自我竞争型引物及运用此自我竞争型引物的方法

摘要

在此揭示一种自我竞争型引物，其可用以基于样本核酸的选定区域内相较于参考核酸的选定区域是否具有核苷酸变异而优先扩增具有变异的样本核酸。自我竞争型引物包含5’-竞争域与3’-延长域。5’-竞争域与3’-延长域的序列分别和参考核酸的第一与第二区域互补。第一区域包含参考核酸的选定区域以及紧接于选定区域下游的至少一核苷酸残基。第二区域位于选定区域的下游，且不包含该选定区域，第一与第二区域有至少一核苷酸重迭。在此亦揭示于一样本中相对于非变异样本核酸而优先扩增变异样本核酸的方法。

说明书

技术领域

本发明关于用以侦测变异的方法与引物组。具体来说，本发 明关于一种自我竞争型引物，其可用以优先扩增具有核苷酸变 异的样本核酸。

背景技术

基因突变(gene mutation)指一特定基因或调控序列的核苷 酸序列相较于天然(或正常)核苷酸序列有所改变。突变可以是 点突变(point mutation；即，单一核苷酸置换)、一或多个核苷 酸的缺失(deletion)或插入(insertion)、多个核苷酸的置换 (substitution)或在染色体层级的互换(crossing-over)。

在分子遗传学的领域中，辨识基因突变或核苷酸变异非常 关键。举例来说，已知有许多基因和癌症的发生和/或进程息息 相关，而医学界正尝试针对此类基因发展分子标靶。在进行标 靶疗法时，一或多个目的基因的序列变异可能会影响治疗的效 果。因此，侦测癌细胞中的一或多个基因突变有助于设计出最 适合特定病患的治疗计划。

目前已发展出多种可侦测基因突变或核苷酸变异的技术。 举例来说，可利用桑格式直接测序法(Sanger’s direct sequencing) 来测定目标序列，以得知发生突变的一或多个核苷酸。然而此 种直接测序的灵敏度不高，且操作上费时费力，因而限制了此 技术在临床与研究领域等的应用。

或者是可采用对核苷酸变异序列具有专一性的引物和/或 探针，以正向侦测此类变异。传统上，在设计用以侦测突变的 引物或探针时，必须先知道突变部位的序列。以常用来侦测基 因突变的对偶基因特异性寡核苷酸聚合酶链反应(allele  specific oligonucleotide-polymerase chain reaction，简称 ASO-PCR)为例，需使用对野生型或突变型序列具专一性的引 物，并藉由是否可进行扩增反应，来判断是否有突变序列。 ASO-PCR的缺点之一在于其专一性通常不高，因而造成较高的 假阳性比例。此外，专一性较低时会导致原本不应被扩增的样 本核酸被错误地扩增，此时会将引物序列引入至扩增产物中， 而使得扩增产物的序列与样本核酸的真实序列不同。样本核酸 的错误扩增会使得后续的确认步骤(如测序)失去意义，因为此 时的扩增产物无法反映样本核酸的真正序列。此外，在ASO-PCR 方法中，一个反应系统中只能利用一种引物，因而一次只能侦 测一种序列(野生型或突变型)。因此，当一相同位置可能出现 多种核苷酸变异时，必须设计多种引物以确保能涵盖所有的突 变序列，且必须进行独立的反应，才能正确地侦测到所有的突 变。

另一种常用的侦测技术是连接酶链式反应(ligase chain  reaction，简称LCR)，此技术常和其它以扩增为基础的反应(如 PCR)合并使用。LCR采用热稳定的连接酶以及两组引物组，每 一引物组包含二个引物，当这两个引物彼此非常靠近时会在连 接酶的作用下连接，因而能够用以鉴别单一核苷酸变异(如点突 变、单一核苷酸缺失与单一核苷酸插入)。LCR固然有其自身的 优点，但无法用以侦测具有多重核苷酸变异的突变序列。

更有甚者，当运用于疾病诊断时，由活体组织取得的样本 可能同时含有野生型细胞以及突变型细胞。当可想见，野生型 细胞的数量通常远高于突变细胞，这可能会影响突变序列的扩 增与侦测。

有鉴于上述问题，相关领域亟需提出一种能够正确地侦测核 苷酸变异的方法，包括单一核苷酸与多核苷酸变异。

发明内容

发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本 揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整 概述，且其用意并非在于指出本发明实施例的重要/关键组件或 界定本发明的范围。

本发明至少部分是基于一种新颖的引物设计方案，此种设 计方案使得在扩增过程中，能够优先扩增带有变异序列的核酸 (相较于参考核酸)，且因而可用以侦测核苷酸变异。

本发明的一个方面是关于一种自我竞争型引物，其可用以 基于一样本核酸的一选定区域内相较于一参考核酸的一选定区 域具有或不具有一核苷酸变异，而优先扩增具有核苷酸变异的 该样本核酸。

依据本发明的一个实施例，所述的自我竞争型引物包含一 5’-竞争域与一3’-延长域。上述5’-竞争域包含与参考核酸的第 一区域互补的一序列，其中上述第一区域包含该参考核酸的选 定区域以及紧接于该选定区域下游的至少一个核苷酸残基。所 述的3’-延长域包含与参考核酸的第二区域互补的序列，其中上 述第二区域位于该参考核酸的该选定区域下游，且不包含该选 定区域；此外，上述的第一区域与第二区域有至少一个核苷酸 的重迭。所述的3’-延长域可作为PCR式扩增反应中的正向引 物，且能够相对于不具有核苷酸变异的样本核酸(即，非变异样 本核酸)而优先扩增具有核苷酸变异的样本核酸(即，变异样本 核酸)。

