JNK信号转导通路的细胞可渗透性肽抑制剂用于治疗各种疾病的应用

摘要

本发明涉及蛋白激酶抑制剂用于治疗与JNK信号传导强烈相关的各种疾病或者病症的应用，更具体地涉及蛋白激酶c-Jun氨基末端激酶的抑制剂、JNK抑制剂序列、嵌合肽或者编码它们的核酸以及包含它们的药物组合物用于治疗与JNK信号传导强烈相关的各种疾病或者病症的应用，其中这些疾病或病症选自自身免疫性病症、心血管疾病、癌疾病、糖尿病——包括I型或II型、炎性疾病、脱发——包括斑秃、肺病、神经元或者神经变性疾病、肝病、脊柱疾病、子宫疾病、病毒感染的疾病和抑郁症。

说明书

本申请是分案申请，原申请的申请日为2009年6月2日、申请号为 200980130207.8(PCT/EP2009/003935)、发明名称为“JNK信号转导通路的细胞可 渗透性肽抑制剂用于治疗各种疾病的应用”。

本发明涉及蛋白激酶抑制剂用于治疗与JNK信号传导强烈相关的各种疾病或 者病症的应用，更具体地涉及蛋白激酶c-Jun氨基末端激酶的抑制剂、JNK抑制剂 序列、嵌合肽或者编码它们的核酸以及包含它们的药物组合物用于治疗与JNK信 号传导强烈相关的各种疾病或者病症的应用，其中这些疾病或病症选自自身免疫 性病症、心血管疾病、癌疾病、糖尿病——包括I型或II型、炎性疾病、脱发— —包括斑秃、肺病、神经元或者神经变性疾病、肝病、脊柱疾病、子宫疾病、病 毒感染的疾病和抑郁症。

c-Jun氨基末端激酶(JNK)是促分裂原活化蛋白(MAP)激酶的应激激活组的成 员。这些激酶涉及控制细胞的生长和分化，更一般地说，涉及细胞对环境刺激的 应答。应答环境应激(environmental stress)和通过若干类别的细胞表面受体的参 与，JNK信号转导通路被激活。这些受体可以包括细胞因子受体、蛇形受体 (serpentine)和受体酪氨酸激酶。在哺乳动物细胞中，JNK也涉及生物过程，例 如致癌性转化和调节对环境应激的适应性应答。JNK也与调节免疫应答相关，包 括免疫细胞的成熟和分化，以及影响被免疫系统识别进行破坏的细胞中的程序性 细胞死亡。这种特有的性质使得JNK信号传导成为开发药物干涉的有希望的靶标。 在数种神经性病症当中，JNK信号传导特别涉及缺血性发作和帕金森病，但是也 涉及以下进一步提到的其它疾病。而且，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38α显 示出通过拮抗JNK-cJun-通路负性调节细胞增殖。因此，促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)p38α在抑制正常和癌细胞增殖中显示是活性的，并且进一步证明JNK参 与到了癌疾病(参见，例如Hui等,Nature Genetics,Vol39,No.6,June2007)。也显 示c-Jun N-末端激酶(JNK)参与由脊神经结扎(SNL)产生的神经性疼痛，其中SNL 诱导了JNK特别是JNK1的缓慢和持续的活化，而在SNL后，在脊髓小胶质细胞 中发现p38促分裂原活化蛋白激酶活化，其到21天已经下降到接近基础水平 (Zhuang等,The Journal of Neuroscience,March 29,2006,26(13):3551-3560))。

JNK信号传导通路的抑制或中断——特别是JNK信号传导通路的抑制剂的提 供——因此表现为抗击(combat)与JNK信号传导强烈相关病症的有希望的方法。 然而，到目前为止只知道几种JNK信号传导通路的抑制剂。

JNK信号通路的抑制剂在现有技术中是已知的，具体地包括例如上游激酶抑 制剂(例如，CEP-1347)、小的化学JNK抑制剂(SP600125和AS601245)——其例如 通过与蛋白激酶的ATP结合位点竞争直接影响激酶活性、以及JNK与其底物 (D-JNKI和I-JIP)之间的相互作用的肽抑制剂(参见，例如，Kuan等人，Current Drug  Targets–CNS&Neurological Disorders,February2005,vol.4,no.1,pp.63-67(5))。

上游激酶抑制剂CEP-1347(KT7515)是混合谱系激酶家族的半合成抑制剂。在 抑制营养停止后原代胚培养物和分化的PC12细胞中以及在用1-甲基-4-苯基-四氢 吡啶处理的小鼠中的C-Jun氨基末端激酶(JNK)活化的剂量下，CEP-1347(KT7515) 促进神经元存活。进一步地，CEP-1347(KT7515)可促进培养的鸡胚背根神经节、 交感神经、睫状和运动神经元的长期存活(参见，例如，Borasio等人，Neuroreport. 9(7):1435-1439,May11^th1998)。

发现小的化学JNK抑制剂SP600125降低C-Jun磷酸化的水平，以防止多巴胺 能神经元凋亡，并部分恢复C57BL/6N小鼠中MPTP诱导的PD中的多巴胺的水平 (Wang等人，Neurosci Res.2004Feb；48(2)；195-202)。这些结果进一步表明JNK通 路是MPTP体内的神经毒性作用的主要介质，并且抑制JNK的活性可为治疗PD 提供新的和有效的策略。

小的化学抑制剂的进一步实例是前述的JNK-抑制剂AS601245。在脑缺血后， AS601245抑制了JNK信号传导通路，并促进细胞的存活。在体内，AS601245对 在暂时性全面缺血的沙鼠模型中的海马CA1神经元的延迟损失提供了重要的保 护。这种作用通过JNK抑制以及因此c-Jun表达和磷酸化作用进行调节(参见，例 如Carboni等人,J Pharmacol Exp Ther.2004Jul；310(1):25-32.Epub2004Feb26^th)。

