一种调控植物农艺性状或产量性状形成的多肽及其应用

摘要

本发明涉及一种调控植物农艺性状和产量性状形成的多肽及其应用。本发明通过在植物中定向调控该细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达水平，改变植物的根系发育、分蘖能力、抽穗时间、穗型结构、每穗籽粒数以及籽粒形态和千粒重等农艺性状和产量性状，进而达到改良植物株型、穗型结构和籽粒形态及重量，增加产量等目的。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及调控植物主要农艺性状或产量性状形成的多肽及其应用。

背景技术

随着全球耕地面积的逐年减少，农作物的产量难以维持人类的发展。虽然粮食作物的亩产在增加，但总产量难以维持增势。根据联合国粮农组织发布的报告，全球面临较大的粮食危机。一些主要粮食作物、油料作物的品种改良显得极为迫切。

水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的粮食作物之一，世界上超过一半人口，包括几乎整个东亚和东南亚的人口，都以稻米为食。因此，增加水稻产量对于解决世界粮食安全问题有着重大的意义。一般来说，影响水稻产量的直接因素主要包括粒重，单穗粒数，单株穗数(近似于单株分蘖数)，结实率这几个方面。除此之外，还包括株高、分蘖等间接因素。因此，通过改变这些因素来促进水稻产量的增加在现代农业生产上有着广泛的应用前景。

利用生物技术进行品种改良已逐步取代传统的育种方式成为获得高产优质农作物及经济作物等的方法。因此，寻找那些可以调控植物相关性状的作用基因就成为利用生物技术提高作物产量的重要前提。

因此，本领域迫切需要进一步开发可应用于改良植物、使植物高产的新的途径，从而实现对农作物、经济作物及花卉等植物的定向改良，获得适合人们需要的植物新品种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控植物农艺性状或产量性状形成的多肽及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种调控植物(如作物)农艺性状和/或产量性状的方法，所述方法包括：调节植物中细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达。

在一个优选例中，所述的植物是禾本科植物；较佳地，所述的禾本科植物是水稻，小麦、玉米、黑麦、高粱；和/或

所述的农艺性状或产量性状包括：根系发育、分蘖能力、抽穗时间、穗型结构、每穗籽粒数、籽粒形态和/或千粒重。

在另一优选例中，所述的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1选自下组：

(a)如SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)限定的多肽序列有80%(较佳地90%；更佳地95%；更佳地98%)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述方法包括：降低植物(如作物)中细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达；从而：

增加植物的穗长、一级分枝、二级分枝和单穗籽粒数；

提高植物种子的粒长、粒宽、粒厚和千粒重

促进植物的分蘖能力；

促进植物茎叶生长；

增加植物株高；

适度延迟植物灌浆期旗叶的衰老；

促进植物根系发育和不定根生成；

降低植物侧根密度；和/或

降低植物中cZOG的含量。

在另一优选例中，所述降低植物中细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达包括：将下调细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1基因转录、蛋白表达或蛋白活性的下调剂转入植物中；较佳地，所述的下调剂是特异性干扰细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1基因转录的干扰分子。

在另一优选例中，所述的干扰分子是以细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物；较佳地，所述的干扰分子是以SEQ ID NO:1第47-542位作为沉默靶标的dsRNA或构建物。

在另一优选例中，所述干扰分子含有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列(即SEQ ID NO:1中第47-542位)。

在另一优选例中，所述的干扰分子是构建物，含有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向    式(I)，

式(I)中，Seq_正向为SEQ ID NO:4所示的多核苷酸，Seq_反向为与Seq_正向互补的多核苷酸；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

在另一优选例中，所述降低植物中细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1表达的方法包括：

(i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：

(a)含有反方向启动的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的编码基因或基因片段(反义分子)的载体；

(b)含有可在植物体内形成特异性干扰细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的编码基因表达(或转录)的成分的干扰分子的载体；

(ii)将植物的组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物组织或器官。

较佳地，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述载体的植物组织或器官；和

(iv)将步骤(iii)中的植物组织或器官再生成植物。

在另一优选例中，所述调控植物(如作物)农艺性状和/或产量性状的方法包括：提高植物中细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达，从而：

增加植物侧根密度；

抑制植物根系生长和不定根生成；

降低植物株高；

抑制植物茎叶生长或分蘖；

加速植物的抽穗、开花、灌浆或衰老；

降低植物的穗长、一级分枝、二级分枝或单穗籽粒数；

降低植物种子的粒长、粒宽、粒厚或千粒重；和/或

提高植物中cZOG的含量。

在另一优选例中，所述提高植物中细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达的方法包括：将编码细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的多核苷酸转入植物，获得转化入所述多核苷酸的植物。

在另一优选例中，所述提高植物中细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达的方法包括：

(S1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有多核苷酸，其编码细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1；

(S2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(S1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物组织、器官或种子。

在另一优选例中，所述提高植物中细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达方法还包括：

(S3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物组织、器官或种子；和

(S4)将步骤(S3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

在本发明的另一方面，提供一种细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1或其编码基因用途，用于调控植物(如作物)农艺性状或产量性状。

在一个优选例中，所述的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1选自下组：

(a)如SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)限定的多肽序列有80%(较佳地90%；更佳地95%；更佳地98%)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的编码基因包含如下序列：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其简并序列。

在本发明的另一方面，提供一种细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1或其编码基因用途，用于作为鉴定植物(如作物)农艺性状或产量性状的分子标记；较佳地，所述的农艺性状或产量性状包括：根系发育、分蘖能力、抽穗时间、穗型结构、每穗籽粒数、籽粒形态和/或千粒重。

在本发明的另一方面，提供一种降低细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1表达的物质的用途，用于调控植物(如作物)农艺性状或产量性状；较佳地，用于：

