一株黄曲霉生防菌的抗菌活性物质及其分离纯化方法

摘要

本发明公开了一种抗菌活性物质，来自于萎缩芽孢杆菌，来源于下述制备方法：将萎缩芽孢杆菌接种至营养肉汤培养基上进行摇床培养，将培养后的发酵液离心收集上清液，将所得上清液用过滤器过滤，即为包含抗菌活性物质的去菌体发酵上清液。进一步的，本发明还公开了所述抗菌活性物质的培养、分离纯化的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗菌活性物质，尤其涉及来源于萎缩芽孢杆菌产生的抗菌活性物质，属于微生物学领域。

背景技术

众所周知，微生物能够产生具有抗细茵、抗真菌和抗病毒等作用的抗菌活性物质。至今为止, 青霉菌类细菌产生的青霉素、头孢霉属产生的头孢菌素、链霉菌属产生的链霉素、 四环素及红霉素等作为抗菌活性物质已经得到了广泛的利用。

然而，由于这些抗菌活性物质已经长年使用，因此普遍导致细菌对这些抗菌活性物质产生了耐受性，因此急需寻找新的、更加强有力的新型抗菌活性物质。

发明内容

针对现有技术的需要，本发明提供了一种新型的、具有良好抗菌、抑菌活性的抗菌活性物质，该抗菌活性物质来源于萎缩芽孢杆菌，本发明还提供了此种抗菌活性物质的分离纯化方法。

为了实现上述目的，本申请发明人多年来对各种杆菌进行了广泛研究，并发现从土壤中分离得到的萎缩芽孢杆菌经过培养能够得到对细菌，尤其是黄曲霉菌具有极好的抑制效果，基于此发现申请了完成了本发明。

本发明是通过下述技术方案实现的：

萎缩芽孢杆菌产生的抗菌活性物质，所述活性物质来源于下述制备方法所制备：将萎缩芽孢杆菌接种至营养肉汤培养基上进行摇床培养，将培养后的发酵液离心收集上清液，将所得上清液用过滤器过滤，即为包含抗菌活性物质的去菌体发酵上清液。

可以理解，本发明并不仅限于上述的抗菌活性物质，还包括包含上述抗菌活性物质的商业成品，例如抗菌剂，可以通过常规的制造方法将本发明的抗菌活性物质与医药学上已知的容许的适当医药栽体组合形成制剂，此类商业产品通常是包含食品和清洁用品的抗菌剂，例如用于化妆水、乳液、洗面奶、护肤剂、面膜、化妆油、防晒剂、木材、纸张、油性漆、布、粘合剂、涂装保护剂、食品保鲜剂 (含饮料) 、糖果、甜饼、零食等点心和辅助食品、 清凉饮料等饮料和食品中，具体的用量可以根据已有药学知识通过常规实验得到。

在上述基础上，本发明提供了所述抗菌活性物质的制备方法，包括下述步骤：1）将萎缩芽孢杆菌菌种接种至营养肉汤培养基，摇床培养即得发酵液；2）将发酵液低温下高速离心，收集上清液，用0.45um微型过滤器过滤，即为包含抗菌活性物质的去菌体发酵上清液。

通过上述步骤可以得到本发明的抗菌活性物质，本领域技术人员可以理解，所得到的上清液并非纯度为100%的抗菌活性物质，而是包含该抗菌活性物质的溶液，在经过更复杂的分离纯化后才能得到高纯度的抗菌活性物质。该物质含量浓度的高低只会影响用量，而不会影响单位含量物质的效力。

在上述方法中，萎缩芽孢杆菌的接种培养条件可根据需要进行调整，申请人在大量研究中得出了较为优选的培养条件：接种量：1-5%；营养肉汤培养基装液量：15-100mL/250mL；营养肉汤培养基初始pH值：5.0-9.0；培养温度：10-50℃；培养时间：12-60h；培养所用摇床转速：10-240r/min。

