公开/公告号CN104066843A
专利类型发明专利
公开/公告日2014-09-24
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申请/专利号CN201380007227.2
申请日2013-01-29
分类号C12N15/09(20060101);C12M1/40(20060101);C12N1/15(20060101);C12N1/19(20060101);C12N1/21(20060101);C12N5/10(20060101);C12N9/06(20060101);C12Q1/26(20060101);C12Q1/28(20060101);
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代理人庞立志;杨思捷
地址 日本富山县富山市
入库时间 2023-12-17 01:59:14
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-01-25
专利权的转移 IPC(主分类):C12N15/09 登记生效日:20170106 变更前: 变更后: 申请日:20130129
专利申请权、专利权的转移
2016-05-18
授权
授权
2014-10-22
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/09 申请日:20130129
实质审查的生效
2014-09-24
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本申请要求于2012年1月30日申请的日本专利2012-16165号的优先权，并将其全部记载作为公开援用于本文中。
技术领域
本发明涉及新型L-氨基酸氧化酶、以及使用该新型L-氨基酸氧化酶的L-赖氨酸的测定方法、用于该方法的试剂盒和酶传感器。更详细地，本发明涉及对L-赖氨酸的底物特异性高的突变型L-氨基酸氧化酶、以及利用该突变型酶的L-赖氨酸的测定方法、L-赖氨酸测定用试剂盒和酶传感器。
背景技术
L-赖氨酸是蛋白质构成氨基酸之一，是在体内无法产生的必需氨基酸。包括L-赖氨酸的氨基酸的浓度在机体内被维持恒定，但由于先天性代谢异常或内脏疾病，血中浓度会发生大幅变动。不限于L-赖氨酸，机体内的氨基酸浓度可以成为检测疾病的有用手段。因此，通过测定1种或多种氨基酸的血中浓度，可以对上述疾病进行检测（专利文献1和非专利文献1）。
近年来，作为氨基酸的定量方法，多数已知的是利用酶的方法。利用酶的方法与机器分析方法相比具有能够廉价且简便地进行的优点。作为定量用酶，多使用例如脱氢酶或氧化酶。使用氧化酶的情形，可举出使氧化酶与氨基酸作用，由此生成过氧化氢，并用过氧化物酶对该过氧化氢进行检测、定量的方法（专利文献2）。在该检测和定量中，还可以利用比色法、荧光法、电极法的任一方法。
作为L-赖氨酸的定量方法，也已知利用酶的方法。例如，利用氧化酶的定量使用了L-赖氨酸α氧化酶[EC 1.4.3.14]。来源于绿色木霉（Trichoderma>）的L-赖氨酸α氧化酶与其它的L-氨基酸氧化酶相比，底物特异性高并且有市售，因而被利用作为酶传感器等的元件（非专利文献2、非专利文献3和非专利文献4）。
此外，据报道来源于荧光假单胞菌（Pseudomonas>）的L-赖氨酸单加氧酶具有L-赖氨酸氧化酶活性（非专利文献5和非专利文献6）。该酶以L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸为底物。
专利文献1：国际公开WO2006/129513号公报
专利文献2：日本特开昭55-43409号公报
非专利文献1：Anal. Chem. 81: 307-314 (2009)
非专利文献2：Sens. Actuators, B 126: 424-430 (2007)
非专利文献3：Anal. Bioanal. Chem. 391: 1255-1261 (2008)
非专利文献4：Anal. Bioanal. Chem. 406: 19-23 (2010)
非专利文献5：J. Biol. Chem. 249: 2579-2586 (1974)
非专利文献6：J. Biol. Chem. 249: 2587-2592 (1974)。
发明内容
然而，来源于绿色木霉的L-赖氨酸α氧化酶对L-赖氨酸以外的氨基酸也显示氧化酶活性。因此，使用L-赖氨酸α-氧化酶对血浆之类的含有多种氨基酸的试样进行定量时，存在过量评价的倾向。
此外，最近报道了与上述L-赖氨酸α-氧化酶相比，底物特异性高的来源于海水鱼的粘液的L-赖氨酸α-氧化酶(非专利文献3)。但是，该L-赖氨酸α-氧化酶来源于海水鱼的粘液，还没有关于利用培养来生产酶的报道。因此，难以大量生产该酶来用于L-赖氨酸的定量。
进而，也没有将来源于荧光假单胞菌的L-赖氨酸单加氧酶用于L-赖氨酸定量的报道。此外，即使将该酶用于L-赖氨酸定量，如上所述，由于对L-赖氨酸以外的L-鸟氨酸和L-精氨酸也具有加氧酶活性，因而对于血浆之类的含有多种氨基酸的试样，无法严格地进行L-赖氨酸的定量。
利用L-赖氨酸的氧化酶的定量方法若能实现，则从能够比机器分析方法更廉价且简易地进行的观点出发是有用的。但是，如上所述，对于血浆之类的含有多种氨基酸的试样，由于迄今为止能利用的酶的底物特异性低、或者酶生产率上存在问题等方面的原因，仍是无法提供于实用的状况。
因此，本发明的目的是提供对L-赖氨酸的底物特异性高的酶来作为即使是含有多种氨基酸的机体试样也能够特异性地定量L-赖氨酸的酶，进而提供使用该酶的L-赖氨酸的酶学测定方法。
进而，本发明的目的还在于提供可在实施上述酶学测定方法时利用的测定用的试剂盒。
此外，本发明的目的还在于提供可用于上述酶学测定方法的酶传感器。
本发明人为了实现上述目的而深入研究，结果发现，通过将来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的上述L-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中的第254位的半胱氨酸替换为规定的氨基酸而得的突变型L-氨基酸氧化酶对L-赖氨酸具有高的底物特异性。本发明是根据上述见解完成的发明。
即，本发明如下所述。
〔1〕
下述（1）至（3）中任一项所述的蛋白质：
（1）具有SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列中的第254位的半胱氨酸被蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或脯氨酸所替换的氨基酸序列的蛋白质；
（2）由上述（1）中规定的蛋白质中的除上述第254位的氨基酸以外的区域中有1个或数个氨基酸缺失、被替换和/或被添加的氨基酸序列组成，并且具有与由SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列组成的氨基酸氧化酶相比对L-赖氨酸的底物特异性更高的氧化酶活性的蛋白质；或
（3）由与上述（1）所规定的蛋白质的氨基酸序列具有至少67%的序列同一性的氨基酸序列组成，并且具有与由SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列组成的氨基酸氧化酶相比对L-赖氨酸的底物特异性更高的氧化酶活性的蛋白质，但该蛋白质的氨基酸序列中的与上述第254位的氨基酸对应的氨基酸没有突变。
〔2〕
〔1〕所述的蛋白质，其中，上述第254位的氨基酸为蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。
〔3〕
〔1〕或〔2〕所述的蛋白质，其中，上述第254位的氨基酸为异亮氨酸或酪氨酸。
〔4〕
〔1〕至〔3〕中任一项所述的蛋白质，其中，在将具有上述（2）或（3）所规定的、第254位的半胱氨酸被色氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或脯氨酸以外的氨基酸所替换的氨基酸序列的蛋白质对L-赖氨酸的氧化酶活性设为100%时，上述蛋白质对L-精氨酸的氧化酶活性为15%以下，并且对L-鸟氨酸的氧化酶活性为80%以下。
〔5〕
核酸，其编码〔1〕至〔4〕中任一项所述的蛋白质。
〔6〕
载体，其含有〔5〕所述的核酸。
〔7〕
经〔6〕所述的载体转化的转化体。
〔8〕
检测或定量L-赖氨酸的方法，其包括以下步骤：
（A）在水和氧的存在下保持待测物和〔1〕至〔4〕中任一项所述的蛋白质的步骤；和
（B）检测或定量通过上述蛋白质对L-赖氨酸的氧化酶活性的作用而在反应液中生成的至少一种反应产物的步骤。
〔9〕
〔8〕所述的方法，其中，在步骤（B）中检测或定量的反应产物是过氧化氢。
〔10〕
〔9〕所述的方法，其中，使用过氧化物酶来检测或定量上述过氧化氢。
〔11〕
〔8〕所述的方法，其中，在步骤（B）中检测或定量的反应产物是氨。
〔12〕
〔11〕所述的方法，其中，使用氨检测试剂来检测或定量氨。
〔13〕
〔8〕所述的方法，其中，在步骤（B）中检测或定量的反应产物是L-赖氨酸的脱氨基化产物。
〔14〕
L-赖氨酸的检测或定量用试剂盒，其包含〔1〕至〔4〕中任一项所述的蛋白质。
〔15〕
〔14〕所述的试剂盒，其进一步包含反应用缓冲液、过氧化氢检测试剂、氨检测试剂、和L-赖氨酸的脱氨基化产物检测试剂的至少一者。
〔16〕
L-赖氨酸的检测或定量用酶传感器，其含有过氧化氢检测用电极，其中，在上述过氧化氢检测用电极的表面或该表面的附近配置有〔1〕至〔4〕中任一项所述的蛋白质。
〔17〕
〔16〕所述的传感器，其中，上述过氧化氢检测用电极是酶式过氧化氢电极或隔膜式过氧化氢电极。
根据本发明，可提供对L-赖氨酸的底物特异性高的新型的突变型L-氨基酸氧化酶。通过使用该突变型L-氨基酸氧化酶，即使是对含有其它氨基酸等大量夹杂物的试样，也可以特异性并且精度良好地对L-赖氨酸进行简便?迅速的检测和定量。本发明特别是对血浆、血清或尿之类的机体试样有效，通过使之与过氧化物酶等酶偶联，不仅可用发色法、荧光法来定量L-赖氨酸，而且还可提供电极型酶传感器。
附图说明
[图1] 图1示出来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶（野生型酶）催化的以L-赖氨酸为底物的单加氧酶反应和氧化酶反应的反应机制及其比例。
[图2] 图2示出上述野生型酶的SDS-PAGE的照片。
[图3] 图3示出根据编码上述野生型酶的碱基序列预测的氨基酸序列。
[图4] 图4示出对上述野生型酶的氨基酸序列、作为本发明的蛋白质的突变型酶C254I的氨基酸序列、以及公知同源基因的氨基酸序列进行比对分析的结果。图4中，LysOX 野生型表示来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶；LysOX C254I表示本发明的突变型酶C254I，其它的公知氨基酸序列用登录号表示。
[图5] 图5示出图4所示比对分析的续图。
[图6] 图6示出实施例中纯化的野生型酶对L-赖氨酸(Lys)、L-鸟氨酸（Orn）和L-精氨酸（Arg）的酶活性（pH依赖性）。
[图7] 图7示出使用实施例中纯化的野生型酶标准品的、以1～6mM的L-赖氨酸水溶液为待测物时的L-赖氨酸浓度与492nm下的吸光度（absorbance）的相关关系。
[图8] 图8示出以L-赖氨酸、L-鸟氨酸、和L-精氨酸为底物来对野生型酶和本发明的突变型酶C254I调查酶活性（pH依赖性）的结果。
[图9] 图9示出对野生型酶和本发明的突变型酶C254I调查底物特异性的结果。
[图10] 图10示出使用野生型酶和本发明的突变型酶C254I、并以1～10mM的L-赖氨酸水溶液为待测物时的L-赖氨酸浓度与吸光度（absorbance）的关系。图10中，LysOX 野生型表示野生型酶的结果；LysOX C254I表示本发明的突变型酶C254I的结果。
[图11] 图11示出对野生型酶的氨基酸序列中的第254位的半胱氨酸突变为各种氨基酸而得的各种突变型酶的底物特异性进行调查的结果。
[图12] 图12示出将图11的结果中的对L-赖氨酸的氧化酶活性设为100%时的L-精氨酸和L-鸟氨酸的相对活性。
[图13] 图13示出使用野生型酶对添加有L-赖氨酸、L-精氨酸和L-鸟氨酸的血浆样品定量各氨基酸的结果。
[图14] 图14示出使用本发明的突变型酶C254I对添加有L-赖氨酸、L-精氨酸和L-鸟氨酸的血浆样品定量各氨基酸的结果。
具体实施方式
＜突变型L-氨基酸氧化酶＞
本发明涉及下述（1）至（3）中任一项所述的蛋白质。
（1）具有SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列中的第254位的半胱氨酸被蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或脯氨酸所替换的氨基酸序列的蛋白质；
