次溶解，杂质和干扰物少，完全满足双向电泳第一向和第二向的要求，蛋白的纯净度较高，可获得清晰、均匀、重复性好、分辨率高的电泳图谱，有利于蛋白点的后续质谱分析，为猪肺炎支原体的组学研究提供了技术支持；对猪支原体的致病机理及免疫蛋白的筛选和疫苗候选蛋白筛选的研究具有重要意义。

7、本发明对猪肺炎支原体外膜蛋白的提取进行了优化，建立了一套稳定、高效适于双向电泳的猪支原体的外膜蛋白提取方法；与传统方法相比，该方法省工省时、操作简便、蛋白提取效率高、杂质少、能有效除去等电聚焦干扰物等优点，该方法比较适合于蛋白难提取的材料及杂质含量较多的材料。

表1为本发明方法与其它几种方法在蛋白的提取效率和纯净度的比较。

表中数据是这五种方法在相同原料（0.1g）下经不同提取方法所得的OD_595nm值和最终蛋白浓度。其中蛋白浓度、OD595的单位分别为微克/微升、纳米，数值均为平均值。从表1可看出，本发明的方法提取的效率最高，蛋白的纯净度较高。

附图说明

图1为采用本发明方法得到的猪支原体外膜蛋白的双向电泳图谱。

图1中的点为蛋白点，图顶端为蛋白的等电点，右边为蛋白的分子质量，据此图可知每个蛋白点的等电点和分子量。可看出本发明方法得到的电泳图谱清晰，蛋白的纯净度较高。

具体实施方式

以下用具体实施例进一步说明本发明，文中的百分含量，如果没有特别说明均指重量百分比；所用试剂均为分析纯，水为超纯水。

实例1：一种适于二维电泳的猪肺炎支原体外膜蛋白提取方法，包括以下步骤：

（1）菌体的培养与收集，将冷冻冻干保存的猪肺炎支原体在支原体培养基上进行复苏，挑取单菌落接种于支原体培养基中，于37℃震荡培养；收集在支原体培养基上生长的细菌，2000 rpm离心10 min，除去多余的培养基，用预冷的PBS（pH 7.4）缓冲液清洗3次；清洗干净后，将菌体沉淀移至1.5 ml的EP管中，每个EP管装入的细菌量为EP管总体积的1/3（大约500 μl），用移液枪移出多余的PBS缓冲液，用封口膜封住管口，-80℃保存，备用；

（2）取-80℃的冷冻菌体，液氮研磨，准确称取0.1 g的菌体至1.5 ml离心管中；

（3）往离心管中加入等量的蛋白提取液，所用蛋白提取裂解液的配方为：92.5 mM的Tris-HCl (pH7.4)，1.5%的SDS (Sodium dodecyl sulfate)，3.5%的巯基乙醇；

（4）将上述溶液充分混匀后，放入-20℃冰箱中2 h，取出融化后，再次放入-20 ℃冰箱中2 h；

（5）融化后将上述溶液充分混匀，恒温4℃超声震荡25 min；

（6）12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液，向上清液中加入4倍体积的0.1 M醋酸铵乙醇溶液，其中醋酸铵乙醇溶液含有0.5%的β-二巯基乙醇，置于-20℃沉淀过夜，12000 rpm 4℃离心30 min，收集沉淀；

（7）沉淀用0.1 M的醋酸铵乙醇漂洗三次，然后用-20℃的丙酮漂洗三次，用真空冷冻离心干燥机处理蛋白沉淀，获得蛋白粉末；

（8）将蛋白质粉末加入样品裂解液中，其中样品裂解液的组成为：2% 的NP-40、5.4 M的尿素、65 mM的DTT、0.002%的溴酚蓝和1.5%的载体两性电解质Bio-lyte。

（9）将上述溶液充分混匀，12000 r/min 4℃离心15 min，保留上清液，去除沉淀，上清液保存于-80℃的冰箱中备用。

 

实例2：猪肺炎支原体外膜蛋白的检测和验证方法，将实例1得到的外膜蛋白进行检测，具体方法如下：

（1）蛋白浓度的检测采用Bradford法，以牛血清白蛋白为标准，用无菌去离子水将牛血清蛋白质（BSA）配制成不同浓度的标准溶液，加入考马斯亮蓝G-250溶液中，以考马斯亮蓝G-250染色液为对照，混匀放置10 min。用紫外分光光度仪测定在595 nm处的吸光值，绘制标准曲线。取待测蛋白质样品，于595 nm波长下测定OD595的吸光值，根据标准曲线计算样品中蛋白质的含量。