第三类JNK信号传导通路的抑制剂代表前面所提到的JNK和其底物之间的相 互作用的肽抑制剂。作为构建这种JNK抑制剂肽的起点，可以使用天然出现的JNK 蛋白的序列比对。一般而言，这些蛋白包括JNK结合结构域(JBD)，并在多种胰岛 素结合(IB)蛋白诸如IB1或IB2中出现。这种示例性序列比对的结果是例如IB1 [SEQ ID NO:13]、IB2[SEQ ID NO:14]、c-Jun[SEQ ID NO:15]和ATF2[SEQ ID NO:16] 的JNK结合结构域之间的序列比对(参见例如，序列图1A-1C)。该比对揭示了部 分保守的8个氨基酸序列(参见例如，图1A)。IB1和IB2的JBD的比较进一步揭 示了在这两个序列之间高度保守的7个和3个氨基酸的2个区段。

例如，在WO01/27268或WO2007/031280中公开了基于这种比对构建的序列。 WO2007/031280和WO01/27268公开了小细胞可渗透性融合肽，其包括衍生自 HIV-TAT蛋白的基础运输序列的所谓的TAT细胞渗透序列和IB1的最小的20个氨 基酸抑制序列。这两个成分共价地互相连接。WO2007/031280和WO01/27268公 开的MAPK-JNK信号传导通路的示例性(目前仅有)的抑制剂是例如L-JNKI1(由L 氨基酸组成的JNK-抑制剂肽)或者蛋白酶耐性的D-JNKI1肽(由非天然的D氨基 酸所组成的JNK抑制剂肽)。这些JNK-抑制剂(JNKI)肽对JNK(JNK1、JNK2和JNK3) 是特异性的。与上面所讨论的那些小的化合物抑制剂相比，WO2007/031280或 WO01/27268中的抑制剂序列例如JNKI1更适合抑制JNK与其底物之间的相互作 用。通过其衍生自TAT的运输序列，融合肽被有效地转运进入细胞中。由于通过 运输成分所得到的新特性，融合肽被有效地转运进入细胞中，在细胞中，它们将 保持有效直到蛋白水解降解。

然而，根据WO2007/031280或WO01/27268的肽只在特定有限数量的疾病— —特别是在非恶性或者免疫相关的细胞增殖疾病——中显示为有活性的。

因此，本发明的一个目的是进一步鉴定疾病，所述疾病可以用JNK抑制剂肽 抗击。本发明的另一个目的是提供新的JNK抑制剂肽和其衍生物用于那些疾病和 仍然不知道或已知道与JNK信号传导强烈相关的疾病的治疗。

这种目的通过在制备用于治疗对象中与JNK信号传导强烈相关的各种疾病的 药物组合物中使用JNK抑制剂序列解决，所述JNK抑制剂序列优选地为在本文定 义的JNK抑制剂序列，一般包括长度小于150个氨基酸，其中与对象中JNK信号 传导强烈相关的疾病或病症优选地选自——但不限于此——自身免疫性疾病、心 血管疾病、癌疾病、糖尿病——包括I型或II型、炎性疾病、脱发——包括斑秃、 肺病、神经元或神经变性疾病、肝病、脊柱疾病、子宫疾病、病毒感染疾病和抑 郁症。

根据一个优选的实施方式，自身免疫性疾病选自自身免疫性疾病其包括但不 限于狼疮、红斑狼疮和斯耶格伦综合征。

根据进一步优选的实施方式，心血管疾病选自心脏病和冠心病、动脉硬化、 中风、腹主动脉的扩张诸如肾动脉瘤高血压(infrarenal aneurism hypertension)和心肌 梗死。

根据另一个优选的实施方式，癌疾病选自卡波西肉瘤、急性粒细胞白血病— —包括红白血病、黑素瘤、恶性黑素瘤、结肠癌、淋巴瘤、肉瘤、胚细胞瘤、肾 癌、消化道肿瘤、神经胶质瘤、前列腺肿瘤、膀胱癌、直肠癌、胃癌、食道癌、 胰腺癌、肝癌、乳腺癌(＝乳腺癌)、子宫癌、宫颈癌、急性骨髓性白血病(AML)、 急性淋巴白血病(ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病 (CLL)、肝癌、不同病毒诱导的肿瘤诸如例如乳头状瘤病毒诱导的癌(例如，子宫颈 癌＝宫颈癌)、腺癌、疱疹病毒诱导肿瘤(例如，伯基特淋巴瘤、EBV-诱导的B细 胞淋巴瘤)、乙型肝炎诱导的肿瘤(肝细胞癌)、HTLV-1-和HTLV-2-诱导的淋巴瘤、 听神经神经鞘瘤、肺癌(lung carcinomas)(＝肺癌(lung cancer)＝支气管癌(bronchial  carcinoma))、小细胞肺癌、咽喉癌、肛门癌、成胶质母细胞瘤、直肠癌、星细胞瘤、 脑瘤、视网膜母细胞瘤、底细胞癌、脑转移瘤、成神经管细胞瘤、阴道癌、睾丸 癌、甲状腺癌、何杰金综合征、脑膜瘤、Schneeberger病、功能性垂体瘤、蕈样肉 芽肿病、类癌瘤、神经细胞瘤、spinalioma、伯基特淋巴瘤、喉癌、肾癌、胸腺瘤、 子宫体癌、骨癌、非何杰金淋巴瘤、尿道癌、CUP综合征、头/颈肿瘤、少突胶质 细胞瘤、外阴癌、肠癌、直肠癌、食管肿瘤(＝食道癌)、瘤状况(wart conditions)、 小肠肿瘤、颅咽管瘤、卵巢肿瘤、软组织肿瘤、卵巢癌(＝卵巢肿瘤)、胰腺癌 (pancreatic carcinoma)(＝胰腺癌(pancreatic cancer))、子宫内膜、肝转移、阴茎癌、 舌癌、胆囊癌、白血病、浆细胞瘤、眼睑肿瘤、前列腺癌(＝前列腺肿瘤)等，或 者传染病，选自流行性感冒、疟疾、SARS、黄热病、AIDS、莱姆疏螺旋体病(Lyme  borreliosis)、利什曼病、炭疽和脑膜炎。

