一种改性微载体、其制备方法及功能性微载体

摘要

本发明提供了一种改性微载体，由微载体经改性剂改性得到；所述微载体为聚乳酸和/或聚乳酸-羟基乙酸共聚物；所述改性剂为含有儿茶酚的物质。本发明通过含有儿茶酚基团的物质对聚乳酸(PLA)和/或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)进行改性，在PLA和/或PLGA的表面形成聚多巴胺层，使PLA和/或PLGA的亲水性得到了明显的改善，提高了细胞的粘附量。本发明还提供了一种改性微载体的制备方法，本发明提供的制备方法简单、高效。本发明还提供了一种功能性微载体，本发明提供的功能性微载体上的活性物质可对细胞进行定向诱导，获得具有功能化的细胞，能够直接应用于组织修复。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种改性微载体、其制备方法及功 能性微载体。

背景技术

微载体培养技术是将细胞接种于微载体上，在动态立体培养环境下实现 对细胞的快速大量高质量的扩增，以便于获得组织工程及干细胞治疗所需要 的足够数量的细胞。

常用微载体分为可降解(如聚乳酸、明胶等)和不可降解微载体(如塑 料、玻璃等)。以不可降解材料(如玻璃，聚苯乙烯等)制备的微载体，虽 然可以用于细胞大规模扩增，但其生物相容性差以及不能直接用于机体内制 约了其更广泛的应用。可降解微载体与不可降解微载体相比，不仅可以应用 于细胞立体培养，大量扩增细胞，与此同时，可以将细胞/微载体复合物直接 应用于组织工程修复，在保证足够种子细胞数量的同时，避免了消化收集细 胞等过程，使种子细胞的应用更加有效和用途多。

而常见可降解微载体(如胶原)虽然具有良好的生物相容性及细胞粘附 效果，但胶原降解时间较短，不能长期维持细胞生长，而且由于胶原来源于 动物体内，胶原本身具有较高的免疫原性，增加了一些人畜共患传染病的患 病几率。

聚乳酸(PLA)或聚丙交酯－乙交酯(PLGA)是一种新型的可降解微载 体，它具有免疫原性低，生物相容性好、降解时间长等特点，已被美国FDA 许可应用于体内植入，被制备成支架、微球等微载体广泛应用于组织修复工 程和载药研究。通过O/W溶剂蒸发法制备的微载体，具有生物相容性好，降 解可控等优点，可制备成微载体用于细胞体外扩增，获得的细胞/微载体复合 材料更可直接应用于体内组织工程修复。但是，PLA或PLGA的疏水性不利于 细胞粘附，严重影响了其在制备微载体中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改性微载体、其制备方法及功能性微载体， 本发明提供的改性微载体亲水性好，提高了细胞的粘附量。