（2）由上述（1）中规定的蛋白质中的除上述第254位的氨基酸以外的区域中有1个或数个氨基酸缺失、被替换和/或被添加的氨基酸序列组成，并且具有与由SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列组成的氨基酸氧化酶相比对L-赖氨酸的底物特异性更高的氧化酶活性的蛋白质；或
（3）由与上述（1）所规定的蛋白质的氨基酸序列具有至少67%的序列同一性的氨基酸序列组成，并且具有与由SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列组成的氨基酸氧化酶相比对L-赖氨酸的底物特异性更高的氧化酶活性的蛋白质，但该蛋白质的氨基酸序列中的与上述第254位的氨基酸对应的氨基酸没有突变。
上述（1）所述的蛋白质中，SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列是通过从自然界分离新的假单胞菌属菌株，并对编码属于该假单胞菌属的微生物产生的L-氨基酸氧化酶的基因进行克隆而得的。该点将在实施例中详述。
由上述SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，如实施例中所确认，是具有L-氨基酸氧化酶活性的蛋白质。该蛋白质所具有的L-氨基酸氧化酶活性是在氧和水的存在下、在pH7.0（30℃）下，分别作用于L-赖氨酸、L-鸟氨酸和L-精氨酸而生成过氧化氢和氨的活性。本说明书中，以下将对L-赖氨酸、L-鸟氨酸和L-精氨酸的上述氧化酶活性分别称为L-赖氨酸氧化酶活性、L-鸟氨酸氧化酶活性、和L-精氨酸氧化酶活性。应予说明，上述氧化酶活性可通过使用以下实施例中记载的测定试剂和测定方法来测定。
本发明的上述（1）所规定的蛋白质是通过将SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列中的第254位的半胱氨酸替换为蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或脯氨酸而得的突变型L-氨基酸氧化酶。如实施例所示，将上述第254位的氨基酸替换为这些氨基酸而得的蛋白质，与由SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列组成的氨基酸氧化酶相比对L-赖氨酸的氧化酶活性的特异性更高。
具有“与由SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列组成的氨基酸氧化酶相比对L-赖氨酸的底物特异性更高的氧化酶活性”的本发明的蛋白质是指与野生型氨基酸氧化酶（以下，称为野生型酶）相比对L-赖氨酸的底物特异性相对更高的蛋白质。具体地，意指与野生型酶相比，L-精氨酸氧化酶活性相对于L-赖氨酸氧化酶活性的比率低、L-鸟氨酸氧化酶活性相对于L-赖氨酸氧化酶活性的比率低、或L-精氨酸氧化酶活性相对于L-赖氨酸氧化酶活性的比率与L-鸟氨酸氧化酶活性相对于L-赖氨酸氧化酶活性的比率两者均低。本发明中，作为具有“与由SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列组成的氨基酸氧化酶相比对L-赖氨酸的底物特异性更高的氧化酶活性”的蛋白质，从对L-赖氨酸的底物特异性更高的观点出发，优选为L-精氨酸氧化酶活性相对于L-赖氨酸氧化酶活性的比率、和L-鸟氨酸氧化酶活性相对于L-赖氨酸氧化酶活性的比率两者均比上述野生型酶低的蛋白质。
进而，从赋予与野生型酶相比，“对L-赖氨酸的底物特异性更高的氧化酶活性”的观点出发，上述（1）所规定的蛋白质中，优选上述第254位的氨基酸为蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。这是因为在将上述第254位的氨基酸替换为这些氨基酸时，如以下实施例所示，L-精氨酸氧化酶活性相对于L-赖氨酸氧化酶活性的比率、以及L-鸟氨酸氧化酶活性相对于L-赖氨酸氧化酶活性的比率两者均较上述野生型酶低的缘故。进而，从获得对L-赖氨酸的氧化酶活性的底物特异性显著提高的蛋白质（氨基酸氧化酶）的观点出发，上述第254位的氨基酸优选为异亮氨酸或酪氨酸。
在上述（2）和（3）所规定的范围中，本发明的蛋白质只要具有上述对L-赖氨酸的底物特异性高的氧化酶活性，则没有特别限定，但在将该蛋白质的L-赖氨酸氧化酶活性设为100%时，该蛋白质的L-精氨酸氧化酶活性优选为15%以下、进一步优选为10%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、0.5%以下、0.01%以下、0%。另外，该蛋白质的L-鸟氨酸氧化酶活性优选为80%以下、进一步优选为60%以下、更进一步优选为50%以下、更进一步优选为20%以下、15%以下、10%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、0.5%以下、0.01%以下、0%。另外，作为基准的野生型酶的情形，在将pH7.0、30℃下的L-赖氨酸氧化酶活性设为100%时，L-精氨酸氧化酶活性为20%左右，和L-鸟氨酸氧化酶活性为83%左右。
进而，本发明的蛋白质只要显示上述的“对L-赖氨酸的底物特异性高的氧化酶活性”，则对该L-赖氨酸氧化酶活性的绝对值没有特别限定。例如，本发明蛋白质的L-赖氨酸氧化酶活性优选至少与野生型酶的L-赖氨酸氧化酶活性等同，或者为其以上。具体地，本发明的蛋白质在pH7.0下的L-赖氨酸氧化酶活性优选为0.6U/mg以上、进一步优选为1.0U/mg以上。
此外，对于作为L-赖氨酸、L-鸟氨酸和L-精氨酸以外的蛋白质构成氨基酸的、L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸，本发明的蛋白质的突变型L-氨基酸氧化酶不显示活性。
本发明中，上述（2）所规定的蛋白质是“由上述（1）中规定的蛋白质中的除上述第254位的氨基酸以外的区域中有1个或数个氨基酸缺失、被替换和/或被添加的氨基酸序列组成，并且具有与由SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列组成的氨基酸氧化酶相比对L-赖氨酸的底物特异性更高的氧化酶活性的蛋白质”。本文中，对于“有1至数个氨基酸缺失、被替换和/或被添加的氨基酸序列”中的“1至数个”的范围，只要具有缺失等的蛋白质具有上述对L-赖氨酸的底物特异性高的氧化酶活性，则没有特别限定。前述“1至数个”的范围，由于具有上述对L-赖氨酸的底物特异性高的氧化酶活性的蛋白质的比例高，因而例如为1至30个、优选为1至20个、更优选为1至10个、进一步优选为1至7个、更进一步优选为1至5个、特别优选为1至3个、1至2个、可以为1个左右。
本发明中，上述（3）所规定的蛋白质是“由与上述（1)所规定的蛋白质的氨基酸序列具有至少67%的序列同一性的氨基酸序列组成，并且具有与由SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列组成的氨基酸氧化酶相比对L-赖氨酸的底物特异性更高的氧化酶活性的蛋白质，但该蛋白质的氨基酸序列中的与上述第254位的氨基酸对应的氨基酸没有突变。”。
本发明中，对于“与上述（1）所规定的蛋白质的氨基酸序列具有至少67%的序列同一性的氨基酸序列”中的“序列同一性”，只要具有该氨基酸序列的同一性的蛋白质是具有对上述L-赖氨酸的底物特异性高的氧化酶活性的酶，则没有特别限定。前述氨基酸序列的序列同一性只要为67%以上则没有特别限定，优选为68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上或74%以上、进一步优选为75%以上、进一步优选为80%以上、85%以上、90%以上、更进一步优选为91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上。本发明中，“序列同一性”的用语是指2个以上氨基酸序列相对于彼此的氨基酸同一性的程度。因此，某两个氨基酸序列的同一性越高，则它们的序列同一性或相似性越高。2种氨基酸序列是否具有同一性可以通过序列的直接比较来进行分析，具体地，可以使用市售的序列分析软件等进行分析。
进而，本发明中，“但该蛋白质的氨基酸序列中与上述第254位的氨基酸对应的氨基酸没有突变。”中的“突变”具体意指氨基酸的缺失或替换。即，“但该蛋白质的氨基酸序列中与上述第254位的氨基酸对应的氨基酸没有突变。”意指在上述（3）所规定的蛋白质的氨基酸序列中，与作为序列同一性的判断基准的上述（1）的蛋白质的氨基酸序列中的第254位的氨基酸对应的氨基酸与上述（1）的蛋白质的氨基酸序列中的第254位的氨基酸相同。因此，上述（1）的蛋白质中的被替换的氨基酸若为异亮氨酸，则上述（3）的蛋白质的氨基酸序列中的与上述第254位的氨基酸对应的氨基酸为异亮氨酸。
上述（3）所规定的蛋白质的氨基酸序列中，与作为序列同一性的判断基准的上述（1）的蛋白质的氨基酸序列中的第254位的氨基酸对应的氨基酸，可通过上述序列同一性或同源性的分析来调查。具体地，只要使用市售的序列分析软件等，相对于SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列或上述（1）的蛋白质的氨基酸序列，进行分析对象氨基酸序列的比对分析，则可以检索与上述第254位的氨基酸对应的氨基酸。这种比对分析的方法是广为本领域技术人员所知的。
本发明的上述蛋白质只要属于上述（1）至（3）所规定的范围，则对其来源没有特别限定。例如，本发明的蛋白质可以是通过各种基因工程技术制造的重组蛋白质，也可以是通过化学合成制造的合成蛋白质，或者是通过向具有由SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列组成的L-氨基酸氧化酶的基因同源性的特定生物种（例如，细菌）赋予突变原而获得能够产生本发明的突变型酶的突变体，通过提取和生成由该突变体产生的蛋白质而制造的蛋白质。
通过基因工程技术来制造本发明的重组蛋白质时，制作编码上述蛋白质（1）、（2）或（3）的核酸（DNA或RNA），并插入各种表达载体，由此可以表达本发明的蛋白质。在制作编码本发明蛋白质的核酸时，为了将SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列中的第254位的半胱氨酸或与该半胱氨酸相应的氨基酸替换为上述（1）中记载的规定的氨基酸，或为了在上述（2）所规定的蛋白质中实施氨基酸的缺失、替换和/或添加，或者为了准备编码上述（3）所规定的蛋白质中与SEQ. ID NO：2的氨基酸序列具有规定同一性的蛋白质的核酸，例如，可以通过易错PCR法、DNA改组法、各种位点特异性突变导入法等来进行任意的碱基的缺失、替换和/或插入。通过将如此制作的编码本发明蛋白质的核酸导入适当的表达系统，可以制造本发明的蛋白质。
作为可用于制造本发明蛋白质的表达系统，没有特别限定，例如，可以利用能够在各种生物种（宿主）中表达重组蛋白质的表达载体。作为可利用的表达载体，可使用能够在细菌、菌类（例如、酵母类）等微生物、植物、昆虫细胞、哺乳类细胞等宿主中表达蛋白质的各种表达载体，可以是病毒载体（包括噬菌体载体），也可以是质粒载体。或者，也可以采用使用了兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽裂解物、大肠杆菌裂解物等的无细胞蛋白质表达系统来制造本发明的蛋白质。
在通过使用特定生物种作为宿主的表达系统来表达本发明的蛋白质时，可通过下述制造方法来制备，该方法包括：将编码上述本发明的蛋白质的核酸插入载体上，用该载体转化宿主细胞后，培养经转化的宿主细胞，在培养物中蓄积前述基因所编码的蛋白质，并收集蓄积的蛋白质。
编码本发明蛋白质的核酸、包含该核酸的载体、经该载体转化的转化体是本发明的一个方式。
编码本发明蛋白质的核酸的取得方法没有特别限定。例如，如以下实施例所述，可以将编码分离自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶基因（SEQ. ID NO：1和2）的核酸作为材料来获得编码本发明蛋白质的核酸，或者也可以从各种细菌分离与本发明蛋白质或SEQ. ID NO：2所述氨基酸序列（L-氨基酸氧化酶）具有同源性的基因，制备编码该基因的核酸，并进行与上述第254位的氨基酸对应的氨基酸的替换，从而制造编码本发明蛋白质的核酸。此外，编码本发明蛋白质的核酸可以基于SEQ. ID NO：1中记载的碱基序列或SEQ. ID NO：2中记载的氨基酸序列、或与SEQ. ID NO：1中记载的碱基序列具有一定的同一性的公知碱基序列或与SEQ. ID NO：2中记载的氨基酸序列具有一定的同一性的公知氨基酸序列的信息，通过化学合成、基因工程方法或突变诱导等本领域技术人员已知的任意方法来制作。
SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列是来自本发明人从自然界分离的假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶（野生型酶）的氨基酸序列，但与该L-氨基酸氧化酶显示一定的同源性的基因已有大量已知。例如，已知有来源于表1所示细菌的基因。
[表1]
对野生型酶的氨基酸序列、作为本发明蛋白质的突变型酶C254I的氨基酸序列、以及表1所示的已知基因的氨基酸序列进行比对分析，结果示于图4和5。图4中，箭头所示位置的氨基酸是与上述第254位的氨基酸对应的氨基酸。如图4所示，与上述野生型酶相同，表1所示的已知基因与上述第254位的氨基酸对应的氨基酸也是半胱氨酸。本发明蛋白质的氨基酸序列可以基于这些已知基因的序列来设计，也可以基于其它公知的同源基因的序列信息来设计。
具体地，编码本发明蛋白质的核酸可采用如下方法制备，例如，使具有序列表的SEQ. ID NO：1中记载的碱基序列的DNA与作为突变原的药剂接触作用的方法、照射紫外线的方法、基因工程方法等。此外，作为基因工程方法之一的位点特异性突变诱导法是可以在特定位置导入特定突变的方法，因而可用于在制造编码本发明蛋白质的核酸时向核酸导入位点特异性的突变。
例如，基于本说明书中的序列表的SEQ. ID NO：1中记载的碱基序列或SEQ. ID NO：2所示的氨基酸序列的信息，制备适当的探针或引物，并用它们对含有假单胞菌属(Pseudomonas sp.)H-8-1-3株的细菌的cDNA或基因组文库进行筛选，由此可以制备作为用于制造编码本发明蛋白质的核酸的材料的核酸。cDNA或基因组文库可通过常法制作。
此外，还可通过PCR法来获得用于制造编码本发明蛋白质的核酸的材料。例如，将含有假单胞菌属(Pseudomonas sp.)H-8-1-3株的细菌的基因组DNA、cDNA或基因组文库用作模板，使用以能够扩增SEQ. ID NO：1中记载的碱基序列的方式设计的1对引物来进行PCR。PCR的反应条件可以适宜设定，可举出例如，将由94℃下30秒钟（变性）、55℃下30秒～1分钟（退火）、72℃下2分钟（延伸）构成的反应步骤作为1个循环，进行例如30个循环后，在72℃下反应7分钟的条件等。扩增的DNA片段可以用作用于制造编码本发明蛋白质的核酸的材料。进而，接着将扩增的DNA片段克隆至能通过大肠杆菌（E. coli）等宿主进行扩增的适当载体中，所得的载体也可以用作用于制造编码本发明蛋白质的核酸的材料。
如上所述准备的用于制造编码本发明蛋白质的核酸的材料中，对于编码与上述第254位的氨基酸对应的氨基酸的碱基序列（密码子），使用各种突变导入法实施碱基的替换，可以制造编码本发明蛋白质的核酸、或含有该核酸的载体。应予说明，上述探针或引物的制备、基因组文库的构建、基因组文库的筛选、以及目标基因的克隆等操作是本领域技术人员已知的。
编码本发明蛋白质的核酸可以在插入适当载体中的状态下使用。本发明所用的载体的种类没有特别限定，例如，可以是自主复制的载体（例如质粒等），或者也可以是在被导入宿主细胞时整合至宿主细胞的基因组中，与整合的染色体一起被复制的载体。优选载体为表达载体。表达载体中，转录所需的要素（例如，启动子等）起作用地与上述核酸连接。启动子是在宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，可以对应于宿主的种类适宜选择。
作为能够在细菌细胞中起作用的启动子，可举出：嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、解淀粉芽孢杆菌?BAN淀粉酶基因(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(Bacillus subtilis alkaline protease gene)或短小芽孢杆菌木糖苷酶基因(Bacillus pumilus xylosldase gene)的启动子、或λ噬菌体的PR或PL启动子、大肠杆菌（E.>
作为能在哺乳动物细胞中起作用的启动子的实例，有SV40启动子、MT-1（金属硫蛋白基因）启动子、或腺病毒2主要晚期启动子等。作为能在昆虫细胞中起作用的启动子的实例，有多角体蛋白启动子、P10启动子、苜蓿银纹夜蛾多角体病毒碱性蛋白启动子、杆状病毒极早期基因1启动子、或杆状病毒39K滞早期基因启动子等。作为能在酵母宿主细胞中起作用的启动子的实例，可举出：来自酵母解糖系基因的启动子、乙醇脱氢酶基因启动子、TPI1启动子、ADH2-4c启动子等。作为能在丝状真菌细胞中起作用的启动子的实例，有ADH3启动子或tpiA启动子等。
此外，上述载体中，编码本发明蛋白质的核酸可以根据需要与适当的终止子起作用地连接。含有编码本发明蛋白质的核酸的载体进而还可具有多聚腺苷酸信号序列(例如，来源于SV40或腺病毒5E1b区的那些)、转录增强子序列（例如SV40增强子）等要素。含有L-氨基酸氧化酶的基因的重组载体进而还可具备使该载体能在宿主细胞内进行复制的DNA序列，作为其一例，可举出SV40复制起点（宿主细胞为哺乳类细胞时）。
含有编码本发明蛋白质的核酸的载体进而还可含有筛选标记。作为筛选标记，可举出例如：二氢叶酸还原酶（DHFR）或粟酒裂殖酵母TPI基因等那样的其补体在宿主细胞中欠缺的基因、或例如氨苄西林、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素或潮霉素之类药剂的抗性基因。将编码本发明蛋白质的核酸、启动子、和根据需要的终止子和/或分泌信号序列分别连接，并将其插入适当载体的方法是本领域技术人员周知的。
进而，将含有编码本发明蛋白质的核酸的载体导入适当的宿主，由此可以制作本发明的转化体。导入本发明的载体的宿主细胞只要在细胞内复制本发明的载体则可以是任意细胞。进而，在制作表达本发明蛋白质的转化体时，除了载体的复制，更不用说还必须是能够表达本发明蛋白质的任意细胞。作为这类宿主细胞的实例，可举出：细菌、酵母、真菌和高等真核细胞等。
作为细菌细胞的实例，可举出：杆菌或链球菌等革兰氏阳性菌或大肠杆菌（E. coli）等革兰氏阴性菌。这些细菌的转化可通过原生质体法、或以公知方法使用感受态细胞来进行。作为哺乳类细胞的实例，可举出：HEK293细胞、HeLa细胞、COS细胞、BHK细胞、CHL细胞或CHO细胞等。转化哺乳类细胞、并使导入该细胞的DNA序列表达的方法也是公知的，例如，可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体转染法等。
作为酵母细胞的实例，可举出属于酵母属或裂殖酵母属的细胞，例如，可举出酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)等。作为将重组载体导入酵母宿主的方法，可举出例如：电穿孔法、原生质球法(spheroplast method)、乙酸锂法等。
其它真菌细胞的实例是属于丝状真菌、例如曲霉属、链孢霉、镰刀菌属、或木霉属的细胞。使用丝状真菌作为宿主细胞时，可以通过将DNA构建物整合至宿主染色体、得到重组宿主细胞来进行转化。将DNA构建物整合至宿主染色体可以依照公知方法，例如，通过同源重组或异源重组来进行。
使用昆虫细胞作为宿主时，可以将重组基因导入载体和杆状病毒一同导入昆虫细胞，在昆虫细胞培养上清中得到重组病毒后，进而使重组病毒感染昆虫细胞，从而表达蛋白质。
作为杆状病毒，可以使用例如，感染夜蛾科昆虫的病毒，即，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等。
作为昆虫细胞，可以使用作为草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的卵巢细胞的Sf9、Sf21、作为粉纹夜蛾的卵巢细胞的HiFive(インビトロジェン社制)等。
作为用于制备重组病毒的将重组基因导入载体和上述杆状病毒共同导入昆虫细胞的方法，可举出例如：磷酸钙法或脂质体转染法等。
上述转化体在能够复制本发明载体的条件下、或能够表达本发明蛋白质的条件下，在适当的营养培养基中培养。表达本发明的蛋白质时，从转化体的培养物（包含转化体和培养培养基）中分离纯化本发明蛋白质可以使用通常的蛋白质的分离、纯化方法。例如，本发明的蛋白质在细胞内以溶解状态表达时，在培养结束后通过离心分离回收细胞，悬浊于水系缓冲液后，通过超声波破碎机等破碎细胞，得到无细胞提取液。将该无细胞提取液离心分离，从所得上清，将通常的蛋白质分离纯化方法，即，溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙基氨基乙基(DEAE)琼脂糖等树脂的阴离子交换色谱法、使用S-Sepharose FF(ファルマシア社制)等树脂的阳离子交换色谱法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性色谱法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和色谱法、聚焦色谱法、等电点电泳等电泳法等方法单独或组合使用，可以以纯化标准品的形式得到本发明的蛋白质。
＜L-赖氨酸的定量方法＞
本发明的L-赖氨酸的定量方法如下所述。
检测或定量L-赖氨酸的方法，其包括以下步骤：
（A）在水和氧的存在下保持待测物和本发明蛋白质的步骤；和
（B）检测或定量通过上述蛋白质对L-赖氨酸的氧化酶活性的作用而在反应液中生成的至少一种反应产物的步骤。
本发明的方法中，用作待测物的机体试样只要是可能含有L-赖氨酸的试样，则可以是任何试样。通过对本发明的蛋白质作用于机体试样而产生的某种产物进行定量来测定机体试样中的L-赖氨酸的浓度，由此可以适宜选择机体试样。例如，利用显色剂或荧光剂定量上述产物时，优选为无色水溶液，作为实例可举出血清和血浆等。
利用本发明蛋白质进行的L-赖氨酸(L-Lysine)的氧化反应如以下反应式A所示。
[化1]
本发明的方法中使用的上述蛋白质催化上述式A所示的反应。
步骤（A）
步骤（A）中的本发明蛋白质的混合量适当的是为10 mU/ml（将显示1分钟消耗赖氨酸1μmol的活性的酶量设为1 U）以上，水的混合量可以对应于样品中的赖氨酸浓度适宜确定，例如，可以为5～95%的范围。本发明蛋白质的混合量的上限没有特别限制，在实用上例如可以为100 mU/ml以下。但是，本发明蛋白质的混合量和水的混合量并不意欲限于该范围，可以适宜调整。
进而，除了本发明的蛋白质和水以外，优选还可含有反应用缓冲液。反应用缓冲液的pH只要可确保上述本发明的蛋白质所具有的对L-赖氨酸的底物特异性高的氧化酶活性则没有特别限定，可以考虑对L-赖氨酸的氧化酶活性的最佳pH和对L-赖氨酸的底物特异性的关系而适宜调整。例如，可以由pH1.0～14的范围，考虑各酶的性质而设置为可以确保能检测L-赖氨酸的对L-赖氨酸的氧化酶活性和对L-赖氨酸的高底物特异性的范围。使用以下实施例所示的突变型酶C254I时，考虑能获得对L-赖氨酸的底物特异性高的氧化酶活性的范围，反应用缓冲液的pH可以调整为例如pH6.0～10.5、优选pH6.5～10、进一步优选pH7～9、更进一步优选pH7.0～8.0的范围。
接着，将通过前述混合而得的反应液在氧的存在下保持规定时间。利用本发明蛋白质的L-赖氨酸氧化反应中，如反应式A所示，作为产物，可以与L-赖氨酸脱氨基化产物2-氧代-6-氨基己酸一起获得氨（NH3）和过氧化氢（H2O2）。通过在空气中实施上述反应，上述氧被供给作为反应液中的溶存氧。通常没有必要为了向反应液中供给氧而强制性地向反应液中供给空气等含氧气体。这是因为利用本发明蛋白质的酶反应所需的氧量为微量，通过溶存氧即可充分维持的缘故。用于酶反应的保持时间取决于例如所使用的酶量（本发明的蛋白质量），例如，可以为10分钟～1小时的范围。另外，只要在待测物中存在L-赖氨酸时利用反应式A所示的本发明蛋白质的催化反应能够发生，则用于酶反应的保持温度没有特别限定，在保持期间可以为恒定，或者发生变动。保持温度取决于例如所使用的酶（本发明蛋白质）的最佳温度或在该温度下发挥的对L-赖氨酸的底物特异性，例如，可以从10～60℃的范围选择优选的反应温度，例如，可以为20～55℃的范围、或25～40℃的范围。但是，并不意欲将保持时间和保持温度限定为上述的范围、可根据需要进行适宜调整。
步骤(B)
步骤（B）中，对由步骤（A）中的上述保持后的反应液中存在的本发明蛋白质的作用所致的反应产物的至少一种进行检测或定量。
检测或定量中使用的产物是过氧化氢时，可通过例如使用过氧化物酶反应进行测定的方法等公知方法来检测或定量过氧化氢。使用过氧化物酶反应进行测定时，能够使用的过氧化物酶是可用于过氧化氢的检测或定量的酶即可，可举出例如来源于辣根的过氧化物酶。此外，只要是能成为所使用过氧化物酶的底物，则可用作显色剂，使用来源于辣根的过氧化物酶时，可举出4-氨基安替比林：苯酚等。使用来源于辣根的过氧化物酶的用于过氧化氢的检测或定量的反应如下所示。
[化2]
。
4-氨基安替比林等显色剂或荧光剂可以根据所使用过氧化物酶的种类适宜选择。