根据本发明某些实施例，上述自我竞争型引物为非嵌合型 引物。在其它替代性实施例中，上述自我竞争型引物为嵌合型 引物。

在本发明多种不同实施方式中，3’-延长域的最后一个核苷 酸与位于参考核酸的选定区域下游1–37个核苷酸的核苷酸残 基互补。

根据本发明某些实施例，自我竞争型引物的5’-竞争域与 3’-延长域可直接或间接透过3’-5’链接(linkage)或5’-5’链接而 相接。在此二个功能域直接链接的情形中，自我竞争型引物由 5’-竞争域与3’-延长域所组成。在替代性的实施例中，自我竞 争型引物可更包含一核苷链(nucleosidic linker)或非核苷链 (non-nucleosidic linker)以连接5’-竞争域与3’-延长域。非核苷 链的例示性实施例可为肽、碳水化合物、脂类、脂肪酸、C2–C18 烷基链(alkyl linker)、磷酸根(phosphate group)、磷酸酯 (phosphate ester)、亚磷酰胺(phosphoramidite)、聚乙二醇链 (poly(ethylene glycol)linker)、乙二醇链、侧链烷基链(branched  alkyl linker)、丙三醇(glycerol)或杂环基团(heterocyclic  moiety)。本发明的一个实施例中使用了C3间隔物(C3spacer) 作为非核苷链。

在一个实施例中，自我竞争型引物的5’-竞争域的序列为 GGTAGTTGGAGCTGGTGGCG(SEQ ID NO:SEQ ID NO:1)、3’- 延长域的序列为GAATATAAACTTGTGGTAGTTGG(SEQ ID NO: 2)，且5’-竞争域与3’-延长域由C3间隔物所连接。在另一实施 例中，自我竞争型引物的5’-竞争域的序列为 ACCGTGCAGCTCATCACGCAG(SEQ ID NO:8)、3’-延长域的序 列为CTCACCTCCACCGTGCA(SEQ ID NO:9)，及且5’-竞争域 与3’-延长域系由C3间隔物所连接。

本发明的一个方面是关于一种PCR式的扩增方法，其可基 于一样本核酸的选定区域中是否具有核苷酸变异(相较于参考 核酸的选定区域)，而优先扩增变异样本核酸。

根据本发明一个实施例，上述扩增方法包含一扩增步骤，

其利用根据本发明上述态样/实施例的自我竞争型引物来扩增 样本核酸，而使得具有核苷酸变异的样本核酸(即，变异样本核 酸)可相对于不具有核苷酸变异的样本核酸(即，非变异样本核 酸)而优先扩增。

本发明又一个方面是关于一种PCR式的侦测方法，其可用 以侦测一样本核酸的选定区域中是否具有核苷酸变异(相较于 参考核酸的选定区域)。

根据本发明的一个实施例，上述侦测方法包含扩增步骤与 侦测步骤。在扩增步骤中，利用根据本发明上述态样/实施例的 自我竞争型引物来扩增样本核酸以产生一扩增产物；其后在侦 测步骤中决定样本核酸的选定区域中是否出现核苷酸变异。

在一个实施例中，上述侦测步骤包含测序该扩增产物。额 外地或可任选地，上述侦测步骤包含定量选定区域中具有核苷 酸变异的扩增产物和/或选定区域中不具有核苷酸变异的扩增 产物。

在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知 识者当可轻易了解本发明的基本精神及其它发明目的，以及本 发明所采用的技术手段与实施方式。

附图说明

为让本发明的上述与其它目的、特征、优点与实施例能更明 显易懂，所附图式的说明如下：

图1A至图1C为示意图，概要地说明根据本发明实施方式 的自我竞争型引物的设计方案；以及

图2为照片，呈现出根据本发明的实施例对变异序列进行优 先扩增的电泳结果。

附图中组件符号的简单说明：

100  自我竞争型引物

110  5’-竞争域

115  选定区域

120  3’-延长域

200  参考核酸

210、310、310’  第一区域

215、315、315’  选定区域

220、320  第二区域

300  非变异样本核酸

300’ 变异样本核酸

具体实施方式

为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发 明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实 施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多 个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方 法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同 或均等的功能与步骤顺序。

除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含 义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意 义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的 单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该 名词的单数型。同时，在此处“至少一”以及“一或多”等词 汇当包含一、二、三或更多种。

虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数界是约略 的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施方式的相关数值。 然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的 标准偏差。在此处，“约”通常指实际数值在一特定数值或范 围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。或者是，“约”一词代 表实际数值落在平均值的可接受标准差之内，视本发明所属技 术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除 非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数 值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条 件、数量比例及其它相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非 另有相反的说明，本说明书与附随权利要求所揭示的数值参数 皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数 理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。

在本说明书中，“样本”指任何含有核酸的样本。所述的 样本可为“生物样本”，其包含以下成分或由以下成分所组成： 分离自动物或植物的细胞、组织或组成份(如体液)。上述动物 较佳可为人类。在本说明书中，生物样本包含取自需要医学处 置的个体的临床样本。例示性的生物样本包括但不限于衍生自 以下的样本：血液、唾液、痰液、尿液、粪便、皮肤细胞、毛 囊、精液、阴道液、骨骼片段、骨髓、脑部成分、脑脊髓液、 羊膜液与组织切片。当可理解，这些例示并非用以限定视为适 用于本发明的样本类型。

“核酸”(nucleic acid)一词在此处指由二或更多个核苷酸 (nucleotide)、核苷酸(nucleoside)或核碱基(nucleobase，如脱氧 核糖核苷酸或核糖核苷酸)所形成的链状分子。核酸包括但不限 于DNA或RNA病毒的基因组或其部分；细菌基因组或其部分； 真菌、植物或动物基因组或其部分；信使RNA(mRNA)、核糖体 RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、质粒DNA、线粒体DNA或合 成DNA或RNA。核酸可为线状(如mRNA)、环状(如质粒)或分 支状；且亦可为双链或单链形式。