根据进一步优选的实施方式，炎性疾病选自：肺的炎症或者肺病——包括急 性呼吸衰竭综合症(ARDS)或肺纤维化，组织的炎症——包括但不限于，纤维化组 织的形成——包括纤维囊泡症、脑膜炎，和移植物排斥或移植排斥反应。

根据另一个优选的实施方式，肺病选自：肺的炎症或者肺病——包括但不限 于急性呼吸衰竭综合症(ARDS)、涉及呼吸系统的慢性病——包括哮喘、慢性阻塞 性肺疾患(COPD)、肺炎和肺纤维化。

根据一个优选的实施方式，神经元疾病或神经变性疾病选自但不限于：阿耳 茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、张力障碍、癫痫、视神经疾病— —包括青光眼、眼感染、多发性硬化、脑膜炎、由神经系统病症或疾病引起的神 经元疾病或者病症或神经系统病症或疾病——包括轴突的“切断”或破裂诸如轴 索显微外科术、疼痛特别是神经性疼痛、中风——包括缺血性发作和病毒性脑病。

根据进一步优选的实施方式，肝病选自但不限于：肝炎和肝毒性。

根据另一个优选的实施方式，脊柱疾病选自但不限于：腰椎间盘突出症。

根据一个优选的实施方式，子宫疾病选自但不限于：子宫内膜异位。

根据进一步优选的实施方式，病毒(感染性)疾病选自或者由选自以下的病毒引 起——但不限于：HSV、卡波西肉瘤、尖锐湿疣、传染性软疣、登革热、三日热、 埃博拉病毒、感冒、初夏脑膜脑炎(ESME)、带状疱疹、肝炎、单纯疱疹病毒I型、 单纯疱疹病毒II型、带状疱疹、流感病毒、日本脑炎、拉沙热、马尔堡病毒、麻 疹、手足口病、单核细胞增多症、腮腺炎、诺瓦克病毒感染、传染性单核细胞增 多症、天花、脊髓灰质炎(小儿麻痹症)、假格鲁布、传染性红斑、狂犬病、疣、西 尼罗河热、水痘、细胞巨化病毒(CMV)、正痘天花病毒、正痘亚天花病毒、绵羊 副痘病毒(parapox ovis virus)、传染性软疣病毒、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹 病毒、疱疹B病毒、水痘带状疱疹病毒、伪狂犬病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病 毒6、人疱疹病毒7、爱泼斯坦－巴尔病毒、人疱疹病毒8、乙型肝炎病毒、基孔 肯雅病毒、奥恙思恙病毒、风疹病毒、丙型肝炎病毒、GB病毒C、西尼罗河病毒、 登革热病毒、黄热病病毒、羊跳跃病病毒、圣路易脑炎病毒、日本乙型脑炎病毒、 波瓦森病毒、FSME病毒、SARS-相关冠状病毒、人冠状病毒229E、人冠状病毒 Oc43、环曲病毒、人类T淋巴细胞病毒I型、人类T淋巴细胞病毒II型、HIV(AIDS) 即人免疫缺陷病毒1型或人免疫缺陷病毒2型、拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑 膜炎病毒、塔卡里伯病毒、胡宁病毒、马丘坡病毒、波尔那病毒、布尼亚病毒、 加利福尼亚脑炎病毒、裂谷热病毒、沙蝇热病毒、托斯卡纳病毒、克里米亚－刚 果出血热病毒、哈扎拉病毒、凯山病毒、汉坦病毒、汉城型病毒、希望山病毒、 普马拉病毒、多布拉伐-贝尔格莱德病毒、图拉病毒、辛诺柏病毒、维多利亚湖马 尔堡病毒、扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒、象牙海岸埃博拉病毒、甲型流 感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、 呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、水泡性口炎印第安纳病毒、狂犬病病毒、莫科拉 病毒、杜温哈格病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒1+2、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒、腺 病毒A-F、人乳头状瘤病毒、湿疣病毒6、湿疣病毒11、多瘤病毒、腺相关病毒2、 轮状病毒、或环状病毒、水痘——包括水痘带状疱疹，和疟疾病毒。

根据另一个优选的实施方式，抑郁症选自但不限于：严重抑郁病症——也称 为严重抑郁症(major depression)、单相抑郁症、临床抑郁症、或单纯性抑郁症、双 相抑郁症、躁狂症和躁狂抑郁症。

由于在本技术领域中已知的JNK抑制剂序列仅证明对于有限数量的疾病的有 用性，因此如本文定义的JNK抑制剂序列可以被用于和适合于治疗与上述JNK信 号传导强烈相关的疾病或病症是一个令人惊奇的结果。这对于现有技术既不是显 而易见，也没有被现有技术暗示，即使一般而言根据本技术领域已知JNK抑制剂 序列。

一般而言，如以上限定的JNK抑制剂序列可以源于人或大鼠IB1序列，优选 地源自于由依照SEQ ID NO:102(描述大鼠的IB1cDNA序列和其预测的氨基酸序 列)、SEQ ID NO:103(描述由rIB1基因的外显子-内含子边界——剪接供体——编 码的大鼠的IB1蛋白质序列)、SEQ ID NO:104(描述智人(Homo sapiens)的IB1蛋 白质序列)或SEQ ID NO:105(描述智人的IB1cDNA序列)的序列的任一种限定或 编码的氨基酸序列，更优选地来自于由依照SEQ ID NO:104(描述智人的IB1蛋白 质序列)或SEQ ID NO:105(描述智人的IB1cDNA序列)的序列任一种限定或编码 的氨基酸序列，或者来自其任何片段或者变体。换句话说，JNK抑制剂序列包括 人或大鼠IB1序列的片段、变体或者这类片段的变体。人或大鼠IB序列分别由依 照SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列 限定或编码。

