一种提高含虾青素转基因番茄产量和转基因番茄中虾青素含量的方法

摘要

本发明提供一种提高含虾青素转基因番茄产量和转基因番茄中虾青素含量的方法，包括播种、施肥、遮阴、标记、果实采后处理、冻干、含量测定步骤，以含虾青素的转基因番茄为研究材料，使转基因番茄在全光照下生长，并在花期喷施0.02％的番茄灵溶液。提供喷施0.02％的番茄灵溶液提高虾青素工程番茄的虾青素含量的方法，以及用全光照生长提高虾青素工程番茄产量的方法。本发明具有方法简单，操作性强等优点，可为虾青素工程番茄的虾青素高积累技术及产业化带来较高的经济效益。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种提高虾青素工程番茄产量和虾青素含量的方法。 

背景技术

虾青素(Astaxanthin)是一种具有超强抗氧化活性的次生类胡萝卜素，虾青素又称“虾黄素”，是一种从从河蟹虾外壳、牡蛎、鲑鱼及藻类、真菌中发现的一种特殊的红色类胡萝卜素，具有保护血管和眼睛，抗辐射、抗衰老、预防老年痴呆和癌症等功效，在药品、食品、化妆品、水产饲料添加剂等领域具有广泛的应用价值。天然虾青素常为某些海洋微生物和少量酵母菌作为次生代谢产物在体内合成，但由于提取技术难度高及受藻种或菌种自身问题等限制，普遍存在虾青素产量低、成本高等缺点，使天然虾青素产量有限。国内外学者对虾青素已进行了许多研究，主要集中在其功能及应用前景(曹秀明等，2011；Goswami G等，2010)、生物积累(耿予欢等，2009；李晓梦等，2006)和提取工艺(黄贤刚等，2009；刘宏超等，2011)等方面。 

目前，国际上已具备的虾青素生产工艺主要有化学合成和生物技术提取，化学合成的虾青素在结构、功能、应用和安全性等方面较天然虾青素均逊色不少，因此进行大规模生产一般倾向于天然虾青素的提取(肖素荣等，2011)。雨生红球藻培养法，法夫酵母发酵法，虾壳浸提法都具备实现天然虾青素产业化的潜力，但由于技术难度高及受藻种或菌种自身问题等限制，普遍存在虾青素产量低、成本高等缺点(阎毅等，2011)，使天然虾青素产量有限，价格高，其保健品的价格更是堪比黄金，大部分人难以承受。相比较而言，番茄是理想的虾青素加工厂，番茄中的β-胡萝卜素与虾青素同属于类胡萝卜素，化学结构相似。因此，中国科学院昆明植物研究所黄俊潮研究员对微藻虾青素的合成途径及催化关键步骤的限速酶基因作了全面的比较分析(Huang JC等，2012)，解决了限制高等植物合成虾青素的关键问题，并成功研制出能高产虾青素的工程番茄新品种，其果实能累积与雨生红球藻相近含量的虾青素。更重要的是，番茄作为经济植物可实现规模化生产，每亩年产量可达2万斤，且耕作简单、成本低，因而含虾青素的转基因番茄是理想的虾青素加工厂。现有技术中未见有改善栽培措施，提高含虾青素 的转基因番茄中的虾青素含量的方法的报道。 

发明内容

本发明旨在解决现有技术中存在的上述问题，提供一种提高含虾青素转基因番茄产量和番茄中虾青素含量的方法。本发明以含虾青素的转基因番茄为研究材料，进行不同的栽培实验处理，提供喷施0.02％的番茄灵溶液提高含虾青素转基因番茄的虾青素含量的方法，以及用全光照生长提高含虾青素工程番茄产量的方法。本发明具有方法简单，操作性强等优点，可为虾青素工程番茄的虾青素高积累技术及产业化带来较高的经济效益。 

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案： 

一种提高含虾青素转基因番茄产量和转基因番茄中虾青素含量的方法，包括播种、施肥、遮阴、标记、果实采后处理、冻干、含量测定步骤，其特征在于使转基因番茄在全光照下生长，并在花期喷施0.02％的番茄灵溶液。 

具体地方法是先将转基因番茄种子播种，2个月后将小苗移栽在地里，按下表对番茄进行喷施番茄灵、遮阴处理； 

  1号 2号 3号 4号 喷施番茄灵溶液 不喷施 0.02％ 不喷施 0.02％ 遮阴网 无 无 遮光度80％ 遮光度80％ 整枝措施 双杆整枝 双杆整枝 双杆整枝 双杆整枝