在此处“核苷酸”(nucleotide)为核酸的次单元，且是由杂 环碱基(heterocyclic base)、糖类(sugar)与一或多个磷酸基 (phosphate group)所组成的化合物。最常见的核苷酸是以嘌呤 (purine)或嘧啶(pyrimidine)的衍生物作为碱基，而糖类则是五碳 脱氧核糖(pentose deoxyribose)或五碳核糖(pentose ribose)。常 见的嘌呤有腺嘌呤(adenine，A)与鸟嘌呤(guanine，G)；而常见 的嘧啶有胞嘧啶(cytosine，C)、胸腺嘧啶(thymine，T)与尿嘧啶 (uracil，U)。

此处所述的核酸“序列”(sequence)系指组成一核酸的核 苷酸的排序。在本说明书中，核酸具有一5′端与一3′端；除非 另有说明，单链核苷酸序列的左手端为5′端；而右手端为3′端。 “下游”(downstream)一词指位于所述核苷酸序列的3′方向的 一核苷酸序列；而“上游”(upstream)一词则是指位于所述核苷 酸序列的5′方向的一核苷酸序列。

在此处，“变异”(variant)一词指一参考(reference)核酸分 子的一或多个核苷酸发生了改变；上述的改变包含一或更多个 新核苷酸的插入、一或更多个核苷酸的缺失或一或更多个既有 核苷酸的置换。广义来说，“核苷酸变异”一词在此包含了点 突变、多点突变、单核苷酸多态性(single nucleotide  polymorphism，SNP)、缺失、插入与转位(translocation)。

“参考核酸”一词在此指一核苷酸的序列为感兴趣的已知 参考序列。上述参考序列可为一“野生型”(或称“非突变”或 “正常”)序列，其选定区域中不带有突变。或者是，参考序列 可为一突变序列。本发明所属技术领域中具有通常知识者当可 想见，当参考核酸的选定区域内包含野生型序列时，所述的变 异样本核酸可为任何突变序列。或者是，当参考核酸的选定区 域内具有已知的突变序列时，所述变异样本核酸可为野生型序 列或任何其它突变序列。在参考核酸为双链形式的情形中，编 码链(coding strand)与模板链(template strand)任一者的序列皆 可作为参考序列。

在此处“样本核酸”指欲用以探究其“选定区域”中是否 有一或多核苷酸变异的一核苷酸序列。在样本核酸为双链DNA 的情形中，其包含了编码链以及与编码链互补的模板，其中编 码链的序列是由5’到3’的方向排列，而模板链的序列是由3’到 5’的方向排列。在本说明书中，“变异样本核酸”的选定区域 中有至少一核苷酸变异，所述变异是相较于参考序列的选定区 域而言。在此处，样本核酸的选定区域的序列与参考核酸的选 定区域的序列相同时，此样本核酸亦称为“非变异样本核酸”。

“引物”一词在此指一单链核苷酸序列，当引物处于适当 的环境(如具有适当缓冲液、盐类、温度和/或pH值)下且环境 中存有核苷酸以及用于核酸聚合的成分(如，DNA聚合酶 (DNA-dependent polymerase)或RNA聚合酶RNA-dependent  polymerase)时，引物能够作为一引物延长产物的合成起始点。 一般来说，引物的序列实质上与欲复制的核酸链互补；或该引 物至少包含一区域与欲复制的核酸链具有足够的互补性而能够 进行退火，并由该引物处开始进行5′到3′方向的链延长。上述 引物可为DNA引物、RNA引物或一嵌合型(chimeric)DNA/RNA 引物。在多数但非必要的情形下，引物为短的合成核酸，长度 通常为约12–100个核苷酸；较佳为约30–60个核苷酸。

“杂合”(hybridization)与“退火”(annealing)等词在此可 交替使用，且指具有足够互补性的二条核苷酸序列经由华森- 克李克(Watson-Crick)碱基配对或其它非正规的配对而形成了 复合物(complex)或杂合体(hybrid)。杂合作用可能发生在两条 DNA之间、两条RNA之间或一条DNA与一条RNA之间。杂 合作用会在分子生物相关领域中公知的多种适当条件(如温度、 pH值、盐类浓度等)下发生。

在此处，“扩增”(amplification)一词指能够增加样本中特 定核苷酸序列含量的方法或过程。聚合酶链反应(PCR)是相关领 域熟知的扩增反应，下文将进一步详述此处所用的PCR过程。 在此处，“反应混合物”(reaction mixture)与“混合 物”(mixture)等词可交替使用，并用以指称可用于后续聚合酶 链反应中的组成物。

“优先扩增变异样本核酸”在此指促进变异样本核酸的扩 增并阻碍非变异核酸的扩增。当可理解，根据本发明的原理与 精神，当反应混合物中同时存有变异与非变异样本核酸时，这 两种样本核酸都会在自我竞争型引物的作用下被扩增。然而， 基于此处创新的引物设计，变异样本核酸的扩增效率会远高于 非变异样本核酸的扩增效率。因此，即便当反应混合物中，变 异样本核酸的含量相较于非变异样本核酸的含量仅占了一小部 分时，本发明所提供的引物与方法仍能够正确地将变异样本核 酸扩增至可侦测的含量。

为了提供一种可用以优先扩增(且因而能够侦测)在选定区 域中具有一或多核苷酸变异的样本核酸的方法，此处设计了一 种自我竞争型引物，其具有两个功能域(即，一5’-竞争域以及 一3’-延长域)能够分别结合至样本核酸上不同但互相重迭的区 域。下文提供了关于此自我竞争型引物与相关方法的详细信息。