利用本发明蛋白质的L-氨基酸氧化酶反应的产物过氧化氢可以使用利用了过氧化氢电极的电流检测型传感器来测定。作为过氧化氢电极，例如，可举出下述传感器，其将以戊二醛固定了过氧化物酶和牛血清白蛋白的膜与二茂铁含有于炭糊中而作为电极使用。
检测或定量中所用的产物为氨时，可以使用氨检测试剂来测定。作为氨检测试剂，可举出例如利用苯酚与次氯酸的组合的靛酚法。具体地，可将样品与苯酚?硝普盐溶液和高氯酸溶液混合而使之显色，测定635 nm的吸光度，由此可检测或定量氨。
检测或定量中所用的产物为L-赖氨酸的脱氨基化产物2-氧代-6-氨基己酸时，可通过使2-氧代-6-氨基己酸与3-甲基-2-苯并噻唑酮肼盐酸盐（3-methyl-2-benzothiazolone hydrazine hydrochloride）反应，对腙（hydrazone）衍生物进行分光定量，从而进行2-氧代-6-氨基己酸的定量。
＜L-赖氨酸的定量用试剂盒＞
进而，本发明还包含L-赖氨酸的检测或定量用试剂盒，其含有本发明的上述蛋白质。
本发明的试剂盒可进一步含有反应用缓冲液、过氧化氢检测试剂、氨检测试剂、和L-赖氨酸的脱氨基化产物即2-氧代-6-氨基己酸的检测试剂的至少一者。
反应用缓冲液用于将反应液中维持为适于利用本发明蛋白质的酶反应的pH。反应用缓冲液的pH只要可确保上述本发明的蛋白质所具有的对L-赖氨酸的底物特异性高的氧化酶活性则没有特别限定，可以考虑对L-赖氨酸的氧化酶活性的最佳pH和对L-赖氨酸的底物特异性的关系而适宜调整。例如，可以由pH1.0～14的范围，考虑各酶的性质而设置为可以确保能检测L-赖氨酸的对L-赖氨酸的氧化酶活性和对L-赖氨酸的高底物特异性的范围。使用以下实施例所示的突变型酶C254I时，考虑能获得对L-赖氨酸的底物特异性高的氧化酶活性的范围，反应用缓冲液的pH可以调整为例如pH6.0～10.5、优选pH6.5～10、进一步优选pH7～9、更进一步优选pH7.0～8.0的范围。
过氧化氢检测试剂是在通过例如显色或荧光来进行过氧化氢的检测时使用。作为过氧化氢检测试剂，可是是例如过氧化物酶与能够作为其底物的显色剂的组合。具体地，可举出辣根过氧化物酶与2-氨基安替比林?苯酚的组合。
作为氨检测试剂，可举出例如利用苯酚与次氯酸的组合的靛酚法。
作为L-赖氨酸的脱氨基化产物2-氧代-6-氨基己酸的检测试剂，可使用例如，使2-氧代-6-氨基己酸与3-甲基-2-苯并噻唑酮肼盐酸盐（3-methyl-2-benzothiazolone hydrazine hydrochloride）反应，对腙（hydrazone）衍生物进行分光定量的方法。
＜酶传感器＞
本发明还包含L-赖氨酸的检测或定量用酶传感器、其含有过氧化氢检测用电极，其中，在上述过氧化氢检测用电极的表面或该表面的附近配置有本发明的蛋白质。
前述检测用电极是过氧化氢检测用电极。过氧化氢检测用电极可以是酶式过氧化氢电极或隔膜式过氧化氢电极。本发明的蛋白质与L-赖氨酸反应而生成过氧化氢，因而可以用过氧化氢检测用电极来检测该过氧化氢。作为酶式过氧化氢电极，例如，可举出下述传感器，其将以戊二醛固定了过氧化物酶和牛血清白蛋白的膜与二茂铁含有于炭糊中而作为电极使用。隔膜式过氧化氢电极是通过隔膜将和过氧化氢反应的电极隔离的类型的电极。
本发明的蛋白质优选配置在检测用电极的表面或检测用电极的附近，在配置于检测用电极的表面时，可以固定或不固定于检测用电极的表面。固定于检测用电极的表面具有可以重复利用本发明传感器的优点。
以下，通过实施例对本发明进行更具体说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例
实施例中，活性测定试剂、L-赖氨酸测定用试剂组合物以如下所述组成制备。测定条件如下所述进行。此外，L-氨基酸氧化酶的活性如下所述进行测定。
（1）L-氨基酸氧化酶活性测定用试剂的制备
[表2]
[表3]
（2）L-氨基酸氧化酶的活性测定方法
L-氨基酸氧化酶活性通过使用表2的显色液以比色法由L-氨基酸的氧化所生成的过氧化氢量求出。使用微板的活性测定中，在显色液100μL中加入表3所示氨基酸的100mM溶液100μL和50μL的酶液，在冰上分配后于30℃反应0、0.5、1、1.5、2、3、4、5小时，用酶标仪测定550nm的吸光度。L-氨基酸氧化酶活性的底物使用表3所示的20种氨基酸（100mM溶液），空白则是替代底物而添加100mM磷酸钙缓冲液（pH 7.0）。
此外，酶纯化中，在使用具有1cm石英杯的吸光计的测定中，反应液的总量为1mL。根据所得吸光度变化，基于下述计算式算出L-赖氨酸氧化酶酶活性。应予说明，上述条件下1分钟给以1微摩尔底物的酶量设为1U。根据所得吸光度变化，基于下述计算式算出L-氨基酸氧化酶的酶活性。
（3）L-氨基酸氧化酶活性的计算式
活性值（U/ml）＝｛ΔOD/min（ΔODtest-ΔODblank）×3.1（ml）×稀释倍率｝/｛13×1.0（cm）×0.1（ml）｝
3.1（ml）：总液量
13：毫摩吸光系数
1.0cm：杯的光路长度
0.1（ml）：酶样品液量。
(4)来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶的酶纯化
（i）假单胞菌属(Pseudomonas sp.)H-8-1-3株的培养方法
作为前培养，将假单胞菌属(Pseudomonas sp.)H8-1-3株接种于5ml的TGY培养基（0.5%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.1%KH2PO4、0.1%D-葡萄糖、pH>
（ii）无细胞提取液的制备
用5mL的TGY培养基对H8-1-3株进行前培养（200rpm、30℃、12小时），将前培养液接种于500mL的TGY培养基中，使用2L坂口烧瓶，在30℃进行2天振荡培养（96rpm）（总量20L）。用大型离心机收集细菌（5000rpm、10分钟、4℃）、用生理盐水（0.9% NaCl）洗涤后，将培养基5L份量的菌体悬浊于100mL的20mM 磷酸缓冲液（pH 7.0）（KPB）中。将100mL的菌体液超声波处理15分钟，将离心分离（8000rpm、20分钟、4℃）所得的上清作为无细胞提取液。
（iii）利用硫酸鱼精蛋白的除核酸处理
在无细胞提取液中加入硫酸鱼精蛋白钠0.5%，进行30分钟搅拌后，用大型离心机分离（3000rpm、10分钟、4℃），得到上清。
（iv）硫酸铵分级
将进行了除核酸处理的无细胞提取液在冰中用搅拌器搅拌，同时以达到30%饱和的方式每次少量地加入粉末状硫酸铵。进行30分钟搅拌后，离心分离（8000rpm、10分钟、4℃）。将上清在冰中搅拌，以达到60%饱和的方式加入粉末状硫酸铵，进行30分钟搅拌后，离心分离。同样地，以达到90%饱和的方式，加入粉末状硫酸铵，离心分离。将由各级分得到的沉淀（0-30%级分、30-60%级分和60-90%级分）悬浊于10ml的20mM KPB（pH 7.0）中，用5L相同的缓冲液（×3次）进行1晩透析。
（v）阴离子交换柱色谱（DEAE-Toyopearl）
将通过20mM KPB平衡化的DEAE-Toyopearl树脂15ml填充于柱，使之吸附透析了的30-60%级分的酶液。用100mL的20mM KPB对柱进行洗涤后，使用20mM KPB 200ml和含500mM NaCl的20mM KPB 200ml，根据梯度缓慢提升NaCl浓度，使酶溶出。使用级分收集器，每管15mL将级分收集于试验管，收集确认到活性的级分，通过相同缓冲液进行1晩透析。
（vi）羟基磷灰石柱色谱（GIGA-PITE）
将通过20mM 磷酸缓冲液平衡化的GIGA-PITE树脂5ml填充于柱，使之吸附酶液。用50mL的20mM KPB对柱进行洗涤后，使用20mM KPB 50ml和500mM KPB 200ml，根据梯度缓慢提升KPB浓度，使酶溶出。将确认到活性的非吸附级分用5L相同缓冲液（×3次）进行1晩透析。
（vii）强离子交换柱色谱（MonoQ HR10/100）
使用中压高效液相色谱（FPLC、柱：用20mM KPB平衡化的MonoQ HR 10/100柱）。在样品环中注入通过超滤（Centricon管）浓缩的酶液200μL，使用20mM KPB和含有0.5mM NaCl的20mM KPB这两种溶剂，通过FPLC的梯度系统使酶溶出。收集各级分（0.5mL）中确认到活性的级分，进行1晩透析。透析后，使用Centricon将酶液浓缩至200μL。
（viii）凝胶过滤色谱（Superdex 200 10/30）
使用中压高效液相色谱（FPLC、柱：用含150mM NaCl的20mM KPB平衡化的Superdex 200 10/30柱。在样品环中注入酶液200μL，使用含150mM NaCl的20mM KPB的溶剂，通过FPLC的系统使酶溶出。收集确认到活性的级分，进行1晩透析。
各纯化步骤的蛋白质量和酶活性示于表4。
[表4]
(5)利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定来源于H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶的分子量
作为电泳凝胶，使用在36%丙烯酰胺 5.25ml、0.68M Tris‐HCL缓冲液（pH 8.8）8.25mL、1% SDS 1.58mL、10% TEMED 187μL、2% APS562.5μL组成的凝胶上重叠36% 聚丙烯酰胺 0.5mL、0.179 M Tris-HCl（pH 6.8）3.5mL、1% SDS 0.5mL、10% TEMED 125μL、2% APS 375μL组成的浓缩凝胶而成的电泳凝胶，将与缓冲液（甘油200μL、1M Tris-HCl（pH 8.0）40μL、水360μL、2-巯基乙醇200μL和10% SDS 200μL）等量混合的纯化酶样品10μL在工作缓冲液（Tris3.0g、甘氨酸 14.1g和SDS 10g）中，以30mA进行电泳，然后用蛋白染色液（CBB 2.5g、甲醇 500mL、乙酸 50mL和水450mL）染色1小时，用脱色液（甲醇：乙酸：水＝3：1：6）脱色直至条带变得鲜明。
分子量标记物（Bio-Rad）使用了磷酸化酸 (97，400)、牛血清白蛋白 (66，267), 醛缩酶(42，200), 碳酸酐酶 (30000)和大豆胰蛋白酶抑制剂 (20000)。
图2示出来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H8-1-3株的L-氨基酸氧化酶（野生型酶）的SDS-PAGE的照片。
（6）来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶的N末端氨基酸序列的确定
将来源于纯化假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶通过Edman分解法从N末端侧起确定8个残基。
（7）来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶基因的克隆
（i）假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的染色体DNA的提取
将假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株接种于TGY培养基3mL，在30℃、200rpm下进行12小时培养。由培养液1mL离心分离菌体（15000rpm、5分钟、4℃），收集细菌。用STE缓冲液（NaCl 0.58g、1MTris-HCl（pH 8.0）1mL和0.5M EDTA（pH8.0）200μL用水定量至100mL）1mL洗涤后，悬浊于相同的缓冲液中。在68℃加热15分钟后，离心分离（15000rpm、5分钟、4℃），除去上清，悬浊于溶菌酶-RNase液（将溶菌酶 5mg、10mg/mL RNase 10mL（1份溶液）溶解于将葡萄糖0.9g、1MTris-HCl（pH8.0）2.5 ml、0.5M EDTA（pH8.0）2mL用超纯水定量至100mL而得的溶液1mL中）300μL。在37℃孵育30分钟后，加入蛋白酶K液 （蛋白酶K 10mg/1液1mL）6μL，轻柔混合，在37℃孵育10分钟。加入N-月桂酰肌氨酸3mg，轻柔混合后，在37℃孵育3小时，轻柔进行苯酚-氯仿处理2次。在上清300μL中加入5M NaCl溶液10μL和乙醇600μL并混合后，进行离心分离（15000rpm、10分钟、4℃）。用70%乙醇洗涤后，风干，溶解于TE缓冲液100μL中，得到目标染色体DNA。
（ii）通过PCR扩增来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶基因