本发明提供一种改性微载体，由微载体经改性剂改性得到；

所述微载体的材质为聚乳酸和/或聚乳酸-羟基乙酸共聚物；

所述改性剂为含有儿茶酚的物质。

优选的，所述改性剂为多巴胺。

优选的，所述微载体的粒径为100～450μm。

优选的，所述微载体与所述改性剂的质量比为(2～2000):1。

本发明提供一种改性微载体的制备方法，包括以下步骤：

A)提供微载体，所述微载体的材质为聚乳酸和/或聚乳酸-羟基乙酸共聚 物；

B)将所述步骤A)中的微载体与多巴胺溶液混合，进行改性反应，得到 改性微载体。

优选的，所述改性反应的pH值为7.0～9.0。

优选的，所述改性反应的时间为1～24小时。

本发明提供一种功能性微载体，包括：改性微载体和负载在所述改性微 载体上的活性物质；

所述改性微载体为权利要求1～4任意一项所述的改性微载体或权利要求 5～7任意一项所述的制备方法得到的改性微载体。

优选的，所述活性物质包括生长因子、蛋白多肽和无机粒子中的一种或 几种。

优选的，所述改性微载体与活性物质的质量比为(2～2000):1。

本发明提供了一种改性微载体，由微载体经改性剂改性得到；所述微载 体的材质为聚乳酸和/或聚乳酸-羟基乙酸共聚物；所述改性剂为含有儿茶酚的 物质。本发明通过含有儿茶酚基团的物质对材质为聚乳酸(PLA)和/或聚乳 酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的微载体进行改性，在微载体的表面形成聚多 巴胺层，使材质为PLA和/或PLGA的微载体的亲水性得到了明显的改善，提 高了细胞的粘附量。本发明还提供了一种改性微载体的制备方法，本发明提 供的制备方法简单、高效，避免了化学共价结合的复杂过程，及其可能导致 的微载体表面变性。

进一步的，使用本发明提供的改性微载体与活性物质制备得到功能性微 载体，本发明提供的功能性微载体上的活性物质可对细胞进行定向诱导，获 得具有功能化的细胞，能够直接应用于组织修复。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不 付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1得到的微载体和改性微载体外观对比图；

图2为本发明实施例1得到的微载体的傅里叶红外光谱图；

图3为本发明实施例1得到的改性微载体的傅里叶红外光谱图；

图4为本发明实施例1～2得到的微载体和改性微载体溶菌酶粘附量；

图5为本发明实施例3得到的微载体的扫描电镜图；

图6为本发明实施例3得到的微载体的红外衍射光谱图；

图7为本发明实施例3得到的改性微载体的扫描电镜图；

图8为本发明实施例3得到的改性微载体的红外衍射光谱图；

图9为本发明实施例2～7得到的微载体、改性微载体或功能性微载体对小 鼠脂肪间充质干细胞增殖的影响；

图10为本发明实施例2和实施例5得到的微载体、改性微载体或功能性微 载体对小鼠脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶表达的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种改性微载体，由微载体经改性剂改性得到；所述微载 体的材质为聚乳酸和/或聚乳酸-羟基乙酸共聚物；所述改性剂为含有儿茶酚的 物质。

本发明提供的改性微载体表面有聚多巴胺层，能够明显提高微载体的亲 水性，提高细胞的粘附量。

本发明提供的改性微载体由微载体经改性剂改性得到，所述微载体的材 质为聚乳酸(PLA)和/或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，优选为聚乳酸 或聚乳酸-羟基乙酸共聚物。在本发明中，所述微载体的粒径优选为 100～450μm，更优选为150～400μm，最优选为200～350μm；所述PLA的数均 分子量优选为10000～100000，更优选为50000～90000，最优选为80000；所述 PLGA的数均分子量优选为10000～100000，更优选为50000～90000，最优选 为80000。本发明对所述微载体的来源没有特殊的限制，在本发明中，所述微 载体优选按照以下步骤制备得到：

将PLA和/或PLGA、聚乙烯醇与有机溶剂混合，得到微载体。

本发明优选将PLA和/或PLGA与有机溶剂混合，得到混合溶液，将混合 溶液和聚乙烯醇(PVA)混合，得到微载体，更优选将所述PLA和/或PLGA 溶于所述有机溶剂中，得到混合溶液。为了使最终得到的微载体具备一定的 功能性，本发明优选将PLA和/或PLGA与具有诱导功能的活性物质混合后， 再与有机溶剂混合，得到混合溶液。如，具有成骨诱导作用的羟基磷灰石 (HA)。在本发明中，所述PLA和/或PLGA与所述具有诱导功能的活性物 质的质量比优选为(2～2000)：1，更优选为(20～1000)：1，最优选为(200～500)： 1；所述有机溶剂优选为卤代烃类有机溶剂，更优选为氯仿和/或二氯甲烷，最 优选为氯仿。本发明对所述PLA和PLGA的来源没有特殊的限制，可采用所 述PLA和PLGA的市售商品，也可按照本领域技术人员熟知的制备PLA和 PLGA的技术方案自行制备。本发明对所述具有诱导功能的活性物质的来源没 有特殊的限制，采用所述具有诱导功能的活性物质的市售商品即可。在本发 明中，所述混合溶液的浓度优选为1～10000ng/mL，更优选为10～1000ng/mL， 最优选为100ng/mL。

