一种从酶生物技术制备鸟氨酸转化液中分离鸟氨酸并形成鸟氨酸盐酸盐的方法

摘要

本发明提供一种从酶生物技术制备鸟氨酸转化液中分离鸟氨酸并形成鸟氨酸盐酸盐的方法，所述鸟氨酸转化液是使用精氨酸酶转化精氨酸得到的，首先使用截留分子量为300-1000Da的纳滤膜1处理转化液，获得滤液1；然后再使用截留分子量为50-100Da的纳滤膜2处理滤液1，获得含有鸟氨酸的滤液2；加酸成盐后，使用活性炭脱色，经结晶分离得到鸟氨酸盐酸盐。本发明的方法取代了传统的乙醇提取法，使L-鸟氨酸盐的提取不需要使用无水乙醇，从而使L-鸟氨酸盐的生产企业无需建造防爆车间，降低了产品生产的技术门槛，也使得本发明方法安全可靠；此外，使用发明方法制备L-鸟氨酸盐的过程中产生的尿素溶液可以作为化肥直接用于农业生产。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从酶生物技术制备鸟氨酸转化液中分离鸟氨酸并形成鸟氨酸盐酸盐的方法。

背景技术

鸟氨酸(0rnithine)是1877年杰费在鸟尿的水解液中发现的，故命名为鸟氨酸。L-鸟氨酸是一种非蛋白质氨基酸，呈游离态。在生物体中主要参与尿素循环：鸟氨酸与一分子氨和一分子二氧化碳结合生成瓜氨酸，瓜氨酸再与一分子氨反应生成精氨酸，精氨酸被精氨酸酶水解，产生一分子尿素和一分子鸟氨酸，如此反复排出体内的氨。鸟氨酸是一种二氨基戊酸，有D型和L型，多以L型存在。

鸟氨酸对肝脏至关重要，鸟氨酸对肝脏的保护功能要从人体的鸟循环和精氨酸说起：鸟氨酸与精氨酸具有相似的结构，可以在身体里相互转换。故而，机体中由氨基酸脱氨基作用产生的氨或肠道中细菌腐败作用生成的氨，通过肝脏的鸟氨酸循环使之转化为尿素而从肾脏排出进行解毒。在双盲实验中那些有肝脏病和因肝脏病引起的脑病患者每天服用18克鸟氨酸和服用安慰剂，结果发现服用鸟氨酸的人比服用安慰剂的人有更大的效果。通常，鸟氨酸和精氨酸一起使用，可以增加精氨酸的药效，医学上常把它们复配用来治疗肝昏迷症，并可制成各种营养保健饮料，起到保肝、护肝、抗疲劳、抗虚弱等作用。例如，日本协和发酵公司新开发的复配鸟氨酸以其具有多方面的保健功能而一枝独秀，被誉为“次世代氨基酸”；鸟氨酸和精氨酸一起制成的复方氨基酸也是欧美最普遍的氨基酸之一；在医药上，鸟氨酸还常用作试剂和注射液。

随着生物学家对鸟氨酸功能研究的深入，鸟氨酸的生物功能愈来愈受到食品和医药行业的关注。鸟氨酸能刺激脑垂体分泌生长激素，进而促进蛋白质合成及糖与脂肪的分解代谢(基础代谢)，所以，在结合运动情况下摄食鸟氨酸可减少体内脂肪堆积，增强肌肉和体力，起到减肥保健的作用。

鸟氨酸的制备方法主要有三种，分别是化学合成法，酶法和微生物发酵法。

1．合成法是早期研究鸟氨酸时的制备方法，其过程复杂，成本较高。最大的限制是合成法制备的鸟氨酸同时包含D-鸟氨酸及L-鸟氨酸，因为分离D-鸟氨酸和L-鸟氨酸非常的困难，不适合工业化生产，故已被淘汰。

2．微生物发酵生产的L-鸟氨酸是L型，产品最终以鸟氨酸盐酸盐的形式被提取出来。发酵法因生产成本低，产量大等优点被认为是国内制备L-鸟氨酸的趋势。目前，有几家日本的氨基酸企业（味之素公司、协和公司）在以此方法生产L-鸟氨酸，但是该法在国内尚未普及。

3．酶法制备L-鸟氨酸是在精氨酸酶的作用下，将精氨酸转化为L-鸟氨酸和尿素。因为酶特有的专一性特性，所以制备出来的L-鸟氨酸产品纯度高，提取工艺简单。

国内企业使用酶法制备L-鸟氨酸的工艺图如附图1所示，从图中发现现有工艺的两个缺点：1，提取L-鸟氨酸需在防爆车间内进行，因为提取过程中有使用无水乙醇，这就提高了该产品的生产要求和增加了生产成本；2，提取过程产生的废液（包含乙醇+尿素）属于危险废液，必须经有资质的公司专门处理，显著增加了企业的成产成本。