(I)自我竞争型引物

参照图1A至图1C来说明此处提出的引物设计方案，以利 了解本发明的内容。必须了解，图1A至图1C中所示的序列是 为了说明本发明且仅为例示；因此申请专利范围不受这些序列 的限制。

图1A所例示的参考核酸200包含人类大鼠肉瘤病毒癌基因 同源物(v-Ki-ras2Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog， 简称KRAS)基因外显子1的第1至第40个核苷酸。此参考核酸 200的编码股与模板股序列分别为 5’-ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCG -3’(SEQ ID NO:3)以及3’-TACTGACTTATATTTGAACAC CATCAACCTCGACCACCGC-5’(SEQ ID NO:4)。基于讨论的目 的，下文的说明中选用模板股的序列作为参考核酸200的序列。 在本说明书的脉络中，在参考核酸200中选定了一个区域，以 探究此选定区域215中是否带有或不带有一或多核苷酸变异。 在本实施例中，参考核酸200(模板链)中的选定区域215的序列 为3’-TCGACCACC-5’(SEQ ID NO:5，即KRAS外显子1的第 30至38个核苷酸，图1A中以粗体底线标记)。

理论上，欲探究的选定区域的核苷酸长度并无特殊限制。 根据本发明的非必要实施方式，选定区域最多可带有20个核苷 酸。举例来说，选定区域的长度可为约1、5、10、15或20个 核苷酸。

为了要提供能够侦测选定区域中核苷酸变异的方法，所设 计的自我竞争型引物具有两种功能域，分别杂合至参考核酸上 不同但重迭的区域。下文进一步详述此自我竞争型引物。

此处提出的自我竞争型引物包含一5’-竞争域以及一3’-延 长域，两者分别和参考核酸的第一区域与第二区域互补。上述 3’-延长域可作为正向引物，而能够在以PCR为基础的样本核酸 扩增过程中优先扩增具有核苷酸变异的样本核酸(即，变异样本 核酸)，所述的优先扩增指相对于不具有核苷酸变异的样本核酸 (即，非变异样本核酸)而言。

上述第一区域包含选定区域与紧接在参考核酸的选定区域 下游的至少一核苷酸残基，而使得在适当的杂合环境下，5’-竞 争域可和选定区域以及至少一相邻核苷酸杂合。可任选地，上 述紧接在选定区域下游的核苷酸残基可为至少1至20个核苷酸 残基。在另一可任选的实施例中，上述第一区域可更包含紧接 在选定区域上游的至少一核苷酸残基。同样可任选地，上述核 苷酸残基紧接在选定区域上游的核苷酸残基可为至少1至20个 核苷酸残基。根据本发明某些实施例，上述5’-竞争域的长度可 为15-40个核苷酸。

图1A例示的自我竞争型引物100的5’-竞争域110的序列 为GGTAGTTGGAGCTGGTGGCG(SEQ ID NO:1，对应于野生型 KRAS外显子1的第21至38个核苷酸，本说明书与图式中分 别以斜体以及粗体加底线标记其选定区域115图1A)。此5’-竞 争域110的序列与参考核酸200的第一区域210的序列互补， 其中上述第一区域210包含参考核酸200的模板链的选定区域 215、9个下游核苷酸以及两个上游核苷酸。

第二区域位于选定区域的下游。更明确地说，第二区域的 3’端位于选定区域的5’端的下游至少一核苷酸处，且因此，第 二区域不会涵盖参考核酸的选定区域。在可任选的实施例中， 第二区域的3’端位于选定区域的5’端下游至少1至20个核苷 酸处。根据本发明某些实施例，上述3’-延长域的长度可为15–40 个核苷酸。

此外，上述第一区域与第二区域彼此应有至少一个核苷酸 重迭，藉以促进变异样本核酸的优先扩增。如此一来，上述3’- 延长域与5’-竞争域在适当的杂合环境下，会相互竞争重迭的一 或多个核苷酸，以求与样本核酸杂合。在某些可任选的实施例 中，上述第一区域与第二区域彼此有1–38个核苷酸的重迭。

如图1A所示，例示性3’-延长域120的序列为 GAATATAAACTTGTGGTAGTTGG(SEQ ID NO:2，对应于野生 型KRAS外显子1的第7至29个核苷酸)，此序列与参考核酸 200的第二区域220互补。具体来说，上述第二区域220包含 紧接在参考核酸200的模板链的选定区域215下游的23个连续 的核苷酸残基。在本例示中，3’-延长域120由5’端起算的最后 9个核苷酸与5’-竞争域110由5’端起算的前9个核苷酸相同。

根据本发明多种实施例，可透过常见的3’-5’链接或较少见 的5’-5’链接将5’-竞争域和3’-延长域连接在一起。图1A所例 示的5’-竞争域110和3’-延长域120是透过3’-5’链接来连接。

根据可任选的实施例，5’-竞争域直接连接至3’-延长域。 或者是，可在5’-竞争域和3’-延长域之间引入一连接链。上述 连接链可为核苷链或非核苷链。核苷链由一或多个核苷酸(如A、 T、C、G或U，或其它较不常见的核苷酸)所组成。非核苷链的 非限制性实施例可为肽、碳水化合物、脂类、脂肪酸、C2–C18 烷基链、磷酸根、磷酸酯、亚磷酰胺(如间隔物亚磷酰胺9、间 隔物亚磷酰胺18、间隔物亚磷酰胺C3、间隔物C12CE亚磷酰 胺与吡咯啶-CE亚磷酰胺)、聚乙二醇链、乙二醇链、侧链烷基 链、丙三醇或杂环基团。图1A所示的自我竞争型引物100使用 非核苷链的C3间隔物130来连接5’-竞争域110的3’端以及3’- 延长域120的5’端。