增加植物的穗长、一级分枝、二级分枝和单穗籽粒数；

提高植物种子的粒长、粒宽、粒厚和千粒重

促进植物的分蘖能力；

促进植物茎叶生长；

增加植物株高；

适度延迟植物灌浆期旗叶的衰老；

促进植物根系发育和不定根生成；

降低植物侧根密度；和/或

降低植物中cZOG的含量。

在一个优选例中，所述的降低细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1表达的物质是特异性干扰细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1基因转录的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是以细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物；较佳地，所述的干扰分子是以SEQ ID NO:1第47-542位作为沉默靶标的dsRNA或构建物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、显示了水稻OsCOG1RNAi和过表达株系根的表型分析。(a-b)：OsCOG1RNAi和过表达株系的qRT-PCR分析。实验中每个株系的RNA均来源于10个单株叶片的混合样品。(c)：水培2周的幼苗的侧根。(d)：大田生长4周左右的转基因株系的侧根。(e-g)：水培两周幼苗的主根长，不定根数和侧根密度的统计。其中侧根密度的统计方式是选取侧根已完全长出的距根基部2cm的范围内进行侧根数的统计。每个株系统计10个单株。Bar=1cm。

图2、显示了水稻OsCOG1过表达和RNAi株系幼苗的表型观察与统计。(a)：萌发2周的野生型、RNAi及过表达转基因幼苗株高(Bar=5cm)。(b)：a图中幼苗株高的统计结果。(n=10，**P值<0.01，Student’s t test)。(c)：田间生长7周幼苗平均一级分蘖数统计结果。(n=10，**P值<0.01，Student’s t test)。(d)田间生长7周幼苗，(Bar=10cm)。

图3、显示了水稻OsCOG1过表达和RNAi株系抽穗期的表型观察与统计。(a-b)：田间生长10周的RNAi(a)和过表达(b)株系。Bar=10cm(c)：同期各株系主蘖穗。Bar=10cm(d-e)：(c)图中各主蘖穗顶部小穗状态。RNAi株系正处于扬花期，过表达株系已开始灌浆。Bar=2mm(f)：田间生长10周的过表达和RNAi株系株系平均一级分蘖数统计结果。(n=20，**P值<0.01，Student’s t test)(g)：田间生长10周的株系抽穗情况统计。以每株植物的主蘖穗是否抽出为标准，“out”表示主蘖穗已完全抽出；“mid”表示主檗穗部分抽出；“in”表示主蘖穗尚未抽出。每个株系统计50个单株再计算百分比。

图4、显示了水稻OsCOG1RNAi和过表达株系生长末期的表型观察与统计。(a)：生长13周的株系的平均株高统计。(n=20，**P值<0.01，Student’st test)(b)：生长14周的RNAi和过表达株系。(c)：生长14周的过表达和RNAi株系的旗叶观察。Bar=10cm。

图5、显示了水稻OsCOG1RNAi和过表达株系的主蘖穗性状统计。(a)：各株系的主蘖穗。Bar=5cm；(b)：平均主蘖穗长。(c)：主蘖穗平均一级分枝数。(d)：主蘖穗平均二级分枝数。(e)：每穗谷粒数。(n=20，**P值<0.01，Student’st test)。

图6、显示了水稻OsCOG1RNAi和过表达株系的籽粒性状统计。(a)籽粒照片，Bar=2mm；(b)：千粒重；(c)：籽粒长宽比；(d)：平均粒长；(e)：平均粒宽；(f)：平均粒厚。(n=20，**P值<0.01，Student’s t test)

图7、显示了水稻OsCOG1的原位杂交分析。(a)：正义探针杂交对照。(b-c)：茎端分生组织(SAM)。(d，g，i)：不同发育时期的花序原基。(e)：萌发4天的幼苗地上部分横切。(f)：侧芽。(h)：不定根原基。(j-m)萌发4天水稻幼苗根部的原位杂交结果。OsCOG1主要在侧根原基(k)，(l)以及根尖(m)中表达。(j)为正义探针对照。Bar=100um

图8、显示了水稻OsCOG1的RNAi和过表达株系内源细胞分裂素糖苷物cisZeatin-O-glucoside(cZOG)的含量测定结果。(a)：cZOG在三个株系中的含量(n=3)。(b)：cZOG标准品与测试样品的色谱峰(HPLC)。(c)：cZOG标准品与测试样品的一级质谱图(MS)。(d)：cZOG标准品与测试样品的二级质谱图(MS/MS)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次分离到一种细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1(CYTOKININ-O-GLUCOSYLTRANSFERASE1；COG1)。通过在植物中定向调控其表达水平，可显著改变植物(如作物)植株的根系发育、分蘖能力、抽穗时间、穗型结构、每穗籽粒数以及籽粒形态和千粒重等重要的农艺性状和产量性状，进而达到改良植物株型和穗型结构，增加产量等目的。

如本文所用，所述的“植物”可以是各种农作物、花卉植物、或林业植物等，包括但不限于：禾本科植物(如稻属)。例如，所述的“植物”包括但不限于：水稻、小麦、玉米、大麦、大豆、油菜、棉花等。

本发明还包括细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。

在本发明中，术语“细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1”指具有细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1活性的SEQ ID NO:3序列的多肽。该术语还包括具有与细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1相同功能的、SEQ ID NO:3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1或其片段的融合蛋白。

任何与所述的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1同源性高(比如与SEQ IDNO:3所示的序列的同源性为70%或更高；优选的，同源性为80%或更高；更优选的，同源性为90%或更高，如同源性95%，98%或99%)的、且具有细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1相同功能的蛋白也包括在本发明内。