PCR反应液的组成设为：水35μL、10×Ex Taq 缓冲液 5μL、2mM dNTP 5μL、100pmol引物1（5’-ATGAACAANAANAACCGCCACCCSGCCGAC-3’）(SEQ. ID NO：17)1μL、100pmol引物2（5’-TCARTCYGCCAGGGCGATYGGSCCGATYTC-3’） (SEQ. ID NO：18)1μL、模板DNA2μL和Ex Taq 1μL。PCR反应的条件设为：（i）98℃下5分钟、（ii）96℃下10秒钟、（iii）50℃下5秒钟、（iv）60℃下4分钟和直至（ii）进行31个循环。扩增的基因通过琼脂糖凝胶电泳来确认。扩增的基因使用VIOGENE（USA）社的Gel-M凝胶提取试剂盒来提取。
（iii）来源于H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶基因序列的测序
为了对基因的两条链进行测序，使用引物1、引物2、引物3（5’- AGCACGGTAATCGATCTGGA-3’） (SEQ. ID NO：19)和、引物4（5’- CATCGAGTGCCAGTTGCACG-3’） (SEQ. ID NO：20)进行测序反应。反应液组成为1.6μL的各引物、1.6μL的模板DNA、1μL的BigDye预混液、1.6μL的5×BigDye 测序缓冲液和2.8μL的灭菌水，总量设为10μL。PCR反应的条件设为：（i）96℃下2分钟、（ii）96℃下10秒钟、（iii）50℃下5秒钟、（iv）60℃下4分钟、（v）（ii）～（iv）进行25次 和（vi）72℃下5分钟。在PCR产物中加入1μL的3M 乙酸钠（pH 5.2）、1μL的0.125M EDTA和25μL的乙醇，在室温放置15分钟后，通过离心分离（15000rpm、8分钟、4℃）使之沉淀。弃去上清后，加入10μL的 Hi Di Formamide，在100℃加热5分钟后，用冰水急冷，将所得物用ABI PRISM 310 Genetic Analyzer进行碱基序列的解读。所得的序列数据的分析通过Genetyx进行，将通过各引物扩增的片段的碱基序列连接。图3示出根据来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶（野生型酶）的碱基序列预测的一维结构。
（iv）来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶基因对大肠杆菌（E.coli JM 109）的转化
连接反应的组成为：PCR产物 5μL、pT7 Blue T-Vecter （Novagen）1μL、Ligation Mix（Takara）6μL，在16℃下反应30分钟。在大肠杆菌（E.coli JM 109）的感受态细胞100μL中加入12μL连接反应液，通过热休克法进行转化。挑选数株在含有80μg/mL氨苄西林的LB培养基（1.0% 多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物和1.0% NaCl）中培育的菌落，提取质粒，通过0.7%琼脂糖电泳来确认有无插入。
（8）来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌（E.coli BL21）中的表达
（i）来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶酶基因的扩增
以上述克隆中所得的质粒为模板DNA，进行PCR。PCR反应液的组成设为：水35μL、10×Ex Taq 缓冲液 5μL、2mM dNTP 5μL、100pmol/μL 引物5（5’- TATAATCATATGAACAAGAACAACCGCCA-3’） (SEQ. ID NO：21)1μL、100 pmol/μL引物6 （5’- TATTACTCGAGTCAGTCCGCCAGGGCGATTG-3’） (SEQ. ID NO：22)1μL、模板DNA 100ng和Ex Taq 5unit。引物5和引物6上各自设置有NdeI和XhoI的限制酶切位点。PCR反应的条件设为：（i）98℃下5分钟、（ii）96℃下10秒钟、（iii）50℃下5秒钟、（iv）60℃下4分钟和直至（ii）进行31个循环。
（ii）来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶基因在pET15b载体中的重组与对大肠杆菌（E. coli BL21）的转化
在PCR反应中所得的PCR产物5μL中加入1μL NdeI和1μL XhoI，在37℃孵育1小时，进行限制酶切处理。连接反应是作为5μL DNA、1μL pET15b（进行与扩增基因相同的限制酶切处理）、6μL连接Mix，在16℃下孵育30分钟。将所得连接反应液总量通过热休克法导入大肠杆菌（E. coli BL21）。应予说明，构建表达用质粒，以使本重组大肠杆菌所生成的L-氨基酸氧化酶以N末端侧添加有6×组氨酸标签的融合蛋白的形式生成。
（iii）来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶基因的表达和使用Ni-Sepharose的组氨酸标签6融合酶的纯化
在含有80μg/mL氨苄西林的4L的LB培养基（1.0% 多聚蛋白胨、0.5% 酵母提取物、1.0% NaCl、pH 7.0）中接种重组大肠杆菌（BL21），在37℃下进行12小时培养后，添加0.5mM IPTG，继续在30℃下进行12小时培养，诱导L-氨基酸氧化酶。通过大型离心机收集细菌（5000rpm、10分钟、4℃），用生理盐水（0.9% NaCl）洗涤后，悬浊于100mL的20mM 磷酸缓冲液（pH 7.0）（KPB）中。将100mL的菌体液超声波处理15分钟，将离心分离（8000rpm、20分钟、4℃）所得的上清作为无细胞提取液。使无细胞提取液吸附于用20mM KPB替换的Ni-Sepharose柱，用20mM KPB洗涤柱后，用含有500mM 咪唑的20mM KPB使酶液溶出。
（9）来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶的活性测定
使用分别单独含有表3中的氨基酸的测定试剂来测定纯化酶标准品的酶活性，确认到本酶标准品具有以下的性质：
（a）以L-赖氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸为底物（表5）。对其上述以外的蛋白质构成氨基酸（L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸），L-氨基酸氧化酶未表现出活性。
[表5]
（b）在pH6.5以下的范围仅对L-赖氨酸有作用（图6）。
（10）使用来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶的L-赖氨酸的定量
使用上述（8）(iii)中纯化的、在N末端侧添加有组氨酸标签的L-氨基酸氧化酶标准品，制备上述L-赖氨酸测定用试剂组合物。使用本试剂组合物实施L-赖氨酸测定。作为待测物，制备1～6mM的L-赖氨酸水溶液。
结果，在将L-赖氨酸水溶液作为待测物时确认到反应性，L-赖氨酸浓度和测定数据显示出良好的正相关（参照图7）。
（11）向来源于假单胞菌属（Pseudomonas sp.）H8-1-3株的L-氨基酸氧化酶的基因导入突变
依照以下的步骤，在上述L-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中进行第254位的半胱氨酸的饱和突变，由此制作具有对L-赖氨酸的底物特异性高的氧化酶活性的突变型L-氨基酸氧化酶。
以上述（8）（ii）中构建的、导入有L-氨基酸氧化酶基因的表达用质粒作为模板，进行用于导入突变的PCR。PCR反应使用了QuikChange（R）>
将样品1、样品2各自对大肠杆菌JM109进行转化，用加入了氨苄西林500μg的LB液体培养基5ml在37℃进行12小时培养。培养结束后，通过离心分离机（13000rpm、4℃、5分）对各样品进行细菌收集。对于收集所得的菌体，通过碱微量制备法进行质粒的提取。应予说明，碱微量制备法依照以下步骤进行。（1）将保持质粒DNA的大肠杆菌培养液转移至1.5mL的管中，进行离心操作，以团粒形式回收菌体。（2）对菌体团粒加入100μL的溶液I［25mM Tris-HCl（pH8.0）、10mM EDTA、0.9%葡萄糖］，进行悬浊。（3）加入200μL的溶液II［0.2M NaOH、1% SDS］，将菌体溶解，使蛋白质、核酸成为变性状态。（4）加入150μL的溶液III［3M 乙酸钾、11.5%乙酸］，进行溶液的中和和SDS的除去。通过该操作，染色体DNA、蛋白质成为凝集沉淀物，而质粒DNA保留于溶液部分。（5）通过离心分离从溶液中除去凝集沉淀物，回收含有质粒DNA的溶液。（6）对于所得含有质粒DNA的溶液，进行苯酚?氯仿提取，除去蛋白质。（7）加入质粒溶液的2倍量的乙醇，在干冰上静置5分钟。（8）通过离心操作得到质粒DNA的沉淀。（9）将所得质粒DNA的沉淀溶解于TE［10mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA］中，制为试样。
所得质粒中，将由PCR1得到的产物设为质粒1、由PCR2得到的产物设为质粒2，分别通过热休克法对E. coli BL21(DE3)进行转化。热休克法的步骤如下所述。相对于E.coli BL21(DE3) 50μl，混合各质粒5μl，冰上静置60分钟。然后，在42度进行90秒钟的热休克后，添加LB液体培养基1ml，在37度孵育1小时。涂布于加入了氨苄西林的板上，在37度进行16小时培养。
在96孔深孔板中分配加入了100μl/ml氨苄西林的LB液体培养基，每孔300μl，使用自动菌落挑选仪（colony picker），将所得菌落接种于各孔的培养基中。接种后，使用振荡机，在700rpm、37度培养12小时后，添加20μl的IPTG7.5mM，再次在30度进行12小时的振荡培养。培养后通过离心分离（2500 rpm, 4℃, 20分钟）进行细菌收集。对于各收集的菌体，添加10 mM KPB （pH7.0）200μL，进行悬浊，转移至96孔圆底板，通过8段超声波破碎机进行菌体破碎（输出 3, 30秒钟）。在与上述相同的条件下进行离心分离后，将所得上清作为无细胞提取液。使用无细胞提取液50μL，使用上述活性测定方法，以L-赖氨酸为底物测定比活性。
从这些转化体中对活性显著高的那些进行筛选，结果在由PCR1所得的4000个菌落中得到了175个菌落，在由PCR2所得的500个菌落中得到了50个菌落。
使用所得菌落的上清，再次进行使用对氯汞基苯甲酸盐（PCMB）的活性测定。蛋白质中的SH基与金属离子反应而形成硫醇盐。本反应是可逆的，但平衡通常高度偏向于硫醇盐。Hg2+对SH基具有高亲水性。在具有氧化酶活性或单加氧酶活性的酶中，通过添加PCMB试剂使之偏向于氧化酶活性是本领域技术人员已知的。
如上所述，对添加PCMB的无细胞提取液和无添加的无细胞提取液的活性没有差异的那些进行筛选，结果，在来自PCR1的175个菌落中得到了4个菌落，在来自PCR2的50个菌落中得到了4个菌落。使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ社制)和 DNA Sequencer 310Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムズ社制)，对所得菌落中所含的质粒进行测序。结果，编码区中的第760～762位的碱基序列TGC突变为ATC，根据该突变确认到氨基酸序列中的第254位的半胱氨酸被替换为异亮氨酸。将该突变体酶称为突变型酶C254I。
将由上述筛选结果所得的突变型酶通过上述（8）(iii)所述的方法纯化。如图1所述，野生型酶中，与氧化酶反应相比，单加氧酶反应的比例占大半，而对于纯化的突变型酶C254I，未见PCMB所致的影响，通过HPLC也没有观察到单加氧酶的产物的检出。
对于突变型酶C254I，为了调查反应时的pH的影响，使试剂组合物的pH改变，以L-赖氨酸、L-鸟氨酸、或L-精氨酸为底物，测定各pH下的氧化酶活性。对于各野生型酶和突变型酶，pH所致的影响示于图8。
如图8A所示，野生型酶在pH7.0下，不仅催化L-赖氨酸，而且还催化L-精氨酸、L-鸟氨酸，因此存在为了用野生型酶准确定量L-赖氨酸，必须在pH6.5以下进行反应的限制。另一方面，如图8B所示，突变型酶C254I即使在pH7.0附近也对L-赖氨酸具有高底物特异性，因而可以不依赖于反应体系的pH而特异性地检测L-赖氨酸。进而，如图8所示，pH6.5下的野生型酶的比活性为0.56 U/mg，与之相对，pH7.5下的突变型酶C254I的比活性为2.5 U/mg。突变型酶C254I的氧化酶活性比野生型酶更高。
进而，对于突变型酶C254I，以L-赖氨酸、L-精氨酸和L-鸟氨酸以外的氨基酸为底物，测定氧化酶活性。活性测定试剂和活性测定方法如上述（1）和（2）所示。反应条件设为pH7.0、和30℃。其结果示于图9B。图9A示出野生型酶的结果。
如图9所示，突变型酶C254I对L-精氨酸和L-鸟氨酸不显示活性，并且对其它氨基酸也不显示活性，仅对L-赖氨酸显示出氧化酶活性。本发明的突变型酶对L-赖氨酸显示底物特异性高的氧化酶活性，表明可以特异性地检测L-赖氨酸。