优选地，如本文使用的这种JNK抑制剂序列包括小于150个氨基酸残基的总 长度，优选地为5个到150个氨基酸残基的范围，更优选地为10个到100个氨基 酸残基，特别更优选地为10个到75个氨基酸残基，和最优选地为15个到50个 氨基酸残基，例如10个至30个、10个至20个或者10个至15个氨基酸残基的范 围。

更优选地，这种JNK抑制剂序列和以上的范围可以选自任一的上述序列，特 别更优选地选自根据SEQ ID NO:104限定的或者由SEQ ID NO:105编码的氨基酸 序列，特别更优选地为在SEQ ID NO:105的第420和第980位核苷酸之间的区域 中，或者SEQ ID NO:104的第105和第291位氨基酸之间的区域中，最优选地为 在SEQ ID NO:105的第561和647位核苷酸之间的区域中，或者SEQ ID NO:104 的第152和第180位氨基酸之间的区域中。

根据具体的实施方式，如本文使用的JNK抑制剂序列一般结合JNK和/或抑 制至少一种JNK活性转录因子的活化，例如c-Jun或ATF2(分别参见例如SEQ ID  NOs:15和16)或Elk1。

同样地，如本文使用的JNK抑制剂序列优选地包括或者由根据SEQ ID NO:1 至4、13至20和33至100、或者其片段、衍生物或者变体的任一个的至少一种 氨基酸序列组成。更优选地，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包含根据SEQ ID  NO:1至4、13至20和33至100或者其变体、片段、或衍生物的1个、2个、3 个、4个或甚至更多个拷贝的氨基酸序列。如果以多于一个拷贝存在，那么如本使 用的根据SEQ ID NO:1至4、13至20和33至100或者其变体、片段、或衍生物 的这些氨基酸序列可在没有任何连接序列情况下或经过连接序列直接地彼此连 接，所述连接序列包括1至10、优选1至5个氨基酸。形成连接序列的氨基酸优 选地选自甘氨酸或脯氨酸作为氨基酸残基。更优选地，如本文使用的，根据SEQ ID  NO:1至4、13至20和33至100或者其片段、变体或者衍生物的这些氨基酸序 列可通过二个、三个或更多个的脯氨酸残基的铰合部彼此分开。

如本文使用的JNK抑制剂序列可由L-氨基酸、D-氨基酸或两者的组合组成。 优选地，如本文使用的JNK抑制剂序列包括至少1个或者甚至2个D-氨基酸和/ 或L-氨基酸，优选至少3、4或5个，更优选至少6、7、8或9个，和甚至更优选 至少10个或更多个D-和/或L-氨基酸，其中，在如本文使用的JNK抑制剂序列中， D-和/或L-氨基酸可以以模块(blockwise)、非模块或交替的方式排列。

根据一个优选的实施方式，如本文使用的JNK抑制剂序列可完全地由L-氨基 酸组成。如本文使用的JNK抑制剂序列然后可包括或由根据SEQ ID NO:1或3的 至少一种“天然的JNK抑制剂序列”组成。在该情况中，术语“天然的”或“天 然的JNK抑制剂序列(一个或多个)”是指如本文使用的根据SEQ ID NO:1或3 任一个的未改变的JNK抑制剂序列，完全地由L-氨基酸组成。