根据某些实施例，所述的自我竞争型引物可为非嵌合型引 物，此时其5’-竞争域、3’-延长域以及核苷链(若有的话)皆为脱 氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列。譬如，图1A所示的自我 竞争型引物100即为非嵌合型引物，其5’-竞争域和3’-延长域 接由DNA碱基所组成，且不含核苷链。

在某些替代性实施例中，自我竞争型引物可为嵌合型引物， 其中5’-竞争域、3’-延长域与及核苷链(若有的话)其中之一的核 苷酸序列类型和其它部分不同。作为例示而非限制，嵌合型自 我竞争型引物可以是以下任一种形式：DNA型5’-竞争域直接 连接至RNA型3’-延长域、DNA型5’-竞争域透过非核苷链或 核苷链而间接连接至RNA型3’-延长域、RNA型5’-竞争域直接 连接至DNA型3’-延长域、RNA型5’-竞争域透过非核苷链或 核苷链而间接连接至DNA型3’-延长域、DNA型5’-竞争域透 过RNA链间接连接至DNA型3’-延长域、RNA型5’-竞争域透 过DNA链间接连接至RNA型3’-延长域等等。

当可理解，本发明提出的自我竞争型引物经设计而使得链 延长(即，在新的DNA链上加入核苷酸)只会由3’-延长域的3’ 端开始，而利用5’-竞争域作为起始点的链延长反应会受到抑 制。对于透过传统3’-5’链接而连接在一起的5’-竞争域和3’-延 长域来说，不会发生以5’-竞争域为链延长始点的延长反应，因 为5’-竞争域最后一个核苷酸的3’-羟基已被占据。

此外，采用上述嵌合型自我竞争型引物亦可有效率地防止 由5’-竞争域起始的延长反应。已知可根据模板序列的类型将聚 合酶区分为DNA聚合酶或RNA聚合酶。因此，对于嵌合型自 我竞争型引物，可依据3’-延长域的类型来选择聚合酶的种类， 藉以达到抑制5’-竞争域延长的目的。举例来说，若5’-竞争域 由RNA碱基所组成，而3’-延长域是由DNA碱基组成，那么 DNA聚合酶只会从3’-延长域的3’端起始链延长。相似地，若 嵌合型自我竞争型引物的5’-竞争域由DNA碱基组成，而3’- 延长域是由RNA碱基组成，则可使用RNA聚合酶以起始由3’- 延长域开始的链延长过程。

还有另一种例示性的方法是在自我竞争型引物中使用较不 常见的5’-5’链接来连接5’-竞争域与3’-延长域。在此种情形中， 若自我竞争型引物为非嵌合型引物，则应对5’-竞争域的3’端进 行修饰，以防止由该处开始的链延长。至于嵌合型的自我竞争 型引物，则不一定要在5’-竞争域的3’端进行此类修饰。可利用 非核苷阻断物(blocker)来修饰5’-竞争域的3’端；上述非核苷阻 断物譬如磷酸基或磷酸酯。譬如由3’-间隔物C3可控孔径玻璃 (C3controlled-pore glass，简称C3-CPG)形成的3’-丙基磷酸酯 (3’-propyl phosphate)就是一种很有效的3’端非核苷阻断物。将 5’-竞争域于3’位置上的最后一个核苷酸形成反向的3’-3’链接， 也能够有效地防制聚合酶将核苷酸延长，因为在其3’位置上没 有可用的羟基可供起始合成反应。

另一种避免聚合酶在5’-竞争域的3’端进行延长的方法是 利用核苷阻断物(nucleosidic blocker)，2’,3’-二脱氧核苷(如 2’,3’-ddC-CPG)或3’脱氧核苷(如3’-dA-CPG、3’-dC-CPG、 3’-dG-CPG或3’-dT-CPG)。当然，亦可采用可用以修饰抑制引 物3’端的其它等效技术，而这些其它技术亦属于本发明的范围。

下文实验例中，基于以上的引物设计方案针对人类上皮细 胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor，简称EGFR) 基因提出了另一种例示的自我竞争型引物。自我竞争型引物包 含了5’-竞争域，其序列为ACCGTGCAGCTCATCACGCAG(SEQ ID NO:8)；C3间隔物；以及3’-延长域，其序列为 CTCACCTCCACCGTGCA(SEQ ID NO:9)。

(II)用以相较于非变异样本核酸而优先扩增变异样本核酸 的方法

在详细介绍了此处提出的引物设计方案以及例示的自我竞 争型引物之后，接着说明利用此种自我竞争型引物的PCR式的 优先扩增方法。

本发明所属技术领域中具有通常知识者当可理解，用于扩 增的生物样本可能同时包含一特定目标基因的野生型序列与突 变。譬如，在取自生物体组织(如肿瘤或其它疾病的病灶)的样 本中，可能含有某些突变细胞。在此种情形中，突变序列(相较 于野生型序列)可能仅占了一小部分，而多数传统PCR方法无法 正确地将突变序列扩增到可用于后续测序或其它定性分析的程 度。本发明的新颖特征之一在于此处提出的自我竞争型引物可 允许变异样本核酸(如生物样本中的突变序列)相较于非变异样 本核酸(如同一生物样本中的野生型序列)的优先扩增，而使得 变异样本核酸扩增后的量足以进行测序或侦测。此一特性在如 肿瘤治疗之类的领域特别有用，因为癌细胞的遗传组成通常可 用来预测或指示疾病的进程和/或适当的治疗方案。此外，在适 当的反应条件下，使用本方法所得到的扩增产物其选定区域中 的序列和样本核酸相同，不会发生错误扩增的情形。