在本发明中，“细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基代表性的取代优选的取代Ala(A)Val;Leu;IleValArg(R)Lys;Gln;AsnLysAsn(N)Gln;His;Lys;ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro;AlaAlaHis(H)Asn;Gln;Lys;ArgArgIle(I)Leu;Val;Met;Ala;PheLeuLeu(L)Ile;Val;Met;Ala;PheIleLys(K)Arg;Gln;AsnArgMet(M)Leu;Phe;IleLeuPhe(F)Leu;Val;Ile;Ala;TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr;PheTyrTyr(Y)Trp;Phe;Thr;SerPheVal(V)Ile;Leu;Met;Phe;AlaLeu

本发明还涉及编码本发明细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1或其保守性变异多肽、衍生物的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:3的蛋白质，但与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

应理解，虽然本发明的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1基因优选获自水稻，但是获自其它植物的与水稻细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1基因高度同源(如具有80%以上，如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。

本发明提供了所述的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1或其编码基因的用途，用于调控植物农艺性状或产量性状；或用于筛选对于调控植物农艺性状或产量性状有用的物质(即：所述物质通过调节细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达来调节植物农艺性状或产量性状)。作为一种优选方式，所述的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1可用于：增加植物的穗长、一级分枝、二级分枝和单穗籽粒数；提高植物种子的粒长、粒宽、粒厚和千粒重；促进植物的分蘖能力；促进植物茎叶生长；增加植物株高；适度延迟植物灌浆期旗叶的衰老；促进植物根系发育和不定根生成；降低植物侧根密度；和/或降低植物中cZOG的含量。

本发明还涉及细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1上调剂或下调剂及其用途。由于细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的上调剂或下调剂可调节细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达和/或活性等，因此，所述的上调剂或下调剂也可通过对细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的影响来调控植物农艺性状或产量性状，从而达到改良植物的目的。

任何可提高细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的活性、提高其的稳定性、促进其表达、延长其有效作用时间、或促进其基因转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调控植物农艺性状或产量性状的物质。

任何可降低细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的活性、降低其稳定性、抑制其表达、减少其有效作用时间、或降低其转录和翻译的物质均可用于本发明，作为细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的下调剂、拮抗剂或抑制剂，如干扰所述细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1编码基因表达的干扰分子(如可形成microRNA的干扰分子)。所述的下调剂、拮抗剂或抑制剂可用于调控植物农艺性状或产量性状。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。

本发明还涉及一种调控植物农艺性状或产量性状的方法，该方法包括调节所述植物中细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达。

一方面，本发明提供了另一种调控植物(如作物)农艺性状或产量性状的方法，所述的方法包括：降低所述植物中细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达(包括使细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1不表达或低表达)；从而降低植物侧根密度；促进植物根系发育和不定根生成；增加植物株高；促进植物茎叶生长或分蘖；适度延迟植物的抽穗、开花、灌浆或衰老；增加植物的穗长、一级分枝、二级分枝或单穗籽粒数；增加植物种子的粒长、粒宽、粒厚或千粒重；和/或降低植物中cZOG的含量。

另一方面，本发明提供了一种调控植物(如作物)农艺性状或产量性状的方法，所述的方法包括：使所述植物过量表达细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1，从而：增加植物侧根密度；抑制植物根系生长和不定根生成；降低植物株高；抑制植物茎叶生长或分蘖；加速植物的抽穗、开花、灌浆或衰老；降低植物的穗长、一级分枝、二级分枝或单穗籽粒数；降低植物种子的粒长、粒宽、粒厚或千粒重；和/或提高植物中cZOG的含量。

在得知了所述的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1。

此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达或使之缺失表达，比如将携带反义细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1。

作为本发明的一种实施方式，将编码细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的植物组织或器官中，使所述的植物表达细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1。可通过将所述植物组织或器官再生成植物，获得过量表达细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的植物。

优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的编码基因转入植物器官或组织，获得转化入所述基因的植物组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的编码基因的植物组织、器官或种子再生成植物植株。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的编码基因；

(s2)将植物组织、器官或种子与步骤(s1)中的农杆菌接触，使细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的编码基因转入植物，并整合到植物细胞的染色体上；

(s3)选择出转入细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的编码基因的植物组织、器官或种子；以及

(s4)将步骤(s3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

其它增加细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35S启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

优选的，还提供了一种降低植物中细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达的方法，所述的方法包括：

(1)将干扰细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1基因表达的干扰分子转入植物组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物组织、器官或种子再生成植物。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：

(c)含有反方向启动的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的编码基因或基因片段(反义分子)的载体；

(d)含有可在植物体内形成特异性干扰细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的编码基因表达(或转录)的成分的干扰分子的载体；

(ii)将植物的组织或器官或种子与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物组织或器官或种子。

较佳地，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述载体的植物组织或器官或种子；和

(iv)将步骤(iii)中的植物组织或器官或种子再生成植物。

其它抑制细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。

本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1基因或其同源基因的转基因植物；或者细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1表达量(包括低表达或不表达)降低的植物等。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

此外，本发明还涉及利用细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达情况，鉴定植物的根系发育、分蘖能力、抽穗时间、穗型结构、每穗籽粒数、籽粒形态和/或千粒重。还可利用细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1基因相关的植物相关性状特性作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。

本发明首次揭示通过调控细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1表达水平，可以显著改变植株的分蘖能力、抽穗时间、穗型结构、每穗籽粒数以及籽粒形态和千粒重等重要的农艺性状和产量性状。其次，揭示了其可调控水稻其它农艺性状，包括根系发育(不定根和侧生根的生长和发育)和叶片衰老等方面。第三，揭示了通过调控细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达水平，可以改善植物根系结构及地上部分的生长发育速率。