因此，如本文使用的JNK抑制剂序列可包括或者由以下组成：至少一种(天然 的)氨基酸序列NH₂-X_n^b-X_n^a-RPTTLXLXXXXXXXQD-X_n^b-COOH(L-IB通用的(s)) [SEQ ID NO:3]和/或IB1XRPTTLXLXXXXXXXQDS/TX(L-IB(通用的))[SEQ ID  NO:19]的JNK结合结构域(JBD)。在该情况下，每一个X一般表示一个氨基酸残 基，优选地选自任何的(天然)氨基酸残基。X_n^a一般表示一种氨基酸残基，优选地 选自除了丝氨酸或苏氨酸之外的任何氨基酸残基，其中n(X的重复数量)是0或1。 此外，每一个X_n^b可选自任何的氨基酸残基，其中n(X的重复数量)是0-5、5-10、 10-15、15-20、20-30或更多，条件是如果X_n^a的n(X的重复数量)是0，那么X_n^b优选地在其C-末端不包括丝氨酸或苏氨酸，以避免丝氨酸或苏氨酸在该位置。优 选地，X_n^b代表衍生自SEQ ID NO:1或3的肽残基的连续的一段序列(contiguous  stretch)。X_n^a和X_n^b可以表示D或L氨基酸。另外，如本文使用的JNK抑制剂序 列可以包括或由选自以下的至少一种(天然)氨基酸序列组成：IB1 DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT(L-IB1)[SEQ ID NO:17]的JNK结合结构域。更 优选地，如本文使用的JNK抑制剂序列进一步可以包括或由至少一种(天然)氨基 酸序列NH₂-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH(L-IB1(s))[SEQ ID NO:1]组成。此 外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包括或由选自以下的至少一种(天然)氨基 酸序列组成：IB1L-IB1(s1)(NH₂-TLNLFPQVPRSQD-COOH,SEQ ID NO:33)； L-IB1(s2)(NH₂-TTLNLFPQVPRSQ-COOH,SEQ ID NO:34)；L-IB1(s3) (NH₂-PTTLNLFPQVPRS-COOH,SEQ ID NO:35)；L-IB1(s4) (NH₂-RPTTLNLFPQVPR-COOH,SEQ ID NO:36)；L-IB1(s5) (NH₂-KRPTTLNLFPQVP-COOH,SEQ ID NO:37)；L-IB1(s6) (NH₂-PKRPTTLNLFPQV-COOH,SEQ ID NO:38)；L-IB1(s7) (NH₂-RPKRPTTLNLFPQ-COOH,SEQ ID NO:39)；L-IB1(s8) (NH₂-LNLFPQVPRSQD-COOH,SEQ ID NO:40)；L-IB1(s9) (NH₂-TLNLFPQVPRSQ-COOH,SEQ ID NO:41)；L-IB1(s10) (NH₂-TTLNLFPQVPRS-COOH,SEQ ID NO:42)；L-IB1(s11) (NH₂-PTTLNLFPQVPR-COOH,SEQ ID NO:43)；L-IB1(s12) (NH₂-RPTTLNLFPQVP-COOH,SEQ ID NO:44)；L-IB1(s13) (NH₂-KRPTTLNLFPQV-COOH,SEQ ID NO:45)；L-IB1(s14) (NH₂-PKRPTTLNLFPQ-COOH,SEQ ID NO:46)；L-IB1(s15) (NH₂-RPKRPTTLNLFP-COOH,SEQ ID NO:47)；L-IB1(s16) (NH₂-NLFPQVPRSQD-COOH,SEQ ID NO:48)；L-IB1(s17) (NH₂-LNLFPQVPRSQ-COOH,SEQ ID NO:49)；L-IB1(s18) (NH₂-TLNLFPQVPRS-COOH,SEQ ID NO:50)；L-IB1(s19) (NH₂-TTLNLFPQVPR-COOH,SEQ ID NO:51)；L-IB1(s20) (NH₂-PTTLNLFPQVP-COOH,SEQ ID NO:52)；L-IB1(s21) (NH₂-RPTTLNLFPQV-COOH,SEQ ID NO:53)；L-IB1(s22) (NH₂-KRPTTLNLFPQ-COOH,SEQ ID NO:54)；L-IB1(s23) (NH₂-PKRPTTLNLFP-COOH,SEQ ID NO:55)；L-IB1(s24) (NH₂-RPKRPTTLNLF-COOH,SEQ ID NO:56)；L-IB1(s25) (NH₂-LFPQVPRSQD-COOH,SEQ ID NO:57)；L-IB1(s26) (NH₂-NLFPQVPRSQ-COOH,SEQ ID NO:58)；L-IB1(s27) (NH₂-LNLFPQVPRS-COOH,SEQ ID NO:59)；L-IB1(s28) (NH₂-TLNLFPQVPR-COOH,SEQ ID NO:60)；L-IB1(s29) (NH₂-TTLNLFPQVP-COOH,SEQ ID NO:61)；L-IB1(s30) (NH₂-PTTLNLFPQV-COOH,SEQ ID NO:62)；L-IB1(s31) (NH₂-RPTTLNLFPQ-COOH,SEQ ID NO:63)；L-IB1(s32) (NH₂-KRPTTLNLFP-COOH,SEQ ID NO:64)；L-IB1(s33) (NH₂-PKRPTTLNLF-COOH,SEQ ID NO:65)；和L-IB1(s34) (NH₂-RPKRPTTLNL-COOH,SEQ ID NO:66)的JNK结合结构域。

另外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包括或者由选自以下的至少一种(天 然)氨基酸序列组成：IB1PGTGCGDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT(IB1-长)[SEQ  ID NO:13]的(长)JNK结合结构域(JBD)、IB2 IPSPSVEEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS(IB2-长)[SEQ ID NO:14]的(长)JNK结合结 构域、c-Jun GAYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGNLKPH(c-Jun)[SEQ ID NO:15] 的JNK结合结构域、ATF2TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV (ATF2)[SEQ ID NO:16]的JNK结合结构域(参见，例如，图1A-1C)。在该内容中， 比对显示部分保守的8个氨基酸序列(参见，例如，图1A)，而IB1和IB2的JBDs 的进一步比较显示两个序列之间高度保守的7个和3个氨基酸的两个区段。

根据另一优选实施方式，如本文使用的JNK抑制剂序列可部分地或全部地由 D-氨基酸组成，如上限定的。更优选地，由D-氨基酸组成的这些JNK抑制剂序列 是上述(天然的)JNK抑制剂序列的非天然的D逆反(retro-inverso)序列。术语“逆反 序列”是指线性肽序列的异构体，其中序列的方向是相反并且每一个氨基酸残基 的手性颠倒(参见，例如Jameson等人,Nature,368,744-746(1994)；Brady等人, Nature,368,692-693(1994))。结合D-对映体和反向合成的优点是在每一个酰胺键中 羰基和氨基的位置被交换，同时在每一个α碳处的侧链基团的位置被保留。除非 另外具体说明，假定通过合成相应的天然L-氨基酸序列或肽的逆向的序列或肽， 根据本发明使用的任何给定L-氨基酸序列或肽可以转化成为D逆反序列或肽。

如本文使用的和如上所定义的D逆反序列具有许多有用的特性。例如，本文 使用的D逆反序列与本文使用的L-氨基酸序列一样有效地进入细胞，然而，本文 使用的D-逆反序列比相应的L-氨基酸序列更稳定。