根据本发明的一个实施例，上述用以相较于非变异样本核 酸而优先扩增变异样本核酸的PCR式方法包含扩增步骤；此步 骤利用根据本发明上述实施方式/实施例的自我竞争型引物(例 如，但不限于自我竞争型引物100)来扩增样本核酸。具体来说， 此一扩增步骤包含制备包含该自我竞争型引物与样本核酸的反 应混合物，以及将此一反应混合物置于一PCR扩增条件下。一 般来说，样本核酸的选定区域中可能具有或不具有一核苷酸变 异(相较于参考核酸)。根据本发明的原理与精神，此方法适用 于变异序列已知或未知的情形下。举例来说，上述样本可能含 有图1B所例示的非变异样本核酸300以及图1C所例示的变异 样本核酸300’。非变异样本核酸300的第一区域310(包含选定 区域315)和第二区域320的序列皆与图1A所示的参考核酸200 的第一区域210(包含选定区域215)和第二区域220相同。变异 样本核酸300’的选定区域315’相较于参考核酸200的选定区域 215有一个核苷酸的变异(图1C中同时以粗体、底线与斜体标 记)，因此变异样本核酸300’的第一区域310’序列与参考核酸 200的第一区域210和非变异样本核酸300的第一区域310不 完全相同；但变异样本核酸300’的第二区域320则和参考核酸 200的第二区域220以及非变异样本核酸300的第二区域320 完全相同。

本发明所属技术领域中具有通常知识者当可理解，反应混 合物中可更包含其它扩增反应试剂。这些用于PCR的扩增反应 试剂可包含，但不限于：缓冲剂(buffers)；反应试剂(reagents)； 具有反转录酶(reverse transcriptase)活性、聚合酶(polymerase) 和/或外切酶(exonuclease)活性的酶；酶辅助因子(enzyme cofactors)，如镁或锰；盐类；以及脱氧三磷酸核苷 (deoxyribonucleotide triphosphates，简称dNTPs)，如脱氧三磷 酸腺苷(deoxyadenosine triphosphate，简称dATP)、脱氧三磷酸 鸟苷(deoxyguanosine triphosphate，简称dGTP)、脱氧三磷酸胞 苷(deoxycytidine triphosphate，简称dCTP)、脱氧三磷酸胸苷 (deoxythymidine triphosphate，简称dTTP)及脱氧三磷酸尿苷 (deoxyuridine triphosphate，简称dUTP)。本领域普通技术人员 可依据所用的PCR方法来选择适当的扩增反应试剂。

之后对反应混合物进行PCR处理；此处理依序包含变性步 骤、退火步骤与延长步骤；兹分述如下。

在变性步骤中，将由模板链与密码链形成的双链DNA(DNA duplex)变性(即，熔化)。双链DNA确切的变性过程取决于其大 小、序列与分子组成(主要是G-C键合相对于A-T键合的比例或 G-C%)。在适当的温度下，双链DNA通常会在一秒内就变性， 上述温度约介于80℃(一般为G-C%较低且较小的分子)至约95 ℃(一般为较大的分子，如人类基因组DNA)之间；在某些情形 中，变性温度可能更低。

在变性步骤之后，将反应混合物冷却至退火温度，而使得 自我竞争型引物的5’-竞争域与3’-延长域能够彼此竞争与样本 核酸的一链(在图1A至1C所示的实施例中为模板链)退火的机 会。本领域具有通常知识者当可理解，互相杂合的两序列不必 然需要完全互补。请同时参见图1B与1C，此时5’-竞争域110 不但可和非变异样本核酸300的模板链杂合，也会和变异样本 核酸300’的模板链杂合。然而，相较于由5’-竞争域110和非变 异样本核酸300所形成的杂合体，由5’-竞争域110和变异样本 核酸300’所形成杂合体较不稳定；因此由5’-竞争域110和变异 样本核酸300’所形成的杂合体较易变性，因而使得3’-延长域 120有较高的机会黏合至变异样本核酸300’(相较于3’-延长域 120黏合至非变异样本核酸300的机会)。因而，在后续的延长 步骤中，会促进变异样本核酸300’的扩增，并减少非变异样本 核酸300的扩增。在同一个反应系统中，变异样本核酸序列300’ 的扩增效率提升，再加上非变异样本核酸序列300的扩增效率 降低，导致了变异样本核酸序列300’的优先扩增。

在非必要的实施例中，上述退火步骤可包含两个阶段，其 中第一阶段所用的退火温度高于第二阶段所用的退火温度。

在退火步骤之后，将温度调整到延长温度，以使得核苷酸 能够延长。理想的延长温度为本领域所熟知；一般来说，延长 温度约为70-80℃。然而，在考虑相关因素(如所用的聚合酶种 类)后，亦可采用其它温度。

之后使反应混合物在变性、退火与延长等步骤间循环，以 持续扩增样本核酸(包含变异与非变异样本核酸)。此处提出的 PCR处理可运用于任何已知的PCR热循环装置(thermocycler) 及其均等物。此外，此处提出的PCR式方法兼容于大多数的既 有PCR处理。因而，能够将本方法运用于各种PCR技术，包括 但不限于非对称聚合酶链反应(asymmetric PCR)、热启动聚合酶 链反应(hot start PCR)、迷你引物聚合酶链反应(miniprimer  PCR)、多引物聚合酶链反应(multiplex-PCR)、巢式聚合酶链反 应(nested PCR)，实时定量PCR聚合酶链反应(RT-PCR)、反转 录聚合酶链反应(reverse transcription PCR)、固相聚合酶链反应 (solid phase PCR)与递减聚合酶链反应(touchdown PCR)。