通过本发明的方法能精细调控植物(作物)重要产量性状的形成能力，其中重要农艺性状和产量性状包括但不限于：根系结构，株高，分蘖数，抽穗时间，穗型结构，每穗籽粒数，籽粒形态和千粒重等性状。尤为重要的是，利用本发明所提供的细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1，可以同时集成协同正向调节作物产量三要素性状(分蘖数，每穗籽粒数和千粒重)的形成能力，对于农作物增产及植物品种的改良具有广泛和重要的应用前景。

所述细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的应用价值包括但不限于以下方面：

a、通过调控水稻内源细胞分裂素糖基化水平来实现对内源活性细胞分裂素水平的调控，从而对植物生长的多个方面产生影响。本发明的优势在于，该基因对内源细胞分裂素水平的调节是温和的，从其在植物的RNAi和过表达株系的表型来看，该基因表达水平的改变不会对植物基本的生长产生严重影响，因而可以利用该基因对植物品种进行优化改良。

b、可广泛应用于植物基因工程，水稻是全世界最重要的粮食作物之一，提高水稻的产量对于维护世界粮食安全有着深远的影响。本发明的RNAi株系可显著提高产量，所以利用基因工程技术抑制水稻中该基因的表达可达到增产的目的。同时，本发明的蛋白还可调节水稻的其它生长发育过程，基于细胞分裂素在植物作用的普遍性，可利用本发明来对其它植物品种，如花卉等进行品种改良。

c、本发明还可应用于植物科学研究领域：细胞分裂素是一种重要的植物生长调节物质，细胞分裂素代谢的调节涉及到内源活性细胞分裂素水平的严谨和精细调控过程。本发明人对于细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1功能的研究，对于进一步认识细胞分裂素在植物体内的作用机制及揭示细胞分裂素在植物中的代谢及调控机制具有重要的意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I、材料和方法

一、植物材料

实施例中所用水稻材料为粳稻品种(Oryza sativa subsp.japonica)中花11。所得的T0代转基因植株在人工气候室培养，培养条件为：光照12h，黑暗12h；温度28℃。实验中所用的OsCOG1RNAi和过表达转基因植株种植于大田，在自然条件下生长。

实施例中所用拟南芥(Arabidopsis thaliana)材料为Columbia生态型(Col-0)，在人工气候室培养，培养条件为：光照16h，黑暗8h，21℃。转基因所得T1代植株用于GFP荧光观察。

二、菌株

1．大肠杆菌(Escherichia coli)：DH5α：质粒转化受体菌。

2．农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：EHA105：根癌农杆菌，用于水稻的遗传转化。

三、质粒

pMD19-T(Amp^r，TaKaRa，大连，中国)，用于TA克隆。

pBlueScript SK：Amp^r，用于原位杂交表达载体构建(Invitrogen)。

pTCK303：Km^r(菌株)和Hyg^r(植物)，用于构建目的基因RNAi表达载体(Wang,M.等；Plant Molecular Biology Reporter22，409-417)。

pHB：Km^r(菌株)和Hyg^r(植物)，用于构建目的基因过量表达载体。(Invitrogen)。

p1300-GN：Km^r(菌株)和Hyg^r(植物)，用于构建promoter::GUS融合表达载体(Invitrogen)。

四、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

1．大肠杆菌超级感受态细胞的制备

取冻存的大肠杆菌DH5α于LB平板上划线，37℃培养过夜至长出单菌落。挑直径2-3mm的单菌落6个，接种于100ml SOC液体培养基中，18℃下150-250rpm培养19-50h至OD600=0.7-0.8，冰浴10min。菌液4℃4000rpm离心10min，去上清，收集菌体，用1/3体积(约30ml)的冰预冷的TB溶液悬浮细胞(慢慢甩动悬浮)。再次离心回收菌体，用1/12.5体积(约8ml)的冰预冷的TB溶液悬浮细胞(慢慢甩动悬浮)，慢慢加入终浓度为7%的DMSO，再冰浴10min左右。制好的感受态分装于预冷的EP管中，每管50ul，液氮速冻后于-80℃冰箱保存。

2．质粒转化大肠杆菌

取1μg左右的质粒DNA加入到50μl DH5α感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；取出后42℃水浴90sec；冰浴2min；加入800μl LB液体培养基，37℃，100rpm摇培1hr；取出后涂在含50μg/ml相应抗生素的LB平板上，37℃培养过夜至形成单菌落。

五、农杆菌感受态细胞的制备及转化

1．农杆菌感受态细胞的制备

取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml利福平的平板划线，28℃培养2天。挑单菌落接种于5mlLB液体培养基中，200rpm，28℃振荡培养18hr左右。将5ml菌液转接于100ml LB液体培养基中，28℃，200rpm，振荡培养至OD₆₀₀=0.5。转入无菌1.5ml的EP管，5000g离心5min,去上清液。加入1ml预冷的0.1M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，4℃下，5000g离心5min，去上清。加入200μl预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl₂溶液，轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-80℃。

2．质粒转化农杆菌

取1μg左右的质粒DNA加入到200μl EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；液氮速冻5min，取出后37℃水浴5min；冰浴2min；加入800μl LB液体培养基，28℃，100rpm摇培3-5hr；取出后7600rpm离心30sec，去掉多余菌液，剩下100ul左右，将菌液打匀，涂在含50μg/ml相应抗生素的LB平板上，28℃培养24-48hr至形成单菌落。

六、质粒的小量抽提(碱裂解法)

取1.5ml培养液倒入1.5ml EP管中，4℃下12000g离心30秒。弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡)，室温下放置5-10分钟。加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒EP管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴5分钟。加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。上清液移入干净EP管中，加入等体积的酚/氯仿(1:1)，振荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。将水相移入干净EP管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70%乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。将沉淀溶于30μl ddH₂O中，储于-20℃冰箱中备用。