发明内容

为了解决传统酶法制备L-鸟氨酸中存在的问题，本发明提供了一种从酶生物技术制备鸟氨酸转化液中分离鸟氨酸并形成鸟氨酸盐酸盐的方法。

本发明提供了一种从酶生物技术制备鸟氨酸转化液中分离鸟氨酸并形成鸟氨酸盐酸盐的方法，所述鸟氨酸转化液是使用精氨酸酶转化精氨酸得到的，首先使用截留分子量为300-1000Da的纳滤膜1处理转化液，获得滤液1；然后再使用截留分子量为50-100Da的纳滤膜2处理滤液1，获得含有鸟氨酸的滤液2；加酸成盐后，使用活性炭脱色，经结晶分离得到鸟氨酸盐酸盐。

优选地，所述纳滤膜1的截留分子量为300Da。此时，能够更有效地去除大分子的蛋白，色素，从而提高回收率和纯度。

优选地，所述纳滤膜2的截留分子量为60Da。此时，能够去除转化液中尿素，进一步去除杂质，提高纯度，由于目的物鸟氨酸盐酸与尿素分子量之间的差异性，没有形成截留，回收率较高。

优选地，所述使用活性炭脱色的脱色温度80℃，时间30min，活性炭的添加量是鸟氨酸盐酸盐溶液固形物含量的20%。

与现有的工艺比较：本发明利用多膜组合去除蛋白质，色素等杂质，特别优选了特殊膜能够分离出转化液的尿素，可将分离的尿素再次循环利用制备农业化肥，因此本发明更体现清洁生产，循环经济生产的目的；本发明取代了传统的乙醇提取法，使L-鸟氨酸盐的提取不需要使用无水乙醇，从而使L-鸟氨酸盐的生产企业无需建造防爆车间，降低了产品生产的技术门槛，也使得本发明方法安全可靠；而原有工艺中产生的带有尿素的乙醇溶液却成为危险废品，需要特殊处理。 

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为传统的酶法制备L-鸟氨酸盐的方法；

图2为本发明技术制备L-鸟氨酸盐的方法。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

材料：

菌种：大肠杆菌工程菌E.coli BL21，表达载体为Pet21a(+)-Arg，购自天津启仁医药科技有限公司；

LB液体培养基：去离子水 1L，蛋白胨 8g，酵母粉6 g，NaCl 9 g，用NaOH溶液调节pH至7.2，121℃灭菌20min。

LB固体培养基为含有1.5%琼脂粉的LB液体培养基。

实施例1

本发明的从酶生物技术制备鸟氨酸转化液中分离鸟氨酸并形成鸟氨酸盐酸盐的方法步骤如下：

1、制备精氨酸酶液：

（1）种子液培养：

将产精氨酸酶的大肠杆菌工程菌E.coli BL21接种于500mL的LB液体培养基中，于37℃，200rpm培养至OD₆₀₀值为2.71，备用。

（2）发酵培养：

将种子液按照1:100(v/v)的比例，即在70 L的发酵罐中加入50 L的LB液体培养基，再加入0.5 L种子液进行发酵培养。培养温度37℃，转速300 rpm，初始pH 7.2。每隔1小时取样，当OD₆₀₀值为4.0左右时，下罐，收集菌体。

（3）下罐发酵液先经过200目的晒网，然后采用天津膜天膜MOF4b型中空纤维素柱浓缩体积并清洗菌体，至流出的上清液变得澄清时结束。采用离心的方式，测定菌液中菌体的湿重，并测定菌悬液的L-精氨酸酶活力，菌悬液作为转化酶液，备用。

采用上述制备精氨酸酶的方法，可以大量制备精氨酸酶液。

L-精氨酸酶活力的测定方法如下：

a、L-鸟氨酸标准曲线的建立

用50mL混酸溶液（6mol/L的磷酸：醋酸=1：3）溶解1.25g茚三酮配制0.25g/L的显色溶液，分别配制0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2mmol/L的L-鸟氨酸400μL，加入1.6mL茚三酮显色溶液，沸水浴1h后510nm测定吸光度，以L-鸟氨酸浓度为横坐标，510nm吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。经过计算，L-鸟氨酸标准品浓度的标准曲线是：y=4.0836x-0.0065, R²=0.9993。

b、精氨酸酶活力的测定

将上述实验中获得的酶液稀释5120倍，取450μL的稀释后的酶液，加入5mL的离心管中，加入1mmol/L的溶液MnCl₂溶液0.5μL，20mmol/L的L-精氨酸50μL，质量浓度14%的NaoH溶液0.5μL，混合后37℃水浴10min，加入24μL的2mol/L的盐酸溶液，沸水浴5min。取400μL的转化液，加入1.6mL的茚三酮溶液，沸水浴1h，迅速冷却至室温，测定510nm的吸光度，根据之前所绘制的标准曲线，计算得出L-鸟氨酸的含量，从而推算出精氨酸的酶活力，空白实验以400μL的蒸馏水代替转化液。酶活力定义：在上述反应条件下，于37℃，1min催化形成1μmol的L-鸟氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。经过计算，每克酶液的酶活力是1098μ/g。