得到混合溶液后，本发明优选将所述混合溶液和聚乙烯醇(PVA)混合， 得到微载体。本发明优选将所述混合溶液与聚乙烯醇水溶液混合，得到微载 体。在本发明中，所述聚乙烯醇水溶液的质量浓度优选为0.5～2％，更优选为 0.8～1.8％，最优选为1～1.5％，所述聚乙烯醇水溶液的用量优选为50～200mL， 更优选为60～180mL，最优选为70～150mL。本发明对所述混合的方法没有特 殊的限制，本发明优选将所述混合溶液滴加到聚乙烯醇的水溶液中，并进行 搅拌，使所述混合溶液与聚乙烯醇水溶液的混合更加充分。在本发明中，所 述混合的时间优选为8～36小时，更优选为10～30小时，最优选为12～26小时。

得到微载体后，本发明优选将所述微载体进行第一洗涤，得到第一洗涤 后的微载体。在本发明中，所述第一洗涤的次数优选为1～6次，更优选为2～5 次，最优选为3～4次；所述第一洗涤所用的洗液优选为一次水。本发明对所 述第一洗涤的方法没有特殊的限制，本发明优选将所述微载体进行离心洗涤， 得到第一洗涤后的微载体。

完成所述洗涤后，本发明优选将得到的洗涤后的微载体进行第一干燥， 得到第一干燥的微载体。在本发明中，所述第一干燥的时间优选为36～60小 时，更优选为40～55小时，最优选为48～50小时；所述第一干燥的温度优选 为20～30℃，更优选为23～25℃。本发明优选将所述洗涤后的微载体进行真空 干燥，得到干燥的微载体。本发明对所述真空干燥的真空度没有特殊的限制， 采用本领域技术人员熟知的真空干燥的真空度即可。本发明对所述真空干燥 所用的设备没有特殊的限制，采用本领域技术人员常用的真空干燥设备即可。 如，可采用真空干燥箱。

本发明提供的改性微载体由微载体经改性剂改性得到，所述改性剂为含 有儿茶酚的物质，在本发明中，所述改性剂优选为多巴胺。在本发明中，所 述微载体与改性剂的质量比优选为(2～2000)：1，更优选为(20～200)：1， 最优选为100：1。

本发明还提供了一种改性微载体的制备方法，包括以下步骤：

A)提供微载体，所述微载体的材质为聚乳酸和/或聚乳酸-羟基乙酸共聚 物；

B)将所述步骤A)中的微载体与多巴胺溶液混合，进行改性反应，得到 改性微载体。

在本发明中，所述微载体的种类和来源与上述技术方案中所述的微载体 的种类和来源一致，在此不再赘述。

本发明将所述微载体与多巴胺溶液混合，进行改性反应，得到改性微载 体。本发明优选将多巴胺和Tris/HCL缓冲液混合，得到多巴胺溶液，将多巴 胺溶液与微载体混合，进行改性反应，得到改性微载体。在本发明中，所述 Tris/HCL缓冲液的摩尔浓度优选5～15mM，更优选为8～12mM，更优选为 10mM；所述Tris/HCL缓冲液的pH值优选为7～9，更优选为7.2～8.8，最优选 为8～8.5；所述多巴胺溶液的浓度优选为1～4mg/mL，更优选为1.5～3.5mg/mL， 最优选为2～3mg/mL。本发明对所述多巴胺与Tris/HCL缓冲液的混合方式没 有特殊的限制，本发明优选将所述多巴胺溶于Tris/HCL缓冲液中。