七、植物基因组DNA提取

取植物材料放入EP管中，液氮中冷冻后用震荡器研磨。在磨好的粉末中加入600ul裂解缓冲液(0.2M Tris-HCl pH8.0，7M尿素，2%十二烷基肌氨酸钠，0.05M EDTA)混匀。加600ul酚/氯仿，剧烈震荡混匀，12000rpm离心15min，将上清移入新的EP管中，加入600ul异丙醇，60ul3M醋酸钠溶液(pH5.2)混匀，-20℃沉淀15min，12000rpm离心15min，弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀，沉淀干燥后溶于30ul ddH₂O中，储于-20℃冰箱中备用。

八、植物总RNA提取及反转录

1．植物RNA提取

取植物材料放入EP管中，液氮中冷冻后用震荡器研磨。在磨好的粉末中加入1ml Trizol，(样品体积不应超过Trizol溶液体积的10%)室温放置5min，(使核蛋白复合体充分解离)，加入200ul氯仿(每ml Trizol溶液)盖紧盖子，剧烈震荡(用手)15s，室温放置2-3min，11000g4℃离心20min，离心后，将上清转至新的RNAse free EP管中，加600ul异丙醇混合，-20℃冰箱中放置30分钟沉淀RNA，12000g4℃离心20min，除去上清，用1ml75%乙醇(DEPC水配制)洗沉淀，去上清，沉淀在超净台吹干，溶于30ul无RNase水中(DEPC水)。

2.去除DNA污染

37℃保温20-30min。

反应完毕后，再加50ul DEPC水，100ul(等量)酚/氯仿，混匀，12000rpm4℃离心10min，转上清于新的EP管中，加10ul3M NaAC(ph5.2)，250ul(2.5倍)冰无水乙醇，-20℃沉淀30-60min，12000rpm4℃离心15min，70%乙醇清洗，干燥，适量水溶解。

3．RNA浓度测定及反转录

取1ul RNA稀释100倍测浓度，OD260/280界于1.8-2.0之间为宜，2.0为纯RNA，小于1.8有蛋白。取2ug RNA进行反转录。

反转录体系：

反转录程序：

30℃10min→42℃1h→95℃5min→4℃10min→end

九、载体的构建

1．OsCOG1基因过量表达载体

以水稻cDNA为模板，利用特异性引物OEF和OER(序列见表2)扩增水稻OsCOG1全长CDS(包含SEQ ID NO:2)，将扩增片段连入pMD19-T载体，测序正确后使用酶切位点HindIII和XbaI将目的片段连入双元载体pHB，构建OsCOG1过表达载体330OE-pHB。

表2

序列SEQ ID NO:OEFGTAAGCTTATGCCCAGCGATGGCAGCTT5OERGCTCTAGATCAGCATTTCATGAGCATAA6RiF1CAGCTAGCATCGATGGAGAACCTCGAAGTCAA7RiR1GCAGATCTACTAGTCCGCAGGAGACGAAGATG8RiF2CACCCGGGGGAGAACCTCGAAGTCAA9RiR2CAGGATCCCCGCAGGAGACGAAGATG10InsFGGCAGGCCGTTCATTTGG11InsRTGTCCGCCTTCGCCGTAA12

2．OsCOG1基因RNAi载体

以水稻cDNA为模板，利用特异性引物RiF1/RiR1和RiF2/RiR2分别扩增OsCOG1全长cDNA中一个长度为496bp的片段，将扩增片段连入pMD19-T载体(Takara)，测序正确后分别使用酶切位点SpeI/ClaI和SmaI/BamHI分别将正向和反向的目的片段连入双元载体pTCK303，构建OsCOG1RNAi载体330Ri-pTCK。该长度为496bp的片段的序列如下(SEQ ID NO:4)：

1        GGAGAACCTC GAAGTCAAAG AACAACGTGT TCACCATGCC CAGCGATGGC AGCTTCCGCA

61       TCGTCCTCTT CCCGTTCCCG GCGCAGGGCC ACTTCTCCGC CTTCCTCTCC CTCGCCGCCC

121      ACCTCCACGA CGCCCAGCCC ACGGCCGACA TCACCATCGT CTCCACCCCG CGCAACGTGG

181      AAGACCTCCG CCGCCGGTCG AGCTCCCAGA CGCGGTACCT CCGGTTCCAC GCCCTGCCGT

241      TCGCGCCAGC CGAGCACGGC CTGCCCGGAG ACATCGAGTC GACCGACGCC GTGCCGCTCC

301      TCCACTTCAT CACGCTGTTC GAGGCCACCG AGTCGCGCTC GCTACAGGAC AGCTTCGACA

361      GCTTCGTCCG TGACTTGATC ACCGACGCCG GAGCGGACGG TGCCAGGGTC TGCGTCATCG

421      CCGACCCCTT CCTCGCGTGG ACGACAGACG TCGCCCGCCG GCGTGGCGCC GCGCACGCCA

481      TCTTCGTCTC CTGCGG

3．原位杂交表达载体

以水稻cDNA为模板，利用特异性引物InsF和InsR扩增OsCOG1全长cDNA中一个长度为427bp的片段，将扩增片段连入pMD19-T载体(Takara)，测序正确后分别使用pMD19-T载体上的酶切位点PstI和BamHI将目的片段连入载体pBluescript SK，构建原位表达载体330-pBSK。原位杂交探针合成时分别利用酶切位点EcoRI(反义)和BamHI(正义)将载体线性化并利用T3(反义)和T7(正义)聚合酶(Roche)合成反义和正义探针。

十、水稻遗传转化

水稻遗传转化方法参考Toki等，The Plant journal:for cell and molecularbiology47，969-976，并在此基础上根据实际情况进行了部分调整。