因此，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包括或者由至少一种根据氨基酸序 列NH₂-X_n^b-DQXXXXXXXLXLTTPR-X_n^a-X_n^b-COOH(D-IB1通用的(s))[SEQ ID NO: 4]和/或XS/TDQXXXXXXXLXLTTPRX(D-IB(通用))[SEQ ID NO:20]的D逆反 序列组成。如在该内容中使用的，X、X_n^a和X_n^b是如上所定义的(优选地，表示D 氨基酸)，其中，X_n^b优选地表示衍生自SEQ ID NO:2或4的连续一段的残基。另 外，如本文使用的JNK抑制剂序列可以包括或由根据包括IB1 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD(D-IB1)[SEQ ID NO:18]的JNK结合结构域 (JBD)的氨基酸序列的至少一种D逆反序列组成。更优选地，如本文使用的JNK 抑制剂序列可以包括或由根据氨基酸序列NH₂-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH (D-IB1(S))[SEQ ID NO:2]的至少一种D逆反序列组成。此外，如本文使用的JNK 抑制剂序列可以包括或者由根据如此氨基酸序列的至少一种D逆反序列组成，所 述氨基酸序列包括以下序列的JNK结合结构域(JBDs)：IB1D-IB1(s1) (NH₂-QPFLNLTTPRKPR-COOH,SEQ ID NO:67)；D-IB1(s2) (NH₂-VQPFLNLTTPRKP-COOH,SEQ ID NO:68)；D-IB1(s3) (NH₂-PVQPFLNLTTPRK-COOH,SEQ ID NO:69)；D-IB1(s4) (NH₂-RPVQPFLNLTTPR-COOH,SEQ ID NO:70)；D-IB1(s5) (NH₂-SRPVQPFLNLTTP-COOH,SEQ ID NO:71)；D-IB1(s6) (NH₂-QSRPVQPFLNLTT-COOH,SEQ ID NO:72)；D-IB1(s7) (NH₂-DQSRPVQPFLNLT-COOH,SEQ ID NO:73)；D-IB1(s8) (NH₂-PFLNLTTPRKPR-COOH,SEQ ID NO:74)；D-IB1(s9) (NH₂-QPFLNLTTPRKP-COOH,SEQ ID NO:75)；D-IB1(s10) (NH₂-VQPFLNLTTPRK-COOH,SEQ ID NO:76)；D-IB1(s11) (NH₂-PVQPFLNLTTPR-COOH,SEQ ID NO:77)；D-IB1(s12) (NH₂-RPVQPFLNLTTP-COOH,SEQ ID NO:78)；D-IB1(s13) (NH₂-SRPVQPFLNLTT-COOH,SEQ ID NO:79)；D-IB1(s14) (NH₂-QSRPVQPFLNLT-COOH,SEQ ID NO:80)；D-IB1(s15) (NH₂-DQSRPVQPFLNL-COOH,SEQ ID NO:81)；D-IB1(s16) (NH₂-FLNLTTPRKPR-COOH,SEQ ID NO:82)；D-IB1(s17) (NH₂-PFLNLTTPRKP-COOH,SEQ ID NO:83)；D-IB1(s18) (NH₂-QPFLNLTTPRK-COOH,SEQ ID NO:84)；D-IB1(s19) (NH₂-VQPFLNLTTPR-COOH,SEQ ID NO:85)；D-IB1(s20) (NH₂-PVQPFLNLTTP-COOH,SEQ ID NO:86)；D-IB1(s21) (NH₂-RPVQPFLNLTT-COOH,SEQ ID NO:87)；D-IB1(s22) (NH₂-SRPVQPFLNLT-COOH,SEQ ID NO:88)；D-IB1(s23) (NH₂-QSRPVQPFLNL-COOH,SEQ ID NO:89)；D-IB1(s24) (NH₂-DQSRPVQPFLN-COOH,SEQ ID NO:90)；D-IB1(s25) (NH₂-DQSRPVQPFL-COOH,SEQ ID NO:91)；D-IB1(s26) (NH₂-QSRPVQPFLN-COOH,SEQ ID NO:92)；D-IB1(s27) (NH₂-SRPVQPFLNL-COOH,SEQ ID NO:93)；D-IB1(s28) (NH₂-RPVQPFLNLT-COOH,SEQ ID NO:94)；D-IB1(s29) (NH₂-PVQPFLNLTT-COOH,SEQ ID NO:95)；D-IB1(s30) (NH₂-VQPFLNLTTP-COOH,SEQ ID NO:96)；D-IB1(s31) (NH₂-QPFLNLTTPR-COOH,SEQ ID NO:97)；D-IB1(s32) (NH₂-PFLNLTTPRK-COOH,SEQ ID NO:98)；D-IB1(s33) (NH₂-FLNLTTPRKP-COOH,SEQ ID NO:99)；和D-IB1(s34) (NH₂-LNLTTPRKPR-COOH,SEQ ID NO:100)。

如本文使用的和如以上公开的JNK抑制剂序列在表1中提供(SEQ ID NO:1-4、 13-20和33-100)。该表提供如本文使用的JNK抑制剂序列的名称、以及它们的序 列标识号、它们的长度以及氨基酸序列。此外，表1分别显示序列以及它们的通 式，例如SEQ ID NO：1、2、5、6、9和11以及SEQ ID NO：3、4、7、8、10和 12。表1进一步地公开嵌合序列SEQ ID NO:9-12和23-32(参见以下)、L-IB1序列 SEQ ID NO:33至66以及D-IB1序列SEQ ID NOs:67至100。