然后，随机选取每个处理的20-50株番茄，打上标记，待番茄进入结果期，对已标记的每株番茄上的每个果实也打上标记，以便得到每株总产量，最后由每个处理的20-50株的总量来计算平均单株产量，并以分批采摘不同处理的成熟果实作为比较虾青素含量的材料； 

果实采后处理：每次摘取不同处理的成熟果实各3-5个，重复3次，将果实清洗、去谛，放入温度为-20℃的冰柜中冷冻48小时以上，果实冻实后，将果取出在避光的条件下自然化冻，在这一低温冷冻过程中，细胞液会因为膨胀而突破细胞壁，在化冻过程中自然流出，脱去鲜果65-70％的水分，然后用搅拌机破碎果肉，并使用离心机离心，脱去物料60-65％的水分； 

冻干：使用冷冻冻干机对上述已脱水处理的物料进行冷冻干燥，冻干设置为：预冻至-25℃以下，抽真空，开加热(当真空达0.03MPa时，设定为0℃，12小时后可渐进的调到30℃)； 

虾青素含量测定：将冷冻干燥好的样品粉碎、装袋、密封，进行虾青素含量测定，测定采用高效液相色谱法分离，其液相条件：色谱柱为WatersSpherisorb OSD2(5μm,4.6,250mm)，液相型号为Waters(Milford,MA,USA)，进样量为20μl；流动相A相为乙腈/甲醇/Tris-HCL(pH 8.0)，体积比为84:2:14，B相为甲醇/乙酸乙酯，体积比为68:32；以1.2mL/min的流速线性梯度洗脱色素，从100％A相到100％的B相，每个梯度用时15分钟，随后用B相洗脱10分钟，通过比对各颜色组分和标准品的光谱吸收和相对保留时间来鉴定各组分，通过将峰面积的积分值与标准品对比将其转化为浓度值从而对各组分进行定量，标准品购买自sigma公司和Wako公司。 

根据所述的栽培方法，其中所述转基因番茄是保藏号为CGMCC No 9223号的转基因番茄。 

本发明以含虾青素的转基因番茄为研究材料，进行不同的栽培实验处理，提供喷施0.02％的番茄灵溶液提高含虾青素转基因番茄的虾青素含量的方法，以及用全光照生长提高含虾青素工程番茄产量的方法。本发明具有方法简单，操作性强等优点，可为虾青素工程番茄的虾青素高积累技术及产业化带来较高的经济效益。 

具体实施方式

下面用本发明的具体实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。 

实施例1 

1.材料和方法 

1.1研究材料 

将黄俊潮等(Huang JC等，2013)通过基因工程方法将绿藻中筛选和分离到能催化植物细胞中β-胡萝卜素和玉米黄素成虾青素的酮化酶和羟化酶基因转入野生型番茄植株(cv.UC82B)中，得到的转基因番茄(已于2014年5月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No 9223号，分类命名：虾红1号转基因番茄。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号；电话：010-64807355；传真：010-64807288。)种子播种到小盆，出苗后两个月移栽在地里。在保证打芽、整枝、病虫害防治等栽培措施一致，以及水肥充足且基本一致的前提下，根据实验设计，对番茄进行喷施番茄灵，遮阴的不同实验处理。 

随机选取每个处理的30株番茄，做好标记。待番茄进入结果期，对已标记的每株番茄上的每个果实也打上标记，以便得到每株总产量，最后由每个处理的30株的总量来计算平均单株产量。并以分批采摘不同处理的成熟果实为比较虾青素含量的研究材料。 

1.2研究方法 

1.2.1试验安排在温室内，设计四个不同实验处理(表1)。 

表1不同实验处理 

  1号 2号 3号 4号 喷施番茄灵溶液 不喷施 0.02％ 不喷施 0.02％ 遮阴网 无 无 遮光度80％ 遮光度80％ 整枝措施 双杆整枝 双杆整枝 双杆整枝 双杆整枝

1.2.2果实采后处理：每次摘取不同处理的成熟果实各3-5个，重复3次。将果实清洗、去蒂，放入温度为-20℃的冰柜中冷冻48小时以上。果实冻实后，将果取出在避光的条件下自然化冻。在这一低温冷冻过程中，细胞液会因为膨胀而突破细胞壁，在化冻过程中自然流出，脱去鲜果65—70％的水分。然后用搅拌机破碎果肉(以便后期加工)，并使用离心机离心，脱去物料60-65％的水分。 