在上述培养条件下，所得上清液表现出一定的抗菌抑菌活性。

申请人对上述的条件进行了深入研究，发现培养温度为35℃时能有效提高抗菌活性物质的抑菌性能。

更优选的，所述步骤1）的培养条件为接种量：1.5%；营养肉汤培养基装液量：30mL/250mL；营养肉汤培养基初始pH值：7.0；培养时间：48h；培养所用摇床转速：180r/min。

在上述培养条件下，所得到的抗菌活性物质具有最佳的抑菌活性。

为了提高接种效率，在进行接种培养以前，将萎缩芽孢杆菌菌种接种到营养琼脂斜面培养基上恒温培养，加入无菌水以旋涡混合仪振荡使菌体均匀分布。

优选的，萎缩芽孢杆菌菌种接种到营养琼脂斜面培养基上，30℃恒温培养48h，所加入的无菌水含0.1%吐温-80和0.1%琼脂。

在上述基础上，本发明还公开了对所得上清液进行分离纯化的步骤，从而得到高纯度的萎缩芽孢杆菌抗菌活性物质纯化物，该分离纯化方法包括下述步骤：1）将包含抗菌活性物质的去菌体发酵上清液进行粗提，粗提方法为硫酸铵沉淀法；2）包含抗菌活性物质的粗提物进行层析分离纯化，包括脱盐得到富集包含抗菌活性物质的洗脱液和将脱盐所得洗脱液进行离子交换层析将所得流出液收集、合并，浓缩得到萎缩芽孢杆菌抗菌活性物质纯化物的步骤。

优选的，上述步骤1）采用硫酸铵沉淀法：将发酵上清液加入硫酸铵固体粉末至80%饱和度硫酸铵，离心收集沉淀。

优选的，所述步骤2）采用Sephadex G-25脱盐，采用DEAE Sepharose Fast Flow 进行离子交换层析。

在得到上述抗菌活性物质后，申请人对该物质的抗菌抑菌性能进行了广泛研究，发现本发明的萎缩芽孢杆菌抗菌活性物质具有广泛的抗菌活性，尤其对于抑制黄曲霉菌效果显著。

附图说明

图1为Sephadex G-25脱盐紫外检测及抑菌率对照示意图；

图2为DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换层析效果示意图。

具体实施方式

实施例1：萎缩芽孢杆菌抗菌活性物质的培养条件筛选

实验材料：菌种采用萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）；营养琼脂培养基可采用市售任何的此类培养基，本发明所用此培养基的组成为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000 mL，pH7.2，121℃灭菌20min。

测试所用黄曲霉来源：将黄曲霉菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基（PDA）上，30℃恒温培养48h，向其中加入无菌水（含0.1%吐温-80和0.1%琼脂），旋涡混合仪振荡使孢子均匀分布，调节孢子悬浮液浓度为1×105CFU/mL，即为黄曲霉孢子悬浮液。

为了研究不同培养条件对抗菌活性物质抑菌活性的影响，申请人按照下述六个因素进行了试验：首先将萎缩芽孢杆菌菌种接种到营养琼脂斜面培养基上，30℃恒温培养48h，向其中加入无菌水（含0.1%吐温-80和0.1%琼脂），旋涡混合仪振荡使菌体均匀分布，然后以培养温度，培养时间，接种量，摇床转速，培养基初始pH环境，液体培养基装液量作为6个因素，分别取5个水平设计正交实验L₂₅（5⁶），通过方差分析和交互作用分析筛选出抗菌活性物质抑菌率最好的培养条件。

1.1培养温度的确定

将萎缩芽孢杆菌以1%的接种量接种至初始pH值为7.0的营养肉汤培养基，培养基装液量为50mL/250mL，分别于10℃、20℃、30℃、40℃、50℃不同温度条件下，180 r/min摇床振荡培养48h后取出。将发酵液于4℃，8000r/min离心20min，收集上清液，并用0.45μm微型过滤器过滤，检测不同培养温度无菌发酵上清液对黄曲霉的抑菌率。