得到多巴胺溶液后，本发明优选将所述多巴胺溶液与所述微载体混合， 进行改性反应，得到改性微载体。在水溶液中，多巴胺的儿茶酚基团被氧化， 生成具有邻苯二醌结构的多巴胺醌化合物。多巴胺和多巴胺醌之间发生反歧 化反应，产生半醌自由基，然后偶合形成交联键，同时在所述微载体表面形 成紧密附着的聚多巴胺交联复合层。多巴胺的儿茶酚基团可以和有机、无机 表面建立共价和非共价的相互作用，从而使聚多巴胺交联层强力附着在所述 微载体的表面。在本发明中，所述改性反应的温度优选为20～30℃，更优选为 23～25℃；所述改性反应的时间优选为1～24小时，更优选为3～20小时，最优 选为5～15小时；所述改性反应的pH值优选为7～9，更优选为7.2～8.8，最优 选为8～8.5。本发明对所述多巴胺溶液和所述微载体的混合方式没有特殊的限 制，本发明优选将所述微载体浸没在所述多巴胺溶液中，实现多巴胺溶液和 微载体的混合。在本发明中，所述微载体和所述多巴胺的质量比优选为 (2～2000)：1，更优选为(20～200)：1，最优选为100：1。

得到改性微载体后，本发明优选将所述改性微载体进行第二洗涤，得到 第二洗涤后的改性微载体。在本发明中，所述第二洗涤的次数优选为1～6次， 更优选为2～5次，最优选为3～4次；所述第二洗涤所用的洗液优选为一次水。 本发明对所述第二洗涤的方法没有特殊的限制，本发明优选将所述微载体进 行离心洗涤，得到洗涤后的微载体。

本发明还提供了一种功能性微载体，包括：改性微载体和负载在所述改 性微载体上的活性物质；所述改性微载体为上述技术方案所述的改性微载体 或上述技术方案所述的制备方法得到的改性微载体。

本发明提供的功能性微载体包括改性微载体，所述改性微载体为上述技 术方案所述的改性微载体或上述技术方案所述的制备方法得到的改性微载 体，在此不再赘述。

本发明提供的功能性微载体包括负载在所述改性微载体上的活性物质， 所述活性物质优选为生长因子、蛋白多肽、亲核试剂和无机粒子中的一种或 几种，更优选为生长因子。具体的，在本发明的实施例中，可采用类胰岛素 一号增长因子(IGF-1)作为活性物质。在本发明中，所述改性微载体与活性 物质的质量比优选为(2～2000)：1，更优选为(20～1000)：1，最优选为 (200～500)：1。

在本发明中，所述功能性微载体优选按照以下步骤制备得到：

将改性微载体与活性物质混合，进行活性物质的负载，得到功能性微载 体。

本发明优选将改性微载体与活性物质溶液混合，进行活性物质的负载， 得到功能性微载体。本发明优选将所述活性物质与缓冲溶液混合，得到活性 物质溶液，将所述活性物质溶液与所述改性微载体混合，进行活性物质的负 载，得到功能性微载体。在本发明中，所述缓冲溶液优选为磷酸盐缓冲溶液 (PBS)或多巴胺溶液，本发明对所述缓冲溶液的浓度没有特殊的限制，能够 起到稳定溶液的pH的作用即可。在本发明中，所述活性物质的种类与上述技 术方案中活性物质的种类一致，在此不再赘述。在本发明中，所述活性物质 溶液中活性物质的质量分数优选为1～200ng/mL，更优选为5～150ng/mL，最 优选为10～100ng/mL。

得到活性物质溶液后，本发明优选将改性微载体与所述活性物质溶液混 合，进行活性物质的负载，得到功能性微载体。在本发明中，所述改性微载 体为上述技术方案所述的改性微载体或上述技术方案所述的制备方法得到的 改性微载体。本发明对所述改性微载体和活性物质溶液的用量没有特殊的限 制，根据不同的实际需求负载相应的活性物质即可。

在本发明中，所述负载的时间优选为1～10小时，更优选为2～8小时，最 优选为3～6小时；所述负载的温度优选为20～30℃，更优选为23～25℃。

得到功能性微载体后，本发明优选将所述功能性微载体进行第三洗涤， 得到第三洗涤后的功能性微载体。在本发明中，所述第三洗涤的次数优选为 1～6次，更优选为2～5次，最优选为3～4次；所述第三洗涤所用的洗液优选为 一次水。本发明对所述第三洗涤的方法没有特殊的限制，本发明优选将所述 微载体进行离心洗涤，得到洗涤后的微载体。