2、酶法转化L-精氨酸生产L-鸟氨酸

（1）转化条件：

体积：5000 L；底物浓度：L-精氨酸100g/L；L-精氨酸酶浓度：1000U/L，温度：37℃，转速：100rpm，pH:9-10，底物L-精氨酸溶解后pH约为10，所以无需调节pH。

（2）制备流程：

a、准确称取500 kg底物L-精氨酸，加入装有3000L水的7000L的带夹套反应罐中，第一次定容至4000 L，设置温度为37℃，转速为100 rpm，搅拌溶解并加热底物溶液。

b、按照酶浓度1000U/L，体积5000L计量，当反应罐中的温度达到37℃时，添加L-精氨酸酶液，然后，第二次定容至5000L。控制反应釜的蒸汽和循环水量，使反应釜内温度保持在37±1℃，搅拌均匀后，反应开始计时，反应24小时，升温灭酶，反应结束，测定转化液中的L-鸟氨酸的含量。根据检测结果，并经过计算，转化液中L-鸟氨酸的浓度是：72.22g/L，其总含量是361.09kg，转化率是：95.2%。

本发明采用高效液相色谱法来测定L-鸟氨酸的含量，具体方法如下：高效液相色谱采用Luna 5u SCX柱（250×4.6mm）对鸟氨酸含量进行测定，该液相条件为：示差折光检测器；以乙腈-水-冰醋酸-三乙胺（1：3：0.8：0.6）为流动相，流速为1.0ml/min，进样量10μL。

精确配制系列浓度的L-鸟氨酸标准液，连续进样5次，每次进样10μL，计算峰面积并取平均值，以L-鸟氨酸浓度（X, mmol/L）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线。转化反应结束后L-鸟氨酸经适当稀释后，依据标准曲线进行精确定量。根据检测结果，经过计算，L-鸟氨酸标准液的标准曲线是：y=37.052x-20.484，R²=0.9995。

3、分离鸟氨酸转化液中鸟氨酸并成盐

取10L转化液，并用纳滤膜1进行分离，该纳滤膜1的截留分子量是500Da。从而获得滤液1；然后将滤液1用纳滤膜2过滤，该纳滤膜2的截留分子量是100Da，获得滤液2，同时也获得了尿素溶液，将滤液2用盐酸调节PH5.0-6.0，形成鸟氨酸盐酸盐溶液，使用767型活性炭脱色吸附鸟氨酸盐酸盐中残留的微量杂质，脱色温度80℃，持续搅拌30min，活性炭的添加量是鸟氨酸盐酸盐溶液固形物含量的20%，脱碳获得滤液3；对上述滤液3进行减压蒸馏，直至浓缩至原体积的1/5，获得鸟氨酸浓缩结晶液；降低鸟氨酸盐溶液结晶液温度，使L-鸟氨酸盐酸盐沉淀出来，获得结晶液；结晶液经离心机分离后，获得湿结晶，采用回转干燥器进行干燥，获得L-鸟氨酸盐成品。

经过称重计算，L-鸟氨酸盐酸盐的干重是791.27g，收率相对于精氨酸投料计算为83.3%；经过HPLC鉴定，L-鸟氨酸盐的纯度是98.50%，符合中国食品药品监督管理局的标准，具体检测项目见表1。

收集到的尿素溶液因为已被纳滤膜1、纳滤膜2过滤，所以尿素溶液中只含有非常少量的小分子杂质，且整个制备过程中没有加入重金属物质，所以收集的尿素溶液可以作为农业化肥而直接使用。