（2）样品水化，用移液器吸取样品，沿着水化盘至左而右线性加入样品，在水化盘的两端各1cm处不要加样，加样时不要有气泡产生；从-80℃的冰箱中取出冷冻保存的IPG胶条（18 cm pH 3-11），室温放置10 min；分清胶条的正负极，从胶条的一侧剥去IPG胶条的保护膜，胶面朝下，慢慢放入水化盘中，不要把样品溶液弄到胶条背面上，因为这些溶液不容易被胶条吸收到。前后移动胶条，避免产生气泡。如果产生气泡，用镊子轻轻提起胶条的一端，前后移动，直到气泡被赶走为止。为了防止液体蒸发，在胶条的上方覆盖3ml的矿物油，盖上盖子；室温下水化，放置24 h。

（3）第一向等电聚焦（IEF），取两个IEF电极片，用7 μl超纯水湿润；分别将两个电极片放在IPG胶条槽的两端，分别将电极压在两个电极片的外缘。将充分水化的胶条从水化盘中取出，超纯水冲洗胶条，去除胶条表面的矿物油和未被吸收的样品液，用镊子将胶条胶面朝下轻轻放入胶条槽，加入2-3 ml矿物油覆盖胶条，将聚焦盘移入聚焦仪中。将标准型胶条槽的尖端面电极与IPGphor仪器的阳极平台接触，胶条槽的平端面电极与IPGphor仪器的阴极平台接触。设定IEF程序并启动，进行等电聚焦。当电压和时间达到所要求的数值时终止等电聚焦程序。等电聚焦的胶条立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，或将IPG胶条放置于水化盘中，-80 ℃冰箱中保存。

（4）IPG胶条的平衡，从聚焦盘中取出胶条，用无菌去离子水冲洗胶条，去除矿物油和杂质，将胶条的胶面朝上放入平衡盘中。IPG胶条平衡两次，每次15 min。在第一次平衡缓冲液中加入DTT，使变性的蛋白处于还原状态，第二次平衡缓冲液中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化。

取20 ml平衡缓冲液Ⅰ（50 mM Tris-HCL，pH 8.8，6 M 尿素，30%甘油，2% SDS，0.002%溴酚蓝，0.1g DTT），在每一个胶条上加10 ml，置于水平摇床上震荡15 min，倒掉平衡缓冲液Ⅰ，用去离子水润洗IPG胶条30 s，将胶条的边缘置于滤纸上1 min，以除去多余的平衡缓冲液Ⅰ。

取20 ml平衡缓冲液Ⅱ（50 mM Tris-HCL，pH 8.8，6 M 尿素，30%甘油，2% SDS，0.002%溴酚蓝，0.25g 碘乙酰胺），在每一个胶条上加10 ml，置于水平摇床上震荡15 min，倒掉平衡缓冲液Ⅱ，用去离子水润洗IPG胶条30 s，将胶条的边缘置于滤纸上1 min，以除去多余的平衡缓冲液Ⅱ。

（5）第二向垂直SDS-PAGE电泳，配制12%的丙烯酰胺凝胶两块。配120 ml凝胶溶液，每块凝胶60 ml。装好灌胶模具，倒入凝胶溶液，上部留1cm的空间，用异丙醇封顶，以减少凝胶溶液暴露于空气，保持胶面平整，放入4℃房间聚合过夜。当凝胶与上方的液体出现分层后，表明凝胶已完全聚合。待凝胶完全凝固后，倒掉凝胶表面的异丁醇，并用去离子水冲洗胶面。

IPG胶条的转移：将平衡后的IPG胶条放置于玻璃板之间的凝胶表面上，用一薄尺将IPG胶条轻轻向下推，使胶条的下部与凝胶充分接触。注意不要在胶条的下方产生任何气泡。加入蛋白Marker，将蛋白Marker胶条加在凝胶的任何一端，使其与凝胶完全接触。琼脂糖封胶液进行封顶：在IPG胶条的上方加入封胶液，使封胶液完全覆盖胶条，4℃放置5 min，使封胶液彻底凝固。

电泳：电泳槽中装好电泳缓冲液，接通电源，开始时用低电压（180V）电泳，待样品完全走出IPG胶条后，再加大电压（200 V）。当溴酚蓝染料迁移到凝胶底部边缘时即可结束电泳。电泳结束后将胶片小心转移到染色盒里固定，固定后进行染色。

（6）双向电泳结果如图1所示，可看出图谱背景清晰、分辨率高、蛋白点清晰、具有较好的重复性，图中可辨蛋白点为834个，能满足后续组学研究的需要。

以上仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明构思基础上的所做的等同变化与修饰，皆属于本发明的保护范围。