完成所述第三洗涤后，本发明优选将得到的第三洗涤后的功能性微载体 进行第二干燥，得到干燥的功能性微载体。在本发明中，所述第二干燥的时 间优选为36～60小时，更优选为40～55小时，最优选为48～50小时；所述第 二干燥的温度优选为20～30℃，更优选为23～25℃。本发明优选将所述第二洗 涤后的功能性微载体进行真空干燥，得到干燥的功能性微载体。本发明对所 述真空干燥的真空度没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的真空干燥 的真空度即可。本发明对所述真空干燥所用的设备没有特殊的限制，采用本 领域技术人员常用的真空干燥设备即可。如，可采用真空干燥箱。

得到改性微载体后，本发明分别将10mg微载体或10mg改性微载体加入 到10mL浓度为2mg/mL的溶菌酶溶液中,于不同时间点通过BCA试剂盒检 测溶液中残留的溶菌酶的量，推算出固定于微载体或改性微载体表面的溶菌 酶的量。

结果表明，本发明提供的改性微载体的蛋白固定量明显高于没有经多巴 胺改性的微载体，说明本发明提供的改性微载体亲水性好，对细胞的粘附量 有明显的提高。

本发明提供了一种改性微载体，通过含有儿茶酚基团的物质对材质为聚 乳酸(PLA)和/或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的微载体进行改性，得 到改性微载体。本发明提供的改性微载体的亲水性好，能够明显提高细胞的 粘附量。本发明还提供了一种改性微载体的制备方法，本发明提供的制备方 法简单、高效，避免了化学共价结合的复杂过程，及其可能导致的微载体表 面变性。本发明还提供了一种功能性微载体，本发明提供的功能性微载体上 的活性物质可对细胞进行定向诱导，获得具有功能化的细胞，能够直接应用 于组织修复。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种改性微载 体、其制备方法及功能性微载体进行详细描述，但不能将其理解为对本发明 保护范围的限定。

实施例1

将0.05gHA和0.8g数均分子量为50000的PLGA溶于15mL氯仿中，得 到混合溶液；将15mL混合溶液滴加到100mL质量分数为1％的PVA水溶液 中，以400rpm的速率搅拌28小时，得到微载体。将得到的微载体用一次水 离心洗涤三次，然后进行真空干燥48小时，得到干燥的微载体。

将多巴胺溶于摩尔浓度为10mM、pH为8.5的Tris/HCL缓冲液中，得到 浓度为4mg/ml的多巴胺溶液。将微载体浸没于多巴胺溶液中，搅拌6h，得到 改性微载体。将得到的改性微载体用一次水离心洗涤5次。

将IGF-1溶解于多巴胺溶液中，得到质量浓度为1ng/mL的活性物质溶液， 将改性微载体浸没于活性物质溶液中，2h后进行洗涤，得到功能性微载体。

本发明将本实施例得到的微载体和改性微载体进行外观比对，如图1所 示，图1为本发明实施例1得到的微载体和改性微载体外观对比图。图1中， 1为本发明实施例1得到的微载体的外观图，2为本发明实施例1得到的改性 微载体的外观图，由图1可以看出，经多巴胺改性后，微载体表面被聚多巴 胺包被，由白色变为黑色。

本发明将本实施例得到的微载体进行傅里叶红外光谱测试，结果如图2 所示，图2为本发明实施例1得到的微载体的傅里叶红外光谱图。

本发明将本实施例得到的改性微载体进行傅里叶红外光谱测试，结果如 图3所示，图3为本发明实施例1得到的改性微载体的傅里叶红外光谱图。

由图2和图3可以看出，微载体经多巴胺改性后，在波数为1600cm^-1附 近以及波数3000-3400cm^-1之间的吸收峰明显升高，这两个位置可能是苯环， 氨基以及羟基的吸收波段，可认为聚多巴胺已经固定于微载体表面，得到了 改性微载体。