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于：

步骤3：分离鸟氨酸转化液中鸟氨酸并成盐

取100L转化液，并用纳滤膜1进行分离，该纳滤膜1的截留分子量是300Da。从而获得滤液1；然后将滤液1用纳滤膜2过滤，该纳滤膜2的截留分子量是100Da，同时也获得了尿素溶液，将滤液2用盐酸调节PH5.0-6.0，形成鸟氨酸盐酸盐溶液，使用767型活性炭脱色吸附鸟氨酸盐酸盐中残留的微量杂质，脱色温度80℃，持续搅拌30min，活性炭的添加量是鸟氨酸盐酸盐溶液固形物含量的20%，脱碳获得滤液3；对上述滤液3进行减压蒸馏，直至浓缩至原体积的1/5，获得鸟氨酸浓缩结晶液；降低鸟氨酸盐溶液结晶液温度，使L-鸟氨酸盐酸盐沉淀出来，获得结晶液；结晶液经离心机分离后，获得湿结晶，采用回转干燥器进行干燥，获得L-鸟氨酸盐成品。

经过称重计算，L-鸟氨酸盐酸盐的干重是7910.70g，收率相对于精氨酸投料计算为83.1%；经过HPLC鉴定，L-鸟氨酸盐的纯度是98.70%，符合中国食品药品监督管理局的标准，具体检测项目见表1。

收集到的尿素溶液因为已被纳滤膜1、纳滤膜2过滤，所以尿素溶液中只含有非常少量的小分子杂质，且整个制备过程中没有加入重金属物质，所以收集的尿素溶液可以作为农业化肥而直接使用。

本实施例其余部分均与实施例1相同。

实施例3

本实施例与实施例1的不同之处在于：

步骤3：分离鸟氨酸转化液中鸟氨酸并成盐

取100L转化液，并用纳滤膜1进行分离，该纳滤膜1的截留分子量是300Da。从而获得滤液1；然后将滤液1用纳滤膜2过滤，该纳滤膜2的截留分子量是60Da，获得滤液2，同时也获得了尿素溶液，将滤液2用盐酸调节PH5.0-6.0，形成鸟氨酸盐酸盐溶液，使用767型活性炭脱色吸附鸟氨酸盐酸盐中残留的微量杂质，脱色温度80℃，持续搅拌30min，活性炭的添加量是鸟氨酸盐酸盐溶液固形物含量的20%，脱碳获得滤液3；对上述滤液3进行减压蒸馏，直至浓缩至原体积的1/5，获得鸟氨酸浓缩结晶液；降低鸟氨酸盐溶液结晶液温度，使L-鸟氨酸盐酸盐沉淀出来，获得结晶液；结晶液经离心机分离后，获得湿结晶，采用回转干燥器进行干燥，获得L-鸟氨酸盐成品。

经过称重计算，L-鸟氨酸盐酸盐的干重是7892.20g，收率相对于精氨酸投料计算为82.9%；经过HPLC鉴定，L-鸟氨酸盐的纯度是99.31%，符合中国食品药品监督管理局的标准。

收集到的尿素溶液因为已被纳滤膜1、纳滤膜2过滤，所以尿素溶液中只含有非常少量的小分子杂质，且整个制备过程中没有加入重金属物质，所以收集的尿素溶液可以作为农业化肥而直接使用。

本实施例其余部分均与实施例1相同。

 

实施例4

本实施例与实施例1的不同之处在于：

步骤3：分离鸟氨酸转化液中鸟氨酸并成盐

取1000L转化液，并用纳滤膜1进行分离，该纳滤膜1的截留分子量是1000Da。从而获得滤液1；然后将滤液1用纳滤膜2过滤，该纳滤膜2的截留分子量是100Da，获得滤液2，同时也获得了尿素溶液，将滤液2用盐酸调节PH5.0-6.0，形成鸟氨酸盐酸盐溶液，使用767型活性炭脱色吸附鸟氨酸盐酸盐中残留的微量杂质，脱色温度80℃，持续搅拌30min，活性炭的添加量是鸟氨酸盐酸盐溶液固形物含量的20%，脱碳获得滤液3；对上述滤液3进行减压蒸馏，直至浓缩至原体积的1/5，获得鸟氨酸浓缩结晶液；降低鸟氨酸盐溶液结晶液温度，使L-鸟氨酸盐酸盐沉淀出来，获得结晶液；结晶液经离心机分离后，获得湿结晶，采用回转干燥器进行干燥，获得L-鸟氨酸盐成品。

经过称重计算，L-鸟氨酸盐酸盐的干重是80006.32g，收率相对于精氨酸投料计算为84.1%；经过HPLC鉴定，L-鸟氨酸盐的纯度是98.5%，符合中国食品药品监督管理局的标准。

收集到的尿素溶液因为已被纳滤膜1、纳滤膜2过滤，所以尿素溶液中只含有非常少量的小分子杂质，且整个制备过程中没有加入重金属物质，所以收集的尿素溶液可以作为农业化肥而直接使用。

本实施例其余部分均与实施例1相同。

表1 应用本发明的方法分离得到的L-鸟氨酸盐酸盐的检测结果

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最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。