举例来说，本说明书一实验例中所用的循环条件包括：于 约95℃下变性约10分，而后进行45个循环的变性(约94℃、 约60秒)、退火(约60℃、约60秒)与延长(约72℃、约60秒)， 其后在约72℃下进行约10分钟的最终延长步骤。在另一实验 例中(数据未显示)所用的循环条件包括：于约95℃下变性约10 分，而后进行45个循环的变性(约94℃、约60秒)、第一退火(约 65℃、约180秒)、第二退火(约57℃、约60秒)与延长(约72 ℃、约60秒)，其后在约72℃下进行约10分钟的最终延长步骤。

本发明的又一个方面是关于一种PCR式的方法，其可用以 决定相较于一参考核酸的选定区域，一样本核酸的选定区域中 是否具有一核苷酸变异。

根据本发明一实施例，上述包含一扩增步骤与一侦测步骤。 在所述的扩增步骤中，根据上文所述的方法，利用自我竞争型 引物进行变异样本核酸的优先扩增。之后，在侦测步骤中，决 定样本核酸的选定区域中是否具有或不具有核苷酸变异。

举例来说，可对扩增步骤中得到的PCR产物进行测序，以 确认样本中样本核酸的序列。

下文举出多种实施例来阐明本发明的部分实施方式，以使 本发明所属技术领域中具有通常知识者能藉以实践本发明。因 此不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。本发明所属技 术领域中具有通常知识者基于此处提的说明，当可在不需过度 推衍的情形下运用本发明。此处提及的所有文献，皆视为已完 全引用而成为本说明书的一部份。

<实验例I>

变异KRAS基因片段的优先扩增

由马偕医院(中国台湾)取得总计153个临床样本，样本系 采集自癌症患者的病灶，样本采集均取得患者的告知后同意。 处理样本以分离其中的核酸分子。在初期实验中，进行PCR式 优先扩增所用的试剂如下：PCR2X Master Mix缓冲液(JMR)10 μl、0.2μM自我竞争型引物(5’-竞争域：SEQ ID NO:1；连接链： C3间隔物；3’-延长域：SEQ ID NO:2)、0.2μM反向引物 (CCTCTATTGTTGGATCATA；SEQ ID NO:6)、DNA样本100ng， 加水使最终体积为20μl。此外，利用传统PCR正向引物 (AGGCCTGCTGAAAATGACTG；SEQ ID NO:7)，在相同的条件 下进行传统PCR。利用ABI9700PCR设备进行优先扩增或传统 PCR，反应中所用的循环条件为：变性温度95℃持续10分钟； 之后温度循环为94℃(60秒)、60℃(60秒)与72℃(60秒)，进行 45个循环；最后在72℃(10分钟)下进行延长。

在PCR完成后，自PCR槽中取出一样本，并在琼脂糖凝胶 上进行电泳分离。样本与对照标记皆以溴化乙锭(ethidium bromide，EtBr)染色并以荧光侦测显影，同时以电荷耦合组件相 机撷取影像。将琼脂糖凝胶上的产物带切下，并测序其中所含 的核酸，已决定样本是否含有突变的变异株。测序结果显示利 用此处提出的PCR式优先扩增方法能够优先扩增总计12种位 于KRAS基因选定区域内(外显子1第30–38个核苷酸残基)的 突变株，且因而使得这些突变株可被侦测；表一摘要整理了这 些突变株的突变序列与突变位置。野生型KRAS基因片段包含 SEQ ID NO:3所示的编码序列(即KRAS基因外显子1的第1 至40个核苷酸)。

表一

突变株编号 核苷酸位置 突变核苷酸 1 30 A>T 2 31 G>A 3 31 G>C 4 34 G>A 5 34 G>T 6 34 G>C 7 35 G>A

8 35 G>T 9 35 G>C 10 37 G>A 11 37 G>T 12 38 G>A

表二摘要整理了传统PCR扩增以及本发明提出的优先扩增 的结果。当可理解表二中所述的KRAS突变样本可能同时含有 KRAS突变序列KRAS与野生型序列或仅含有KRAS突变序列， 而KRAS野生型样本则仅含有KRAS野生型序列。

直接测序的结果显示，在69个经优先扩增后确认含KRAS 突变序列的样本中，传统PCR扩增只能侦测到其中54个；而 有99个经传统PCR扩增后认定为KRAS野生型的样本中，有 15个经优先扩增与直接测序后确认为KRAS突变型样本。由这 些结果推算出传统PCR侦测KRAS突变的假阳性比率为约 15%，且其侦测敏感度为约78%。相较之下，经此处提出的优 先扩增后，能够正确地侦测出所有KRAS突变与野生型样本(假 阳性：0%；假阴性：0%；敏感度：100%)。由此实验例可以得 知，本发明提出的优先扩增能够用以侦测样本(如临床样本)中 的变异序列。

表二

分别纯化含有KRAS突变与野生型序列的质粒DNA，并制 备成原液(最终浓度每微升(μl)10⁵拷贝)。将含有KRAS突变序 列的原液以10的倍数依序稀释为10²–10⁵份/μl，接着分别将1μl 的稀释后原液和9μl的KRAS野生型原液(10⁵份/μl)混合后作为 优先扩增的DNA样本，并根据上文所述的方式进行优先扩增。 图2的照片呈现了表一所示的KRAS突变株4、12的电泳结果。