本发明按照上述技术方案测试本实施例得到的微载体的溶菌酶粘附量， 结果图4所示，图4为本发明实施例1～2得到的微载体和改性微载体溶菌酶 粘附量。

本发明按照上述技术方案测试本实施例得到的改性微载体的溶菌酶粘附 量，结果图4所示，图4为本发明实施例1～2得到的微载体和改性微载体溶 菌酶粘附量。

实施例2

将0.06g数均分子量为1.0的PLGA溶于10mL氯仿中，得到混合溶液； 将10mL混合溶液滴加到100mL质量分数为1％的PVA水溶液中，以400rpm 的速率搅拌28小时，得到微载体。将得到的微载体用一次水离心洗涤三次， 然后进行真空干燥48小时，得到干燥的微载体。

将的多巴胺溶于摩尔浓度为10mM、pH为8.5的Tris/HCL缓冲液中，得 到浓度为2mg/mL的多巴胺溶液。将微载体浸没于多巴胺溶液中，搅拌6h， 得到改性微载体。将得到的改性微载体用一次水离心洗涤5次。

将IGF-1溶解于多巴胺溶液中，得到质量浓度为1ng/mL的活性物质溶液， 将改性微载体浸没于活性物质溶液中，2h后进行洗涤，得到功能性微载体。

本发明按照上述技术方案测试本实施例得到的微载体的溶菌酶粘附量， 结果图4所示，图4为本发明实施例1～2得到的微载体和改性微载体溶菌酶 粘附量。

本发明按照上述技术方案测试本实施例得到的改性微载体的溶菌酶粘附 量，结果图4所示，图4为本发明实施例1～2得到的微载体和改性微载体溶 菌酶粘附量。

在图4中，1为本发明实施例1得到改性微载体的溶菌酶粘附量；2为本 发明实施例2得到的改性微载体的溶菌酶粘附量；3为本发明实施例1得到微 载体的溶菌酶粘附量；4为本发明实施例2得到的微载体的溶菌酶粘附量。由 图4可以看出，聚多巴胺固定蛋白在前20min基本完成，改性微载体的蛋白 固定量明显高于没有经多巴胺改性的微载体，说明本发明提供的改性微载体 亲水性好，对细胞的粘附量有明显的提高。

实施例3

按照本发明实施例2的技术方案，得到功能性微载体，不同的是，本实 施例中活性物质溶液的浓度为10ng/mL。

实施例4

按照本发明实施例2的技术方案，得到功能性微载体，不同的是，本实 施例中活性物质溶液的浓度为100ng/mL。

实施例5

将0.07gHA和0.63g数均分子量为80000的PLGA溶于10mL氯仿中， 得到混合溶液；将10mL混合溶液滴加到100mL质量分数为1％的PVA水溶 液中，以400rpm的速率搅拌28小时，得到微载体。将得到的微载体用一次 水离心洗涤三次，然后进行真空干燥48小时，得到干燥的微载体。

将多巴胺溶于摩尔浓度为10mM、pH为8.5的Tris/HCL缓冲液中，得到 浓度为2mg/ml的多巴胺溶液。将微载体浸没于多巴胺溶液中，搅拌6h，得到 改性微载体。将得到的改性微载体用一次水离心洗涤5次。