表1

根据另一个优选的实施方式，如本文使用的JNK抑制剂序列包括或由至少一 种如上定义的根据SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的天然的或非天然的氨基酸序 列的变体、片段和/或衍生物组成。优选地，这些变体、片段和/或衍生物保留了如 本文使用的以上公开的天然的或非天然的JNK抑制物序列的生物学活性，特别是 根据SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的天然或非天然氨基酸序列的生物学活性， 即，结合JNK和/或抑制至少一种JNK活性转录因子例如c-Jun、ATF2或Elk1的 活化。可通过多种试验或通过生物物理方法测试功能性，所述试验例如，肽与其 靶分子的结合试验，所述生物物理方法例如光谱、计算机模拟、结构分析等。特 别地，通过亲水性分析(参见，例如，Hopp和Woods,1981.Proc Natl Acad Sci USA78: 3824-3828)可分析如上所限定的JNK抑制剂序列或其变体、片段和/或衍生物，该 亲水性分析可用于识别肽的疏水和亲水区域，因此有助于实验操纵例如结合实验 或抗体合成的底物的设计。也可进行二级结构分析，以识别如本文使用的呈现特 异性结构模体的JNK抑制剂序列或其变体、片段和/或衍生物(参见，例如Chou and  Fasman,1974,Biochem13:222-223)的区域。使用本领域中可用的计算机软件程序， 可实现操纵、翻译、二级结构预测、亲水性和疏水性分布图、开放读框预测和绘 图、以及序列同一性的确定。也可以使用结构分析的其它方法，其包括例如X射 线结晶学(参见，例如Engstrom,1974.Biochem Exp Biol11:7-13)、质谱和气相色谱 法(参见，例如METHODS IN PROTEIN SCIENCE,1997,J.Wiley and Sons,New  York,NY)和计算机模拟(参见，例如Fletterick和Zoller,eds.,1986.Computer Graphics  and Molecular Modeling,In:CURRENT COMMUNICATIONS IN MOLECULAR  BIOLOGY,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。

因此，如本文使用的JNK抑制剂序列可包括或由至少一种根据SEQ ID NO: 1-4、13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的变体组成。在本发明的内 容中，“根据SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列 的变体”优选为衍生自根据SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的任一序列，其中所 述变体包括根据SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的氨基酸序列的氨基酸替代。这 些替代一般包括根据SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的氨基酸的1到20、优选 的1到10、以及更优选的1到5的氨基酸的置换、加成和/或缺失，其中变体显示 出与根据SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的任一序列的至少大约30％、50％、70％、 80％、90％、95％、98％或甚至99％的序列同一性。

如果通过特定氨基酸的置换获得如上定义和本文使用的根据SEQ ID NO:1-4、 13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的变体，则这种置换优选地包括 保守氨基酸置换。保守氨基酸置换可包括具有十分类似的物理化学性质的一组内 的同义氨基酸残基，使得该组成员之间的置换将保留分子的生物学活性(参见，例 如Grantham,R.(1974),Science185,862-864)。对于本领域的技术人员显而易见的 是，在上面所定义的序列中也可插入和/或缺失氨基酸而不会改变它们的功能，特 别是，如果插入和/或缺少仅仅涉及到少量的氨基酸，例如少于20，和优选的少于 10，并且不会去除或取代对于功能活性非常关键的氨基酸。而且，如本文使用的 变体中将避免置换，该置换将导致在容易接近磷酸化酶——优选为激酶——的氨 基酸位置处产生另外的苏氨酸，以便避免在体内或体外失活如本文使用的JNK抑 制剂序列或失活如本文使用的嵌合肽。

优选地，表2中定义了同义氨基酸残基，其可被分类为同一组并通过保守氨 基酸置换一般是可交换的。

表2

如本文使用的SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的变体的特定形式是根据如本 文使用的SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的片 段，与SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100相比较，其一般通过至少一个缺失进行进 行改变。优选地，片段包括SEQ ID NO：1-4、13-20和33-100的任一的至少4个 连续的氨基酸，这是通常足以允许特异性识别来自任一的这些序列表位的长度。 甚至更优选地，片段包括SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的任一的4到18、4 到15、或最优选4到10个连续的氨基酸，其中范围的下限可以是4或5、6、7、 8、9或10。缺失的的氨基酸可发生在SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的任意位 置，优选地在N-或C-末端。

此外，如上所述的根据SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的(天然的或非天然 的)氨基酸序列的片段可定义为如此序列，所述序列与如本文使用的根据SEQ ID  NO:1-4、13-20和33-100的任一序列共有至少大约30％、50％、70％、80％、90％、 95％、98％、或甚至99％的序列同一性。

如本文使用的JNK抑制剂序列可进一步包括或由至少一种如以上定义的根据 SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基酸序列的衍生物组成。 在该内容中，“根据SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的(天然的或非天然的)氨基 酸序列的衍生物”优选为衍生自根据SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的任一序列 的氨基酸序列，其中该衍生物包括至少一种修饰的L-或D-氨基酸(形成非天然的氨 基酸(一种或多种))，优选为1至20个、更优选地为1到10个、和甚至更优选地 为1至5个修饰的L-或D-氨基酸。变体或片段的衍生物也落入本发明的范围内。

在该方面中的“修饰的氨基酸”可以是任意的氨基酸，该氨基酸可例如通过 在各种不同的有机体中的不同的糖基化、通过磷酸化、或通过标记特定的氨基酸 进行改变。然后，这种标记通常选自包括以下的标记：

(i)放射性标记，即，放射性磷酸化或使用硫、氢、碳、氮等的放 射性标记；

(ii)有色染料(例如地高辛等)；

(iii)荧光基团(例如荧光素等)；

(iv)化学发光基团；

(v)用于在固相上固定化的基团(例如His-标签、生物素、strep-标 签、flag-标签、抗体、抗原等等)；和

(vi)(i)到(v)所述的两种或更多种标记的标记组合。

在上文中，具有与本发明的查询氨基酸序列“共有”例如至少95％“序列同 一性”的序列的氨基酸序列意欲指目标氨基酸序列的序列与查询序列完全一样， 除了目标氨基酸序列可包括查询氨基酸序列的每100个氨基酸的多达5个氨基酸 改变。换句话说，为了得到与查询氨基酸序列具有至少95％同一性的序列的氨基 酸序列，目标序列中多达5％(100中的5个)氨基酸残基可用别的氨基酸插入或取 代、或被缺失。