1.2.3冷冻冻干：使用冷冻冻干机对上述已脱水处理的物料进行冷冻干燥。冻干设置为：预冻至-25℃以下；抽真空；开加热(当真空达0.03MPa时，设定为0℃，12小时后可渐进的调到30℃)。 

1.2.4虾青素含量测定：将冷冻干燥好的样品粉碎、装袋、密封。并委托中科院昆明植物研究所分析测试中心进行虾青素含量测定。测定采用高效液相色谱法分离，其液相条件：色谱柱为WatersSpherisorb OSD2(5μm,4.6,250mm)，液相型号为Waters(Milford,MA,USA)，进样量为20μl。流动相A相为乙腈/甲醇/Tris-HCL(pH 8.0)，体积比为84:2:14，B相为甲醇/乙酸乙酯，体积比为68:32。以1.2mL/min的流速线性梯度洗脱色素，从100％A相到100％的B相，每个梯度用时15分钟，随后用B相洗脱10分钟。通过比对各颜色组分和标准品的光谱吸收和相对保留时间来鉴定各组分。通过将峰面积的积分值与标准品对比将其转化为浓 度值从而对各组分进行定量。标准品购买自sigma公司和Wako公司。 

1.2.5数据分析：所有数据都是使用统计软件SPSS 16.0 for Windows(SPSS Inc.,Chicago,USA)进行分析，不同处理间(内)的差异比较采用单因素方差分析和LSD检验。所有统计图用SigmaPlot 10.0 for windows(Systat SoftwareInc.,city,USA)绘制。 

2.结果与讨论 

2.1不同实验处理的平均单株产量(表2) 

表2不同实验处理的平均单株产量 

  1号 2号 3号 4号 平均单株产量(kg) 10.99±0.15a 11.20±0.51a 2.90±0.13b 4.37±0.53c

表中数据为平均值±标准误(n＝30)，同一行中不同字母表示有显著性差异(P≤0.05)。 

实验结果表明，80％遮阴会严重影响含虾青素转基因番茄的产量，生长在全光照下的转基因番茄的平均产量是10.99千克/株，而生长在80％遮阴条件下的转基因番茄的平均产量是2.9千克/株(表2)。番茄是一种喜阳植物，具有较高的光合作用潜力和较高的光饱和点，生长在强光下的番茄叶片比生长在弱光环境下的番茄叶片具有较高的光合作用能力。由于番茄的产量和番茄植株的光合作用密切相关，生长在强光下的番茄能合成更多的碳水化合物，用于番茄果实的生长和发育，所以80％遮阴降低转基因番茄产量的主要原因是因为遮阴限制了其光合作用能力，使得番茄果实的生长和发育受到限制。 

喷施番茄灵对全光照下生长的含虾青素转基因番茄的产量没有影响，但是能提高80％遮阴含虾青素转基因番茄的产量。喷施番茄灵后，80％遮阴含虾青素转基因番茄的产量由2.9千克/株增加到4.37千克/株(表2)。番茄灵(对氯苯氧乙酸)是一种苯酚类植物生长调节剂，它可以防止落花、落果。喷施0.02％的番茄灵溶液可以提高座果率，进而增加80％遮阴含虾青素转基因番茄的产量。 

2.2不同实验处理的虾青素含量 

本实验还研究了喷施0.02％的番茄灵溶液对含虾青素转基因番茄中的虾青素含量的影响，喷施番茄灵后，全光照条件下和80％遮阴下生长的含虾青素转基 因番茄中的虾青素含量都有较大的提高(表3)。番茄果实在完全成熟后，三种类胡萝卜素(番茄红素、β-胡萝卜素和叶黄素)含量达到最高值(程孙亮等，2007)。由于番茄灵具有催熟作用，喷施番茄灵可能会提高番茄中类胡萝卜素的含量，而类胡萝卜素是虾青素合成的前体，所以喷施番茄灵可以作为一种提高含虾青素转基因番茄中的虾青素含量的方法。 

表3不同实验处理的虾青素含量 

表中数据为平均值±标准误(n＝3)。 

3.最佳技术方案 

根据上述实验结果可知，含虾青素转基因番茄在全光照生长，并在花期喷施0.02％的番茄灵溶液会提高番茄产量和虾青素含量，将这两种条件结合起来能获得含最多量的虾青素。