将IGF-1溶解于多巴胺溶液中，得到质量浓度为1ng/mL的活性物质溶液， 将改性微载体浸没于活性物质溶液中，2h后进行洗涤，得到功能性微载体。

本发明将本实施例得到的微载体进行电镜扫描，结果如图5所示，图5 为本发明实施例3得到的微载体的扫描电镜图。

本发明将本实施例得到的微载体进行红外衍射光谱测试，结果如图6所 示，图6为本发明实施例3得到的微载体的红外衍射光谱图。

本发明将本实施例得到的改性微载体进行电镜扫描，结果如图7所示， 图7为本发明实施例3得到的改性微载体的扫描电镜图。

本发明将本实施例得到的微载体进行红外衍射光谱测试，结果如图8所 示，图8为本发明实施例3得到的改性微载体的红外衍射光谱图。

由图5～8可以看出，改性后的微载体表面被覆盖，说明多巴胺经聚合后 固定于微载体表面，得到了改性微载体。

实施例6

按照本发明实施例5的技术方案，得到功能性微载体，不同的是，本实 施例中活性物质溶液的浓度为10ng/mL。

实施例7

按照本发明实施例5的技术方案，得到功能性微载体，不同的是，本实 施例中活性物质溶液的浓度为100ng/mL。

实施例8～9

将本发明实施例2和实施例5得到的微载体分别溶解于70％的乙醇溶液 中，将得到的微载体溶液分别以每孔20mg微载体放在24孔细胞培养板中， 将小鼠脂肪间充质干细胞以每孔2w细胞接种于微载体表面，在37℃，5％二 氧化碳浓度的湿环境下培养3天，通过cck-8试剂盒检测干细胞在微载体表面 的增值情况。结果如图9所示，图9为本发明实施例2～7微载体、改性微载 体或功能性微载体对小鼠脂肪间充质干细胞增殖的影响。

实施例10～11

将本发明实施例2和实施例5得到的改性微载体分别溶解于70％的乙醇 溶液中，将得到的改性微载体溶液分别以每孔20mg改性微载体放在24孔细 胞培养板中，将小鼠脂肪间充质干细胞以每孔2w细胞接种于改性微载体表 面，在37℃，5％二氧化碳浓度的湿环境下培养3天，通过cck-8试剂盒检测 干细胞在改性微载体表面的增值情况。结果如图9所示，图9为本发明实施 例2～7微载体、改性微载体或功能性微载体对小鼠脂肪间充质干细胞增殖的 影响。

实施例12～14

将本发明实施例2～4得到的功能性微载体分别溶解于70％的乙醇溶液中， 将得到的功能性微载体溶液分别以每孔20mg功能性微载体放在24孔细胞培 养板中，将小鼠脂肪间充质干细胞以每孔2w细胞接种于功能性微载体表面， 在37℃，5％二氧化碳浓度的湿环境下培养3天，通过cck-8试剂盒检测干细 胞在功能性微载体表面的增值情况。结果如图9所示，图9为本发明实施例 2～7得到的微载体、改性微载体或功能性微载体对小鼠脂肪间充质干细胞增殖 的影响。

实施例15～17

将本发明实施例5～7得到的功能性微载体分别溶解于70％的乙醇溶液中， 将得到的功能性微载体溶液分别以每孔20mg功能性微载体放在24孔细胞培 养板中，将小鼠脂肪间充质干细胞以每孔2w细胞接种于功能性微载体表面， 在37℃，5％二氧化碳浓度的湿环境下培养3天，通过cck-8试剂盒检测干细 胞在功能性微载体表面的增值情况。结果如图9所示，图9为本发明实施例 2～7得到的微载体、改性微载体或功能性微载体对小鼠脂肪间充质干细胞增殖 的影响。

在图9中，1为本发明实施例2得到的微载体对小鼠脂肪间充质干细胞增 殖的影响；2为本发明实施例5得到的微载体对小鼠脂肪间充质干细胞增殖的 影响；3为本发明实施例2得到的改性微载体对小鼠脂肪间充质干细胞增殖的 影响；4为本发明实施例5得到的改性微载体对小鼠脂肪间充质干细胞增殖的 影响；5为本发明实施例2得到的功能性微载体对小鼠脂肪间充质干细胞增殖 的影响；6为本发明实施例3得到的功能性微载体对小鼠脂肪间充质干细胞增 殖的影响；7为本发明实施例4得到的功能性微载体对小鼠脂肪间充质干细胞 增殖的影响；8为本发明实施例5得到的功能性微载体对小鼠脂肪间充质干细 胞增殖的影响；9为本发明实施例6得到的功能性微载体对小鼠脂肪间充质干 细胞增殖的影响；10为本发明实施例7得到的功能性微载体对小鼠脂肪间充 质干细胞增殖的影响。由图9可以看出，本发明提供的改性微载体比未经过 改性的微载体的小鼠脂肪间充质干细胞增殖效果更好，并且，本发明提供的 功能性微载体对小鼠脂肪间充质干细胞增殖效果提高的要更加明显，说明本 发明提供的功能性微载体能够促进小鼠脂肪间充质干细胞的增殖。