1.2培养时间的确定

将萎缩芽孢杆菌以1%的接种量接种至初始pH值为7.0的营养肉汤培养基，培养基装液量为50mL/250mL，于30℃，180 r/min摇床转速条件下，分别培养12h、24h、36h、48h、60h后取出，检测不同培养时间无菌发酵上清液对黄曲霉的抑菌率。

1.3接种量的确定

将萎缩芽孢杆菌分别以1%、2%、3%、4%、5%的接种量接种至初始pH值为7.0的营养肉汤培养基，培养基装液量为50mL/250mL，于30℃，180 r/min摇床振荡培养48h后取出，检测不同接种量无菌发酵上清液对黄曲霉的抑菌率。

1.4摇床转速的确定

将萎缩芽孢杆菌以1%的接种量接种至初始pH值为7.0的营养肉汤培养基，培养基装液量为50mL/250mL，培养温度30℃，分别于10、60、120、180、240 r/min摇床转速条件下，培养48h后取出，检测不同摇床转速各组无菌发酵上清液对黄曲霉的抑菌率。

1.5培养基初始pH值得确定

将萎缩芽孢杆菌分别以1%的接种量接种至初始pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的营养肉汤培养基，培养基装液量为50mL/250mL，于30℃，180 r/min摇床振荡培养48h后取出，检测不同初始pH值无菌发酵上清液对黄曲霉的抑菌率。

1.6液体培养基装液量的确定

将萎缩芽孢杆菌分别以1%的接种量接种至初始pH值为7.0的营养肉汤培养基，培养基装液量分别为15、30、50、75、100mL/250mL，于30℃，180 r/min摇床振荡培养48h后取出，检测不同装液量无菌发酵上清液对黄曲霉的抑菌率。

采用下述方法评价各条件下的抑菌效果：取1mL萎缩芽孢杆菌发酵培养无菌上清液于平板中，倾注入20mL PDA培养基摇匀，待培养基凝固后，用直径6mm的无菌打孔器在平板中央打孔，向孔中注入10μL浓度为1×10⁵CFU/mL的黄曲霉孢子悬液，以无菌空白培养基代替上清液做对照。30℃恒温静置培养5d后，用游标卡尺十字交叉法测量黄曲霉直径，以抑菌率表示发酵培养液无菌上清液的抗菌效果，取平均值作为测定结果，每个处理重复3次。以无菌上清液对黄曲霉的抑菌率作为指标来衡量最优培养条件。

测试结果如下:

表1 不同培养条件无菌发酵上清液对黄曲霉的抑菌率

基于表1实验结果，将单因素实验中选出的6个影响因素，分别取5个水平设计正交实验L25（56），通过方差分析和交互作用分析，筛选出抗菌活性物质抑菌率最好的培养条件，正交实验结果如表2：

根据统计学的方法，进行了正交设计实验方差分析，结果如表3所示。从表3中可以看出，6种因素对抗菌活性物质抑制黄曲霉的作用从大到小依次为：培养温度、培养时间、接种量、液体培养基装液量、初始pH值和摇床转速。其中，培养温度的F远大于F临界值，为极显著影响；培养时间和接种量为显著性影响；液体培养基装液量、初始pH值和摇床转速对抑菌率的影响作用不明显。从正交实验方差分析中获知培养温度是对抗菌活性物质影响最显著的因素，所以在接下来的交互作用分析中，将培养温度作为固定项，分别于其他各因素进行交互作用分析。结果表明，培养温度35℃与其他各影响因素交互作用后，抗菌活性物质的抑菌率最高，为85.56%。其中，最佳培养时间为48h，最佳接种量为1.5%，最佳摇床转速为180r/min，最佳培养基初始pH值为7.0，最佳液体培养基装液量为30 mL。

 