1．水稻种子灭菌

种子先用75%乙醇浸泡1分钟，去除乙醇，用无菌水洗2-3次，加入次氯酸钠：水体积比为1：3的消毒液(加1滴吐温/50ml溶液)，放入摇床消毒45分钟(160-165rpm),再用无菌水清洗5遍，无菌滤纸吸除多余水分，将成熟种子放入N6D培养基上(含Pro)，32℃光照培养1-5d。

2.根癌农杆菌的培养

平板挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中(pHB/pTCK303/p1300-GN/pBI101.2:GFP载体：50μg·ml-1Kan＋50μg·mL-1Rif)，28℃摇床过夜，再按2ml转接入50mL同样AB培养基中(含相应抗生素)培养8小时左右至OD600为0.5左右。4℃，4000rpm离心15min，收集菌体。然后用50mL含100uM AS的AAM液体培养基重新悬浮沉淀。

3.转化：愈伤组织与根癌农杆菌的共培养

取生长旺盛的水稻胚性愈伤组织，置于灭菌培养皿中，浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液(含100uM乙酰丁香酮(AS))中1.5min后将愈伤组织取出，中间轻缓晃动数次，倒掉菌液，将愈伤于无菌滤纸上，吸除残余的菌液并晾干，随即转移到共培养培养基(N6D，含100uM AS，不含抗生素)上，于25℃暗培养3天。

4．筛选

取出愈伤，用含200mg/L特美汀(T)的无菌水清洗愈伤组织三遍，至水变清为止，再用无菌水清洗一次，用滤纸吸干多余的水份，将愈伤置于筛选培养基(含25mg/L Hyg+100mg/L T+Pro)32℃光照培养2周，期间随时观察，如愈伤周围有农杆菌长出，随弃之不用，迅速将没有长菌的愈伤移入新的培养基中。

5．分化

经过筛选后将新长出的愈伤用镊子夹下，移入分化培养基中(含50mg/LHyg+100mg/L T)26℃光照培养，每两周换一次培养基，直到愈伤长出小苗为止。将小苗移入生根培养基中生根。待新根长出后可移入土中培养。

十一、原位杂交

1．组织固定和包埋

使用FAA(50%乙醇，5%醋酸，3.7%甲醛)固定材料，似乎比4%多聚甲醛固定时抽气更彻底。FAA固定液(400ml)：无水乙醇200ml，冰醋酸20ml，37%甲醛40ml，水(DEPC)140ml。

第一天：组织固定

将装有2/3体积固定液的青霉素小瓶(小瓶预先在180℃烘过)置于冰上，取新鲜材料投入，冰上真空抽气。冒气泡后保持真空15分钟后，如此数次至材料沉底即可，以达到固定。换新鲜固定液，4℃过夜(12～16小时)。

第二天：脱水

溶液时间50%乙醇60min

60%乙醇60min70%乙醇60min

以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于，并不时轻摇。

第三天：进一步脱水和浸蜡

*以下所有步骤在进行并不时轻摇

溶液时间85%乙醇60min95%乙醇60min

*以下所有步骤在室温进行并不时轻摇

准备工作：60℃预热Plus蜡片(Paraplast Plus)

第四天：浸蜡

将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60℃。几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。

第五天-第七天：浸蜡

每天换蜡两次(Paraplast Plus)

准备工作：60℃预热Regular蜡片(Paraplast Regular)

第八天：包埋

详细步骤和注意事项参见石蜡切片指导。最后包有材料的蜡块置4℃保存。

2．切片

将新的载玻片置于预热至42℃的烤片机上，加1500ul DEPC-H₂O覆盖均匀。用镊子将切出的蜡带漂浮在DEPC-H₂O上，1-2min待蜡带展平后用Kimwipe尽量吸走多余的水。

在烤片过程中可快速镜检，寻找理想切片，可节约切片劳动量及载玻片。最后保持玻片在42℃烤片机上过夜使切片粘牢。

3．探针合成

1).探针转录：

由于T7聚合酶转录效率略高于T3聚合酶，构建探针时注意利用T7转录反义链。1.5ml菌液按常规碱法提取质粒后溶于含有RNA酶的30ul ddH2O中。取适量质粒在200ul体系中酶切过夜使之线性化，。跑胶检测，确定是否。酚氯仿抽提两次除尽RNAse，最后溶于适量DEPC-H₂O。最好切胶回收线性条带，如果确定酶切比较完全也可不回收直接作为转录模板。

转录体系(来自Roche的Kit)：

37℃保温2小时。

转录完后取1ul跑胶检测RNA条带大小和亮度，2小时后一般总共合成RNA2ug左右。跑胶检测时胶和电泳液均换成新的，电泳时间不宜太长，防止RNA降解。

加80ul DEPC-H2O、1ul100mg/ml tRNA和5Units DNAse，37℃再保温10min。

加100ul4M NH4OAc和400ul无水乙醇，-20℃20mins，最高转速10min，70%洗一次最高转速10min，超净台吹干，注意不要烘干。

2).碱解探针

探针一般水解成75-150bp片段按下列公式计算水解时间：

T(time)=(L_i-L_f)/K L_i L_f

Li：原始探针的长度；Lf：最后杂交探针的长度；K=0.11Kb/min

一般500bp的探针水解时间为73min左右。

回收后的RNA溶于100ul DEPC-H2O，加100ul2X碳酸缓冲液(80mMNaHCO₃，120mM Na₂CO₃)。60℃保温到所计算的时间，10ul10%的醋酸停止反应。加1/10体积的3M NaOAc(PH5.2)和两倍体积的无水乙醇，-20℃20min。RNA最后溶于50%去离子甲酰胺中，浓度为1ul/slide。最后杂交时探针浓度为0.5ng/ul/kb，杂交体系为100ul，如原始探针为500bp，那么每张slide需探针0.5ng x100ul x0.5Kb=25ng。如果最后回收的探针总共1ug，那么最后溶于40ul50%去离子甲酰胺中。