进而，使用上述（8）(iii)中纯化的野生型酶、和上述突变型酶C254I，制备上述的L-赖氨酸测定用试剂组合物。使用本试剂组合物实施L-赖氨酸测定。作为待测物，制备1～10mM的L-赖氨酸水溶液。
结果，在将L-赖氨酸水溶液作为待测物时确认到反应性，L-赖氨酸浓度和测定数据显示出良好的正相关（参照图10）。
进而，对于由上述饱和突变所得的突变体中第254位的半胱氨酸替换为异亮氨酸以外的氨基酸的突变体，也分别测定对L-赖氨酸、L-精氨酸和L-鸟氨酸的氧化酶活性。活性测定试剂和活性测定方法如上述（1）和（2）所示。反应条件设为pH7.0、和30℃。其结果示于表6和7、以及图11和12。
[表6]
[表7]
如表6和图11所示，除了上述突变型酶C254I以外，分别替换为蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸（Tyr）、色氨酸(Trp)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺（Gln）、和脯氨酸(Pro)的突变型酶与野生型酶相比，确认到对L-赖氨酸的氧化酶活性上升的倾向。进而，如表7和图12所示，除了上述突变型酶C254I以外，分别替换为蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸（Tyr）、色氨酸(Trp)、丙氨酸（Ala）、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸（His）、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸（Ser）、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺（Gln）、和脯氨酸(Pro)的突变型酶与野生型酶相比，在将对L-赖氨酸的氧化酶活性设为100%时，它们对L-鸟氨酸和L-精氨酸各自的相对活性低，由此表明这些突变型酶对L-赖氨酸显示出底物特异性高的氧化酶活性。进而，这些氨基酸替换中，对于替换为蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)或丝氨酸(Ser)的突变型酶，与野生型酶相比，L-精氨酸氧化酶活性和L-鸟氨酸氧化酶活性的上述相对活性均低，因而这些突变型酶对L-赖氨酸具有特别高的底物特异性（参照表7、和图12）。进而，替换为酪氨酸或异亮氨酸的突变型酶中，对上述L-鸟氨酸和L-精氨酸各自的氧化酶活性均未检测到，确认到这些酶对L-赖氨酸具有极高的底物特异性（表6和7、以及图11和12）。
进而，由上述饱和突变而得的突变体中，对于第254位的半胱氨酸替换为异亮氨酸以外的氨基酸的突变体，分别以作为构成蛋白质的氨基酸的L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、和L-色氨酸作为底物，进行L-氨基酸氧化酶活性的测定。结果，全部突变型酶中，在以这些氨基酸为底物时，没有检测出L-氨基酸氧化酶活性。另外，在以D-赖氨酸、D-精氨酸、或D-鸟氨酸作为底物时，全部突变型酶中均未检测出L-氨基酸氧化酶活性。
（12）血浆样品的测定
对于上述突变型酶C254I，使用添加有L-赖氨酸、L-鸟氨酸、或L-精氨酸的人血浆样品，进行氧化酶活性的测定。作为人血浆，使用Amicon Ultra 0.5（UFC501096、Millipore），通过16100 ×g、4℃、30分钟的离心分离制备除蛋白液。在制备的人血浆中，以最终浓度达到0、5、10、15、20、25、30、35、40、45μM的方式添加L-赖氨酸、L-鸟氨酸、或L-精氨酸，作为血浆样品。测定试剂的组成和测定方法如上述（1）和（2）所示，反应条件设为pH7.0、和30℃。结果示于图14。应予说明，对于作为比较对象的野生型酶也同样地使用人血浆样品进行氧化酶活性的测定。其结果示于图13。
如图13所示，野生型酶中，虽然可以定量赖氨酸，但对鸟氨酸、精氨酸检测到氧化酶活性。另一方面，突变型酶C254I中，如图14所示，检测到仅对L-赖氨酸的氧化酶活性，可以画出线性的校准曲线。
上述试验例表明，只要使用本发明的突变型酶，即使是混入了L-赖氨酸以外的氨基酸的临床样品，也可以准确地检测或定量L-赖氨酸。
序列表
<110>Toyama Prefecture
<120>新型L-氨基酸氧化酶、L-赖氨酸的测定方法、试剂盒和酶传感器
<130>125258H
<160>27
<170>PatentIn 版本 3.1
<210>1
<211>1683
<212>DNA
<213>假单胞菌属（Pseudomonas sp.）
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1680)
<223>
<400>1
atg aac aag aac aac cgc cac ccg gcc gac ggt aaa aaa ccg atc acc 48
Met Asn Lys Asn Asn Arg His Pro Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ile Thr
1 5 1015
atc ttc ggc ccg gac ttc cct ttt gcc ttc gat gat tgg ctg gaa cac 96
Ile Phe Gly Pro Asp Phe Pro Phe Ala Phe Asp Asp Trp Leu Glu His
202530
ccg gct ggc ctg ggt agc atc cca gcc gcg cgt cat ggt gaa gaa gtg144
Pro Ala Gly Leu Gly Ser Ile Pro Ala Ala Arg His Gly Glu Glu Val
354045
gcg atc gtg ggc gcc ggc atc gcc ggg ctg gtg gcg gcc tac gag ctg192
Ala Ile Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Leu Val Ala Ala Tyr Glu Leu
505560
atg aag ctg ggc ctc aaa ccg gtg gtc tac gag gcg tcg aag atg ggt240
Met Lys Leu Gly Leu Lys Pro Val Val Tyr Glu Ala Ser Lys Met Gly
65707580
ggg cgg ctg cgc tcg cag gcc ttc aac ggc acc gac ggt atc atc gcc288
Gly Arg Leu Arg Ser Gln Ala Phe Asn Gly Thr Asp Gly Ile Ile Ala
859095
gag ctg ggc gga atg cgc ttt ccg gtg tcg tcc acg gcg ttc tac cac336
Glu Leu Gly Gly Met Arg Phe Pro Val Ser Ser Thr Ala Phe Tyr His
100 105 110
tac gtc gac aag ctg ggc ctg gaa acc aag cct ttc ccc aac ccg ctc384
Tyr Val Asp Lys Leu Gly Leu Glu Thr Lys Pro Phe Pro Asn Pro Leu
115 120 125
acc cct gcc tca cgc agc acg gta atc gat ctg gaa ggc cag acc tac432
Thr Pro Ala Ser Arg Ser Thr Val Ile Asp Leu Glu Gly Gln Thr Tyr
130 135 140
tac gcg gaa aaa gcc gcc gac ttg ccg gcc ctg ttc cag gaa gtt acc480
Tyr Ala Glu Lys Ala Ala Asp Leu Pro Ala Leu Phe Gln Glu Val Thr
145 150 155 160
gat gcc tgg gcc gac gcc ctg gaa agc ggt gcg cgc ttt ggt gac atc528
Asp Ala Trp Ala Asp Ala Leu Glu Ser Gly Ala Arg Phe Gly Asp Ile
165 170 175
cag caa gca att cgt gac cgt gac gtg cct cgc ttg aaa gaa ctg tgg576
Gln Gln Ala Ile Arg Asp Arg Asp Val Pro Arg Leu Lys Glu Leu Trp
180 185 190
aac acc ctg gtg ccg ctg tgg gac gac cgc act ttc tac gac ttc gtc624
Asn Thr Leu Val Pro Leu Trp Asp Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Phe Val
195 200 205
gcc acc tcc aaa gcc ttc gcc aaa ctg agt ttc cag cac cgc gaa gtg672
Ala Thr Ser Lys Ala Phe Ala Lys Leu Ser Phe Gln His Arg Glu Val
210 215 220
ttc ggc cag gtg ggc ttc ggc acc ggt ggt tgg gat tcg gac ttc ccc720
Phe Gly Gln Val Gly Phe Gly Thr Gly Gly Trp Asp Ser Asp Phe Pro
225 230 235 240
aac tcg atg ctg gaa atc ttc cgt gtg gtg atg acc aat tgc gac gac768
Asn Ser Met Leu Glu Ile Phe Arg Val Val Met Thr Asn Cys Asp Asp
245 250 255
cac caa cac ctg gtg gtc ggc ggc gtc gag caa gtg ccg cag ggc atc816
His Gln His Leu Val Val Gly Gly Val Glu Gln Val Pro Gln Gly Ile
260 265 270
tgg cgc cat gtg cca gag cgt tgt gcg cac tgg ccc gaa ggt acc agc864
Trp Arg His Val Pro Glu Arg Cys Ala His Trp Pro Glu Gly Thr Ser
275 280 285
ctg agc tcg ctg cac ggc ggt gca ccg cgc acc ggc gtc aag cgc att912
Leu Ser Ser Leu His Gly Gly Ala Pro Arg Thr Gly Val Lys Arg Ile
290 295 300
gcc cgc gcc agc gac ggc cgc ctg gca gtc acc gac aac tgg ggc gac960
Ala Arg Ala Ser Asp Gly Arg Leu Ala Val Thr Asp Asn Trp Gly Asp
305 310 315 320
tgc cgc cat tac gcg gcg gtg ctg acg acc tgc cag agt tgg ctg ctg 1008
Cys Arg His Tyr Ala Ala Val Leu Thr Thr Cys Gln Ser Trp Leu Leu
325 330 335
acc acc cag atc gac tgt gaa gag tcg ttg ttc tcg cag aag atg tgg 1056
Thr Thr Gln Ile Asp Cys Glu Glu Ser Leu Phe Ser Gln Lys Met Trp
340 345 350
atg gcc ctg gac cgc acc cgc tac atg caa tcg tcg aaa acc ttc gtc 1104
Met Ala Leu Asp Arg Thr Arg Tyr Met Gln Ser Ser Lys Thr Phe Val
355 360 365
atg gtc gac cgg ccg ttc tgg aaa gac aaa gac cca gaa acc ggt cgc 1152
Met Val Asp Arg Pro Phe Trp Lys Asp Lys Asp Pro Glu Thr Gly Arg