表2 发酵条件正交实验结果

根据统计学的方法，进行了正交设计实验方差分析，结果如表3所示。从表3中可以看出，6种因素对抗菌活性物质抑制黄曲霉的作用从大到小依次为：培养温度、培养时间、接种量、液体培养基装液量、初始pH值和摇床转速。其中，培养温度的F远大于F临界值，为极显著影响；培养时间和接种量为显著性影响；液体培养基装液量、初始pH值和摇床转速对抑菌率的影响作用不明显。从正交实验方差分析中获知培养温度是对抗菌活性物质影响最显著的因素，所以在接下来的交互作用分析中，将培养温度作为固定项，分别于其他各因素进行交互作用分析。结果表明，培养温度35℃与其他各影响因素交互作用后，抗菌活性物质的抑菌率最高，为85.56%。其中，最佳培养时间为48h，最佳接种量为1.5%，最佳摇床转速为180r/min，最佳培养基初始pH值为7.0，最佳液体培养基装液量为30 mL。

表3 方差分析表

因素偏差平方和自由度F比显著性培养温度331.814164.114**培养时间233.82014.647*接种量35.07714.027*摇床转速32.88610.025 初始pH值60.71010.047 装液量180.93410.140 误差875.246  

注：*差异显著，p<0.05；**差异极显著，p<0.01。

实施例2：粗提条件的确定

采用上述实验中筛选出的抗菌活性物质最优发酵条件，将萎缩芽孢杆菌于营养肉汤培养基中振荡培养，将发酵液于4℃，8000r/min离心20min，收集上清液，经0.45μm微型过滤器去除菌体后进行抗菌活性物质的粗提实验。

硫酸铵分级沉淀：取去菌体发酵上清液100 mL，向其中缓慢加入硫酸铵固体粉末10.6g、22.6g、36.1g、51.6g、69.7g，使得硫酸铵饱和度分别为20%、40%、60%、80%、100%，然后在4℃静置过夜，于4℃下8000r/min离心20min，收集沉淀。将沉淀物溶解于2倍体积的pH7.5 0.05mol/L磷酸缓冲液中，移入3500D透析袋内，4℃透析过夜，即得抗菌活性物质粗提液。经0.45μm微型过滤器过滤后，取硫酸铵各饱和度下收集得到的粗提液100μL，以pH7.5 0.05mol/L磷酸缓冲液100μL作为对照，进行抑菌活性实验，各处理组实验重复3次。

各种粗提条件对抑菌活性的影响如下表2所示：

表4 硫酸铵粗提方法抑菌活性实验结果

粗提方法 条件抑菌率（%）硫酸铵沉淀 20%15.65  40%31.79  60%50.13  80%78.71  100%68.46

本发明优选在层析分离纯化抗菌活性物质时选择80%饱和度硫酸铵沉淀作为粗提的方法。

实施例3：粗提物的分离纯化

在得到粗提物的基础上，本发明进一步对粗提物进行了分离纯化，为了提高效率，首先都粗提液进行了浓缩，将透析袋剪成10～20cm的小段，在2%（w/v）NaHCO3和0.01mol/L pH8.0 EDTA中煮沸10min，用蒸馏水冲洗干净，再用0.01mol/L pH8.0 EDTA中煮沸10min，冷却后用蒸馏水彻底洗净。用线绳于一端1cm处扎紧透析袋，将待浓缩的蛋白粗提液倒入透析袋内，保留1/3～1/2的空间，用线绳将另一端扎紧，放入烧杯中，在透析袋上撒上PEG20000，4℃静置至透析袋中蛋白达到一定浓度，然后进行Sephadex G-25脱盐和DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换层析纯化。

DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换层析实验结果为：将Sephadex G-25脱盐中的第二峰和第三峰流出液收集、合并，浓缩后进行DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换层析。对萎缩芽孢杆菌中抗菌活性物质的离子交换层析结果见图2。在第一阶段洗脱时，出现了两个吸收峰，在第二阶段洗脱时，出现了一个明显的吸收峰，且紫外吸收值较大，说明其中蛋白含量较高；经对黄曲霉抑菌活性的检测，发现该吸收峰具有较高的抑菌活性，而前两个吸收峰对黄曲霉无抑菌活性。将第二阶段吸收峰的流出液收集、合并，浓缩后即得到萎缩芽孢杆菌抗菌活性物质的纯化物。