4．原位杂交

具体参考Long,J.A.等，Nature379，66-69所用方法。

十二、OsCOG1的RT-PCR和qRT-PCR定量分析

RT-PCR分析使用水稻ACTIN为内参基因。PCR反应条件为：95℃5min；95℃30sec，57℃30sec，72℃30sec，28cycles；72℃7min；4℃。

qRT-PCR分析使用Takara公司的试剂SYBR Premix Ex Taq^TM II SYBRPremix Ex Taq^TM试剂盒配制反应体系，并在实时荧光定量PCR仪iCycler(Bio-Rad)上完成，具体方法参考其说明书。以水稻ACTIN为内参基因，所使用引物见表3。

表3

引物名序列SEQ ID NO:OsCOG1-RTFAGCTTCGTCCGTGACTTGAT13OsCOG1-RTRGTGGATGAGAAGCCCAATGT14OsACT-RTFGAACTGGTATGGTCAAGGCTG15OsACT-RTRACACGGAGCTCGTTGTAGAAG16OsCOG1-qRTFCCGTTCGGGTTTGACATCG17OsCOG1-qRTRGTTCTTGGCACGCATCCTCTC18OsACT-qRTFTGGTCGTACCACAGGTATTGTGTT19OsACT-qRTRAAGGTCGAGACGAAGGATAGCAT20

十三、水稻内源细胞分裂素测定

取在土中生长35天左右的野生型(WT)、RNAi(Ri-1)和过表达(OE-3)转基因株系的地上部分进行内源细胞分裂素含量的分析，RNAi(Ri-1)和过表达(OE-3)转基因株系均经过qRT-PCR鉴定，每个株系各取3个单株进行测定。细胞分裂素的提取参照Dobrev,P.I.等，Journal of chromatography.A950,21-29中记载的方法。以稳定同位素标记的[²H₅]ZOG作为内标。细胞分裂素测定使用高效液相色谱-质谱联用仪Agilent6520Accurate-Mass Q-TOF，色谱柱为ZorbaxXDB-C18，4.6×50mm，1.8um(Agilent)。使用流动相为水(含0.1%体积的甲酸)(A)和甲醇(B)。液相分离条件为：0min，92%A+8%B；15min，85%A+15%B；20min，10%A+90%B；23min，10%A+90%B；25min，92%A+8%B。平均流速为0.2ml/min。二级质谱碰撞能量(Collision energy)为40V。

II、实施例

实施例1、OsCOG1调控水稻根系发育

植物的根系对于植物在土壤中的固着、水和养份的吸收以及环境状态的感知等方面均有重要的作用。已知水稻的根系主要由主根、侧根和不定根这三种根类型构成。本发明人前期的研究结果显示，OsCOG1在水稻的根尖和侧根原基中表达并受生长素诱导，因此推测该基因可能与水稻根的发育相关。为了验证这一结果，本发明人构建了OsCOG1基因的RNA干扰(330Ri-pTCK)和过量表达(330OE-pHB)的载体并转化进入水稻粳稻品种中花11中，最终筛选出了OsCOG1的3个RNAi和3个过量表达的转基因株系。3个RNAi株系中，OsCOG1基因的抑制效果由Ri-1至Ri-3依次递减；而3个过表达株系中，OE-1的过量表达水平较弱，而OE-2和OE-3的过量表达水平较强(图1a，1b)。本发明人对以上6个转基因株系的水稻进行水培并统计了生长2周幼苗的主根长、不定根数和侧根密度。

结果显示，与野生型相比，RNAi株系的主根长度有微弱的增加，不定根数有一定的增多，但侧根密度则显著减少，如转基因株系Ri-1幼苗与野生型相比侧根密度减少了近四分之一；而过表达株系则主根长度变短，不定根减少，以及侧根密度明显增加，如转基因株系OE-3幼苗则侧生根密度增加了将近1.5倍。值得注意的是，这种变化与OsCOG1基因的表达量呈现出一定的相关性(图1c，e-g)。

除此之外，本发明人也观察到了在田间生长的RNAi和过表达转基因株系也有相类似的表型。例如，生长4周左右的RNAi转基因株系亦呈现出较稀疏的侧根，而与之相反，过表达转基因株系的侧根则明显比较浓密(图1d)；生长7周左右的RNAi株系较野生型有更为发达的根系和较多的不定根，而过表达株系则根系长势明显偏弱及不定根偏少(图2d)。

综上，本发明人认为，OsCOG1在受生长素调节的水稻根系的发育过程中具有关键作用。

实施例2、OsCOG1对水稻株高、分蘖、花期及叶片衰老的调控

除了根系的生长发育外，OsCOG1还影响水稻株高、分蘖、开花时间及叶片的衰老。与野生型相比，OsCOG1转基因植株在株高上有较明显的变化，而且这种变化与OsCOG1基因的表达水平呈现出一定的相关性。例如，水培2周的水稻幼苗即表现出明显的株高差异，与野生型植株相比，RNAi转基因植株的幼苗地上部分较长，而过表达转基因株系则明显变短，并且其株高与OsCOG1基因的表达量呈现出负相关性(图2a，b)，这在成年植株中亦有同样的趋势(图4a，b)。

其次，转基因植株的分蘖能力也与OsCOG1表达水平相关。本发明人统计了生长7周和10周各个转基因株系的分蘖状况。结果表明，抑制OsCOG1的表达可显著促进水稻的分蘖；而过量表达该基因则对分蘖有一定的抑制作用(图2c，d；图3f)。

以上结果显示，OsCOG1基因对水稻的营养生长起了一定程度的调控作用，过量表达OsCOG1抑制了水稻茎叶的生长及分蘖，而抑制该基因的表达则可对水稻茎叶的生长和分蘖起到促进作用。