370 375 380
gac ctg atg agc atg acc ctc acc gac cgg ctg acc cgt ggc acc tac 1200
Asp Leu Met Ser Met Thr Leu Thr Asp Arg Leu Thr Arg Gly Thr Tyr
385 390 395 400
ctg ttc gat aac ggc gac gac aag cca ggg gtg atc tgc ctg tcc tac 1248
Leu Phe Asp Asn Gly Asp Asp Lys Pro Gly Val Ile Cys Leu Ser Tyr
405 410 415
gcg tgg atg agc gat gcc ctg aag atg ctc ccg cac ccg gtg gaa aaa 1296
Ala Trp Met Ser Asp Ala Leu Lys Met Leu Pro His Pro Val Glu Lys
420 425 430
cgc gtg caa ctg gca ctc gat gca ttg aaa aag atc tac ccg aaa acc 1344
Arg Val Gln Leu Ala Leu Asp Ala Leu Lys Lys Ile Tyr Pro Lys Thr
435 440 445
gat atc gcc ggg cat atc atc ggc gac cct att acc att tcc tgg gaa 1392
Asp Ile Ala Gly His Ile Ile Gly Asp Pro Ile Thr Ile Ser Trp Glu
450 455 460
gcc gac ccg cac ttc ctc ggt gca tcc aaa ggc gcg ctg ccg ggc cac 1440
Ala Asp Pro His Phe Leu Gly Ala Ser Lys Gly Ala Leu Pro Gly His
465 470 475 480
tat cgc tac aac cag cgg atg tac gcg cac ttc atg cag gcg cag atg 1488
Tyr Arg Tyr Asn Gln Arg Met Tyr Ala His Phe Met Gln Ala Gln Met
485 490 495
cca gtc gag cag cgt ggc att ttc att gcc ggc gac gac gtg tcg tgg 1536
Pro Val Glu Gln Arg Gly Ile Phe Ile Ala Gly Asp Asp Val Ser Trp
500 505 510
acc ccg gcc tgg gtg gaa ggc gcg gtg cag acc tcg ctc aat gcc gtg 1584
Thr Pro Ala Trp Val Glu Gly Ala Val Gln Thr Ser Leu Asn Ala Val
515 520 525
tgg ggt atc atg aat cac ttt ggt ggc aag acc cac gcg gac aac ccc 1632
Trp Gly Ile Met Asn His Phe Gly Gly Lys Thr His Ala Asp Asn Pro
530 535 540
ggc cct ggc gac gtg ttc gat gag atc ggc caa atc gcc ctg gcg gac 1680
Gly Pro Gly Asp Val Phe Asp Glu Ile Gly Gln Ile Ala Leu Ala Asp
545 550 555 560
tga 1683
<210>2
<211>560
<212>PRT
<213>假单胞菌属（Pseudomonas sp.）
<400>2
Met Asn Lys Asn Asn Arg His Pro Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ile Thr
1 5 1015
Ile Phe Gly Pro Asp Phe Pro Phe Ala Phe Asp Asp Trp Leu Glu His
202530
Pro Ala Gly Leu Gly Ser Ile Pro Ala Ala Arg His Gly Glu Glu Val
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Ala Ile Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Leu Val Ala Ala Tyr Glu Leu
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<213>Pseudomonas fluorescens Pf-5
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Phe Gly Gln Val Gly Phe Gly Thr Gly Gly Trp Asp Ser Asp Phe Pro
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260 265 270
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275 280 285
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485 490 495
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<213>Pseudomonas fluorescens
<400>8
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202530
Pro Ala Gly Leu Gly Ser Ile Pro Ala His Ser His Gly Ala Glu Val
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Ala Ile Val Gly Ala Gly Ile Ala Gly Leu Val Ala Ala Tyr Glu Leu
505560
Met Lys Leu Gly Leu Lys Pro Val Val Tyr Glu Ala Ser Lys Met Gly
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Gly Arg Leu Arg Ser Gln Ala Phe Asn Gly Ala Glu Gly Val Ile Ala
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<213>Pseudomonas fluorescens Pf0-1
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202530
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225 230 235 240
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260 265 270
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275 280 285
Leu Lys Ser Leu His His Gly Ala Pro Arg Ser Gly Val Lys Lys Ile
290 295 300
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305 310 315 320
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<212>PRT
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<210>14
<211>553
<212>PRT
<213>Gordonia amarae NBRC 15530
<400>14
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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<211>549
<212>PRT
<213>Roseobacter denitrificans OCh 114
<400>15
Met Lys Pro Val Thr Val Phe Gly Pro Asp Phe Pro Phe Ala Tyr Asp
1 5 1015
Asp Trp Ile Ala His Pro Asp Gly Leu Ala Thr Leu Pro Ala Ala Ala
202530
His Gly Ala His Val Ala Ile Ile Gly Ala Gly Ala Ala Gly Val Ile
354045
Ala Gly Tyr Glu Leu Met Lys Leu Gly Leu Cys Pro Ile Leu Phe Glu
505560
Pro Gly Gln Phe Gly Gly Arg Leu Arg Ser Gln Pro Phe Glu Gly Ala
65707580
Glu Gly Val Ile Ala Glu Leu Gly Gly Met Arg Phe Pro Val Ser Ser
859095
Thr Gly Phe Tyr His Tyr Val Asp Leu Leu Gly Ile Gln Ser Lys Pro
100 105 110
Phe Pro Asn Pro Leu Thr Pro Ala Ala Gly Ser Thr Val Ile Asp Leu
115 120 125
Leu Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Gln Thr Leu Gln Asp Leu Pro Pro Leu
130 135 140
Phe His Glu Val Ala Gln Ala Tyr Asp Ala Ala Leu Glu Gln Glu Ala
145 150 155 160
Asn Phe Ser Ala Leu Lys Gln Ala Ile Arg Asp Arg Asp Ile Pro Arg
165 170 175
Ile Lys Glu Ile Trp Asn Pro Ile Val Thr Ala Trp Asp Glu Arg Thr
180 185 190
Phe Tyr Asp Phe Val Ala Ser Ser Glu Ala Phe Lys Lys Leu Thr Phe
195 200 205
His His Arg Glu Val Phe Gly Gln Val Gly Phe Gly Thr Gly Gly Trp
210 215 220
Asp Ser Asp Phe Pro Asn Ser Met Leu Glu Ile Leu Arg Val Asn Val
225 230 235 240
Thr Glu Cys Asp Asp His Gln Arg Tyr Met Val Gly Gly Val Glu Gln
245 250 255
Val Pro Arg Lys Leu Trp Gln His Lys Pro Asp Arg Leu Val His Trp
260 265 270
Pro Ala Gly Thr Ser Leu Arg Ser Leu Asn Asp Gly Ala Thr Arg Ser
275 280 285
Gly Ala Lys Arg Ile Arg Arg Leu Asp Ala Gly Gln Ile Glu Val Thr
290 295 300
Asp Ala Trp Gly Arg Ala Glu Gly Phe Asp Ala Val Leu Val Thr Cys
305 310 315 320
Gln Thr His Leu Leu Ser Thr Gln Ile Asp Thr Glu Glu Ser Leu Phe
325 330 335
Ser Gln Asp Leu Trp Met Ala Leu Asp Arg Thr Arg Tyr Met Gln Ser
340 345 350
Ala Lys Thr Phe Val Met Val Asp Arg Pro Phe Trp Lys Asp Lys His