实施例18～19

本发明将实施例2和实施例5得到的微载体溶解于70％的乙醇溶液中， 将得到的微载体溶液以每孔20mg微载体放在24孔细胞培养板中，将小鼠脂 肪间充质干细胞以每孔2w细胞接种于微载体表面，在37℃，5％二氧化碳浓 度的湿环境下培养7天，然后将培养液吸出，PBS清洗两边，加入100μl浓 度为0.25％的Triton 100冻融3次，然后加入50μL的Pnpp(sigma)溶液， 在37℃下孵育30min，然后在405nm波长下检测吸光度值，来反映碱性磷酸 酶(ALP)含量，通过对比分析ALP的含量，检测微载体对干细胞成骨诱导 的作用。结果如图10所示，图10为本发明实施例2和实施例5得到的微载 体、改性微载体或功能性微载体对小鼠脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶表达的 影响。

实施例20～21

本发明将实施例2和实施例5得到的改性微载体溶解于70％的乙醇溶液 中，将得到的改性微载体溶液以每孔20mg改性微载体放在24孔细胞培养板 中，将小鼠脂肪间充质干细胞以每孔2w细胞接种于改性微载体表面，在37 ℃，5％二氧化碳浓度的湿环境下培养7天，然后将培养液吸出，PBS清洗两 边，加入100μL浓度为0.25％的Triton 100冻融3次，然后加入50μLPnpp (sigma)溶液，在37℃下孵育30min，然后在405nm波长下检测吸光度值， 来反映碱性磷酸酶(ALP)含量，通过对比分析ALP的含量，检测改性微载 体对干细胞成骨诱导的作用。结果如图10所示，图10为本发明实施例2和 实施例5得到的微载体、改性微载体或功能性微载体对小鼠脂肪间充质干细 胞碱性磷酸酶表达的影响。

实施例22～23

本发明将实施例2和实施例5得到的功能性微载体溶解于70％的乙醇溶 液中，将得到的功能性微载体溶液以每孔20mg功能性微载体放在24孔细胞 培养板中，将小鼠脂肪间充质干细胞以每孔2w细胞接种于功能性微载体表 面，在37℃，5％二氧化碳浓度的湿环境下培养7天，然后将培养液吸出，PBS 清洗两边，加入100μL浓度为0.25％的Triton 100冻融3次，然后加入 50μLPnpp(sigma)溶液，在37℃下孵育30min，然后在405nm波长下检测 吸光度值，来反映碱性磷酸酶(ALP)含量，通过对比分析ALP的含量，检 测功能性微载体对干细胞成骨诱导的作用。结果如图10所示，图10为本发 明实施例2和实施例5得到的微载体、改性微载体或功能性微载体对小鼠脂 肪间充质干细胞碱性磷酸酶表达的影响。

在图10中，1为本发明实施例2得到的微载体对小鼠脂肪间充质干细胞 碱性磷酸酶表达的影响；2为本发明实施例5得到的微载体对小鼠脂肪间充质 干细胞碱性磷酸酶表达的影响；3为本发明实施例2得到的改性微载体对小鼠 脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶表达的影响；4为本发明实施例5得到的改性微 载体对小鼠脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶表达的影响；5为本发明实施例2得 到的功能性微载体对小鼠脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶表达的影响；6为本发 明实施例5得到的功能性微载体对小鼠脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶表达的 影响。由图10可以看出，本发明提供的改性微载体和功能性微载体对小鼠脂 肪间充质干细胞碱性磷酸酶的表达明显高于普通的微载体，说明本发明提供 的功能性微载体能够对细胞进行定向诱导，获得具有功能化的细胞，能够直 接应用于组织修复。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。