OsCOG1基因还调控水稻的开花时间及叶片的衰老。例如，与野生型相比，过表达株系的抽穗开花期提前，而RNAi株系的抽穗开花期则有一定的延迟。本发明人对生长10周的转基因株系进行抽穗状况的统计，结果表明，在这一阶段，野生型正处于扬花期，而过表达株系则已经开始灌浆，同时，RNAi株系的稻穗则尚未或刚刚抽出(图3a-g)。

另一方面，在生长末期，过表达株系呈现出早衰的表型，在生长第14周时过表达植株的旗叶已变黄，叶尖端开始枯死；而与之相比，RNAi株系的旗叶则仍然保持绿色(图4c)。

以上结果表明，OsCOG1对水稻的开花及叶片衰老都具有调控作用。

实施例3、OsCOG1对水稻产量性状形成的调控

在全世界范围内，水稻作为一种重要的粮食作物，其产量的多少直接或间接地影响着许多国家的经济发展以及粮食安全。一般来说，影响水稻产量的因素主要包括以下几点：1)单株穗数；2)单穗粒数；3)平均粒重等。在单株穗数的性状方面，单株穗数与单株分蘖数有紧密关系。

如前述结果所示，抑制OsCOG1的表达可增加水稻的单株分蘖数或单株穗数，而增加OsCOG1的表达量则可减少水稻的单株分蘖数或单株穗数(图3f)。其次，在单穗粒数的性状上，穗型，包括穗长和穗的分枝状况是决定单穗粒数的重要因素。本发明人考察了OsCOG1的各个RNAi和过表达转基因株系的穗型状态，结果表明，RNAi株系在穗长、一级分枝、二级分枝以及单穗粒数上均比野生型有明显增加，而过表达株系则与野生型相比有明显地减少，其增加或减少量最多约为野生型的1/4到1/3左右，同时，这种变化与OsCOG1的表达量呈现出一定的相关性(图5a-e)。

再次，一般来说，水稻的粒重取决于籽粒的体积(大小)及籽粒的饱满度。本发明人分别对OsCOG1的RNAi和过表达转基因株系籽粒的粒长、粒宽、粒厚、籽粒长宽比以及千粒重进行了测量。结果显示，RNAi转基因株系籽粒的粒长、粒宽、粒厚和千粒重的指标最高可达到野生型的1.1倍左右；而相反地，过表达转基因株系籽粒的粒长、粒宽、粒厚和千粒重的指标均低于野生型，其减少量最多可达到野生型的1/10左右，而且这种变化随OsCOG1基因的表达量增加而呈现出负相关性(图6b-f)。

此外，本发明人还发现，在籽粒形状上，与野生型相比，RNAi转基因株系籽粒较宽圆，而过表达转基因株系籽粒较瘦长(图6a)。

上述结果表明，OsCOG1对于调控水稻穗分枝及籽粒发育具有一定的作用，抑制该基因的表达有助于稻米产量的提高。

实施例4、OsCOG1基因在水稻中的表达模式

本发明人的研究结果表明，OsCOG1基因的抑制和过量表达均可导致水稻在根发育、茎叶生长、分蘖、株高、穗型及籽粒发育等多方面的改变，因此，为了进一步探究OsCOG1基因在水稻中的功能，本发明人取不同生长发育阶段的中花11野生型水稻材料做了OsCOG1基因的原位杂交分析。

结果如图7所示，在正常生长状态下，OsCOG1主要在根部的根尖、侧根原基及不定根原基中表达；而地上部分则是在茎尖、侧芽、叶原基及幼嫩的叶片中表达。这说明OsCOG1在叶的生长发育，侧根及不定根的发育及侧芽的生长中均有一定的作用，而这一结果也与本发明人在RNAi和过表达转基因株系中观察到的结果相一致。

另外，由于OsCOG1转基因株系花穗的分枝状态也发生了改变，而花器官的发育则未见明显的形态学上的异常，因此，本发明人推测OsCOG1可能会在水稻花序的早期分化发育中起着一定的作用。为了验证这一推测，本发明人也对花序的早期分化发育的不同时期进行了原位杂交分析。结果表明，在花序一级枝梗和二级枝梗分化阶段，OsCOG1在分化发育旺盛的原基顶部均有较强的表达(图7)，而与此相应的是，OsCOG1过表达株系的一级和二极枝梗明显减少，而RNAi株系的分枝则增加。这一结果说明，OsCOG1的表达可抑制水稻花穗的一级枝梗和二级枝梗的分化。

实施例5、OsCOG1调控水稻细胞分裂素糖基化水平

玉米素(Zeatin)是植物体内主要的具有生物学活性的细胞分裂素，它的含量多少直接影响到细胞分裂素生物学功能的实现。根据预测，OsCOG1是一个细胞分裂素的-O-糖基转移酶，这类酶的功能是负责将体内有活性的细胞分裂素进行糖化修饰使其暂时性地失活。同时，OsCOG1的RNAi和过表达转基因株系也表现出多方面的与细胞分裂素相关的表型。因此，为了验证OsCOG1转基因株系的这些变化是否与体内细胞分裂素糖基化水平的变化相关，本发明人分别选取RNAi和过表达株系中表型最为强烈的两个株系Ri-1和OE-3生长约35天左右的幼苗地上部分测定了内源细胞分裂素糖苷物trans-Zeatin-O-glucoside(tZOG)、cis-Zeatin-O-glucoside(cZOG)的含量。结果显示，cZOG的含量在过表达植株OE-3中有明显的升高(图8)。

上述结果表明，OsCOG1在调控水稻内源细胞分裂素糖基化水平上具有重要的作用。

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