355 360 365
Pro Val Thr Gly Arg Asp Thr Met Ser Met Thr Leu Thr Asp Arg Met
370 375 380
Thr Arg Gly Thr Tyr Leu Phe Asp Asn Gly Pro Asp Lys Pro Ser Val
385 390 395 400
Ile Cys Leu Ser Tyr Ala Trp Met Thr Asp Ala Leu Lys Val Leu Pro
405 410 415
Leu Pro Val Glu Gln Arg Val Glu Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys
420 425 430
Ile Tyr Pro Asp Val Asp Ile Arg Ser His Ile Leu Gly Asp Pro Ile
435 440 445
Thr Val Ser Trp Glu Ala Asp Gln Asn Phe Leu Gly Ala Phe Lys Gly
450 455 460
Ala Leu Pro Gly His Tyr Arg Tyr Asn His Arg Met Phe Gly His Phe
465 470 475 480
Val Gln Ser Asp Met Pro Ala Arg Glu Arg Gly Ile Phe Leu Ala Gly
485 490 495
Asp Gly Val Ser Trp Thr Pro Ala Trp Val Glu Gly Ala Val Gln Thr
500 505 510
Ser Leu Asn Ala Val Ala Gly Ile Ile Ala His Phe Gly Gly Thr Pro
515 520 525
Ser Pro Ala Asn Pro Ser Pro Leu Glu Ala Tyr Glu Lys His Gly Pro
530 535 540
Val Arg Leu Ser Ala
545
<210>16
<211>560
<212>PRT
<213>Mycobacterium abscessus ATCC 19977
<400>16
Met Thr Ser Leu Leu Pro Gly Ala Asp Asn Ala Ile Lys Pro Val Ser
1 5 1015
Ile Phe Gly Pro Asp Phe Pro Phe Glu Phe Asp Ala Trp Ile Ser His
202530
Pro Asp Gly Leu Gly Gln Val Pro Glu Ala Ala Phe Gly Gln Glu Val
354045
Ala Ile Ile Gly Ala Gly Ile Ala Gly Met Val Ala Ala Tyr Glu Leu
505560
Met Lys Leu Gly Leu Arg Pro Val Leu Tyr Glu Ser Ala Arg Ile Gly
65707580
Gly Arg Leu Arg Ser Gln Gln Phe Asp Gly Ala Pro Glu Gly Val Ile
859095
Ala Glu Leu Gly Gly Met Arg Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Phe Phe
100 105 110
His Tyr Val Asp Met Leu Gly Leu Thr Ala Lys Pro Phe Pro Asn Pro
115 120 125
Leu Thr Pro Ala Ala Gly Ser Thr Val Ile Asp Ile Glu Gly Val Thr
130 135 140
His His Ala Arg Ala Ile Asp Glu Leu Pro Gln Ile Phe Gln Glu Val
145 150 155 160
Ala Glu Ala Trp Ala Glu Ala Leu Glu Glu Val Ser Phe Thr Pro Val
165 170 175
Gln Asp Ala Ile Arg Ala Arg Asp Ala Val Thr Leu Lys Ser Leu Trp
180 185 190
Asn Gln Leu Val Thr Glu Trp Asp Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Phe Val
195 200 205
Ala Ser Ser Lys Ala Phe Ser Lys Leu Ser Phe His His Arg Glu Val
210 215 220
Phe Gly Gln Val Gly Phe Gly Thr Gly Gly Trp Asp Ser Asp Phe Pro
225 230 235 240
Asn Ser Met Leu Glu Ile Leu Arg Val Val Met Thr Asn Cys Asp Glu
245 250 255
Asp Gln Gln Leu Ile Val Gly Gly Ala Glu Gln Val Pro Arg Gly Leu
260 265 270
Trp Thr Tyr Glu Pro Asp Ser Met Cys His Trp Pro Arg Gly Thr Thr
275 280 285
Leu Ala Lys Leu His Arg Gly Val Pro Arg Ser Arg Val Lys Arg Ile
290 295 300
Ala Arg Gly Pro His Gly Gln Leu Ser Val Thr Asp Gln Trp Gly Val
305 310 315 320
Thr Arg Asp Tyr Pro Ala Val Leu Ala Thr Cys Gln Ser Trp Leu Leu
325 330 335
Thr Thr Glu Ile Asp Cys Asp Glu Ser Leu Phe Ser Gln Lys Met Trp
340 345 350
Thr Ala Leu Asp Arg Thr Arg Tyr Met Gln Ser Ser Lys Thr Phe Val
355 360 365
Leu Val Asp Arg Pro Phe Trp Lys Asp Val Asp Pro Val Thr Gly Arg
370 375 380
Asp Thr Met Ser Met Thr Leu Thr Asp Arg Met Thr Arg Gly Thr Tyr
385 390 395 400
Phe Phe Asp Asn Gly Asp Asp Ala Pro Ala Val Val Cys Leu Thr Tyr
405 410 415
Ser Trp Met Ser Asp Ala Met Lys Val Leu Pro Tyr Ser Ala Gln Asp
420 425 430
Arg Ala Asp Met Ala Leu Asn Ala Leu Lys Arg Ile Tyr Pro Gln Val
435 440 445
Asp Ile Asn Gln His Ile Val Gly Glu Pro Ile Ser Val Ser Trp Glu
450 455 460
Ala Asp Arg Asn Phe Leu Gly Ala Phe Lys Gly Ala Leu Pro Gly His
465 470 475 480
Tyr Arg Tyr Asn His Arg Met Tyr Ser His Phe Met Gln Asp Gln His
485 490 495
Glu Ala Gly His Arg Gly Ile Phe Leu Ala Gly Asp Asp Val Ser Trp
500 505 510
Thr Pro Ala Trp Ala Glu Gly Ala Val Gln Thr Ala Leu Asn Ala Val
515 520 525
Trp Gly Ile Met Thr His Phe Gly Gly Gly Ser Ser Thr Arg Asn Pro
530 535 540
Gly Pro Gly Asp Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Leu Lys Leu Pro Glu
545 550 555 560
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工序列的描述: 合成 DNA
<220>
<221>少见的特征（misc_feature）
<222>(9)..(9)
<223>n is a, c, g or t.
<220>
<221>少见的特征（misc_feature）
<222>(12)..(12)
<223>n is a, c, g or t.
<400>17
atgaacaana anaaccgcca cccsgccgac30
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工序列的描述: 合成 DNA
<400>18
tcartcygcc agggcgatyg gsccgatytc30
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工序列的描述: 合成 DNA
<400>19
agcacggtaa tcgatctgga 20
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工序列的描述: 合成 DNA
<400>20
catcgagtgc cagttgcacg 20
<210>21
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工序列的描述: 合成 DNA
<400>21
tataatcata tgaacaagaa caaccgcca 29
<210>22
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工序列的描述: 合成 DNA
<400>22
tattactcga gtcagtccgc cagggcgatt g31
<210>23
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工序列的描述: 合成 DNA
<220>
<221>少见的特征（misc_feature）
<222>(16)..(17)
<223>n is a, c, g or t.
<400>23
gtggtgatga ccaatnnsga cgaccaccaa cac33
<210>24
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工序列的描述: 合成 DNA
<220>
<221>少见的特征（misc_feature）
<222>(16)..(17)
<223>n is a, c, g or t.
<400>24
gcggtgctga cgaccnnsca gagttggctg ctg33
<210>25
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工序列的描述: 合成 DNA
<220>
<221>少见的特征（misc_feature）
<222>(16)..(17)
<223>n is a, c, g or t.
<400>25
aagccagggg tgatcnnsct gtcctacgcg tgg33
<210>26
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工序列的描述: 合成 DNA
<220>
<221>少见的特征（misc_feature）
<222>(16)..(17)
<223>n is a, c, g or t.
<400>26
catgtgccag agcgtnnsgc gcactggccc gaa33
<210>27
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人工序列的描述: 合成 DNA
<220>
<221>少见的特征（misc_feature）
<222>(16)..(17)
<223>n is a, c, g or t.
<400>27
accacccaga tcgacnnsga agagtcgttg ttc33
机译： 新型L-氨基酸氧化酶，L-赖氨酸，试剂盒和酶传感器的测定方法
机译： 新型L-氨基酸氧化酶，L-赖氨酸，试剂盒和酶传感器的测定方法
机译： 新型L-氨基酸氧化酶，L-赖氨酸的测定方法，试剂盒和酶传感器