如图2所示，此处提出的优先扩增方法能够分别扩增纯 KRAS野生型样本以及纯KRAS突变株样本。图2中，左方起 算第一与第二条带分别为分子标记与负对照组(未添加核酸样 本)。当可注意到，在图2中，纯KRAS突变株样本(左方起算 第4、5条带)的强度比纯KRAS野生型样本(左方起算第3条带) 的强度来得高。这些结果证实了此处提出的方法可相对于非变 异样本核酸(如，此处的KRAS野生型样本)而优先扩增变异样 本核酸(如，此处的KRAS突变株4、12)。

在含有KRAS野生型序列与一KRAS突变序列(突变株4或 12)的混合物中，本方法同样会相对于KRAS野生型序列而优先 扩增KRAS突变株序列，而使得KRAS突变序列被扩增到足以 用于后续直接定量的程度。在图2中可以观察到，随着反应混 合物中KRAS突变序列浓度逐渐增加，产物带的强度也随之变 强(参见左方起算第6–9与10–13条带)。由于在这些样本中非 变异样本核酸(即，KRAS野生型序列)的浓度是固定的，可以推 论出强度的增加应该是变异样本核酸(在本实验例中为KRAS突 变序列)的优先扩增所造成的。

<实验例II>

变异EGFR基因片段的优先扩增

由马偕医院(中国台湾)取得总计179个临床样本，样本系 采集自癌症患者的病灶，样本采集均经过患者的告知后同意。 处理样本以分离其中的核酸分子。在初期实验中，进行PCR式 优先扩增所用的试剂如下：PCR2X Master Mix缓冲液(JMR)10 μl、0.2μM自我竞争型引物(5’-竞争域：SEQ ID NO:8；连接链： C3间隔物；3’-延长域：SEQ ID NO:9)、0.2μM反向引物 (CAAACTCTTGCTATCCCAGGAG；SEQ ID NO:13)、DNA样本 100ng，加水使最终体积为20μl。此外，利用传统PCR正向引 物(GAAACTCAAGATCGCATTCATG；SEQ ID NO:14)，在相同 的条件下进行传统PCR。反应中所用的循环条件与上文实验例 I所述相同。

于本实验例中，野生型EGFR基因片段(即，EGFR基因的 第2344至2373个核苷酸)包含SEQ ID NO: 10(5’-CTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAG-3’；编码链) 所示的序列，以及SEQ ID NO: 11(3’-GAGTGGAGGTGGCACGTCGAGTAGTGCGTC-5’；模板链) 所示的序列，其中EGFR基因片段的选定区域(第2361–2370个 核苷酸残基)的序列为3’-CGAGTAGTGC-5’(SEQ ID NO:12)。

在PCR反应完成后，根据上文实验例I所述的方法来处理 扩增产物，测序结果显示利用此处提出的PCR式优先扩增方法 能够优先扩增总计5种位于EGFR基因选定区域内(第 2361–2370个核苷酸残基)的突变株，且因而使得这些EGFR突 变株可被侦测；表三摘要整理了这些EGFR突变株的突变序列 与突变位置。

表三

核苷酸位置 突变核苷酸 2361 G>A 2364 C>T 2367 C>T 2369 C>T 2370 G>A

表四摘要整理了传统PCR扩增以及本发明提出的优先扩增 的结果。当可理解表四中所述的EGFR突变样本可能同时含有

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EGFR突变序列与EGFR野生型序列或仅含有EGFR突变序列， 而野生型样本则仅含有EGFR野生型序列。

直接测序的结果显示，在85个经优先扩增后确认含EGFR 突变序列的样本中，传统PCR扩增只能侦测到其中60个；而 有119个经传统PCR扩增后认定为EGFR野生型的样本中，有 25个经优先扩增与直接测序后确认为EGFR突变型样本。由这 些结果推算出传统PCR侦测EGFR突变的假阳性比率为约21%， 且其侦测敏感度为约66%。相较之下，经此处提出的优先扩增 后，能够正确地侦测出所有EGFR突变与野生型样本(假阳性： 0%；假阴性：0%；敏感度：100%)。由此实验例可以得知，本 发明提出的优先扩增能够用以侦测样本(如临床样本)中的变异 序列。

表四

由上述说明与实验结果可以得知，本发明提出了一种新颖 的自我竞争型引物，此种引物可以让一样本中的野生型与突变 型序列同时进行扩增。此特性的优点之一在于取自病灶或疾病 部位的样本通常同时含有野生型与突变序列，且前者的量通常 远高于后者，但本发明仍可正确地扩增其中的突变序列。譬如， 上文实验例I与实验例II中所用的部分样本系取自癌症患者的 病灶，而这些样本中所含的突变序列非常少(相较于野生型序 列)。在此种情形下，传统PCR通常无法将突变序列扩增到足供 后续测序或以其他方法定性的程度。然而，以上的实验结果显 示，当传统PCR无法正确侦测到所有突变样本时，本发明提出 的优先扩增方法提供了一个无假阳性、无假阴性且敏感度为 100%的侦测方法。本发明的另一优点在于所述的优先扩增与侦 测方法非常灵敏，其侦测极限优于先前技术。

此外，由于3’-延长域并未与选定区域相重迭，可将错误扩 增(即复制产物中选定区域的序列与样本核酸的原始序列不同) 的机率降至最低甚或是零。在于需要目标基因或基因片段的确 实序列(或表现型)的情形中，此种特征尤显重要，因为出现错 误扩增的扩增产物时，会影响分析的可靠度，且会使得后续的 测序分析失去意义。举例来说，在进行标靶疗法时，通常会基 于患者的目标基因或其片段的实际序列来决定治疗方式，若是 因为错误扩增而使得扩增产物的序列无法呈现该患者的真实基 因序列，可能会影响后续治疗的效果。

虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并 非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者， 在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更 动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随权利要求范围所界 定者为准。