对于不具有准确对应的序列，第一序列的“同一性％”可以相对于第二序列 进行确定。一般而言，待比较的这两个序列进行比对以给出序列之间的最大相关 性。这可包括在一个或两个序列中插入“缺口”，以增强比对的程度。然后，可在 被比较的每一个序列的全长度范围上确定同一性％(所谓的总体对比)，这特别适合 于相同或类似长度的序列，或在较短、限定的长度上确定同一性(所谓局部对比)， 其更适合于不相等长度的序列。

用于比较两个或更多个序列——特别是如在本文使用的——的同一性和同源 性的方法本领域是熟知的。因此，作为例子，在Wisconsin Sequence Analysis Package, version9.1(Devereux et al.,1984,Nucleic Acids Res.12,387-395.)中可获得的程序， 例如程序BESTFIT和GAP，可用于确定两个多核苷酸之间的同一性％，以及两 个多肽序列之间的同一性％和同源性％。BESTFIT使用(Smith和Waterman(1981), J.Mol.Biol.147,195-197.)的“局部同源性”算法，并发现两个序列之间的相似性 最好的单区域。用于确定序列之间的同一性和/或相似性的其他程序也是本领域熟 知的，例如BLAST家族的程序(Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215,403-410)， 通过万维网站ncbi.nlm.nih.gov的NCBI的主页可进入)和FASTA(Pearson(1990), Methods Enzymol.183,63-98；Pearson和Lipman(1988),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S. A85,2444-2448.)。

通过本领域熟知的方法，例如通过如下所讨论的化学合成或通过基因工程方 法，可得到或生成根据本发明使用的和如上定义的JNK-抑制剂序列。例如，通过 使用多肽合成仪，可合成与本文使用的JNK抑制剂序列的一部分相应的肽——其 包括所述JNK抑制剂序列的期望区域，或在生物体外或体内调节期望的活性的肽。

如本文使用的和如以上定义的JNK抑制剂序列可以通过运输序列(trafficking  sequence)进一步地修饰，这允许如本文使用和如以上定义的JNK抑制剂序列被 更有效地转运进入细胞中。这种修饰的JNK抑制剂序列被优选地提供和被用作为 嵌合序列。

因此，根据第二方面，本发明提供一种嵌合肽——其包括至少一个第一结构 域和至少一个第二结构域——在制备用于治疗对象中的如上定义的与JNK信号传 导强烈相关的疾病或病症的药物组合物中的应用，其中嵌合肽的第一结构域包括 运输序列，而嵌合肽的第二结构域包括如上所定义的JNK抑制剂序列，优选地为 根据SEQ ID NO:1-4、13-20和33-100的任一序列或者其衍生物或片段的JNK抑 制剂序列。

一般地，如使用的根据本发明的嵌合肽具有至少25个氨基酸残基的长度，例 如25至250氨基酸残基，更优选为25至200个氨基酸残基，甚至更优选为25至 150个氨基酸残基，25到100个氨基酸残基，以及最优选为25至50个氨基酸残 基。

作为第一结构域，如本文使用的嵌合肽优选地包括运输序列，其一般选自如 此的任意氨基酸序列，该序列指引肽(在该肽中它存在)进入期望的细胞目的地。因 此，如本文使用的运输序列一般指引该肽越过质膜，例如，从细胞外部通过质膜 并进入细胞质。可选地或另外地，通过例如结合两个成分(例如细胞渗透性成分和 细胞核定位成分)或通过具有例如细胞膜转运和靶向例如细胞核内转运的性质的一 个单一成分，该运输序列可指引该肽到细胞内期望的位置，例如细胞核、核糖体、 内质网(ER)、溶酶体、或过氧化物酶体。该运输序列可附加地包括另外的成分， 其能够结合细胞质成分或细胞的任何其它成分或区室(例如内质网、线粒体、高尔 基体、溶酶体囊泡)。因此，例如，第一结构域的运输序列和第二结构域的JNK抑 制剂序列可位于细胞质或细胞的任何其它区室中。这允许在摄取后确定嵌合肽在 细胞中的位置。

优选地，运输序列(被包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)具有5到 150个氨基酸序列的长度，更优选地具有5到100个氨基酸的长度，以及最优选地 为5到50个氨基酸的长度、5到30个氨基酸的长度或甚至5到15个氨基酸的长 度。

更优选地，运输序列(包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)可作为第一 结构域中连续的氨基酸序列延伸中出现。可选地，第一结构域中的运输序列可被 分裂成两个或更多个片段，其中所有这些片段与整个运输序列类似，并可以通过1 到10、优选为1到5氨基酸彼此分隔开，条件是这些运输序列同样地保留如上所 公开的其载体性质。分隔开运输序列片段的这些氨基酸可以例如选自与运输序列 不同的氨基酸序列。可选地，第一结构域可包含由多于一个成分组成的运输序列， 每一成分具有其自身的用于将第二结构域的货物JNK抑制剂序列转运到例如特定 的细胞区室的功能。

如上所定义的运输序列可以由L-氨基酸、D-氨基酸、或两者的组合组成。优 选地，运输序列(包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)可以包括至少1个或 甚至2个，优选为至少3、4或5个，更优选地为至少6、7、8或9个，以及甚至 更优选为至少10个或更多个D-和/或L-氨基酸，其中，D-和/或L-氨基酸在JNK 运输序列中可以以模块化、非模块化或交替的方式排列。

根据一个可选的实施方式，如本文使用的嵌合肽的运输序列可以完全地由L- 氨基酸组成。更优选地，如本文使用的嵌合肽的运输序列包括或由至少一种如上 所定义的“天然的”运输序列组成。在本文中，术语“天然的”是指未改变的运 输序列，完全地由L-氨基酸组成。

根据另一可选的实施方式，如本文使用的嵌合肽的运输序列可完全地由D-氨 基酸组成。更优选地，如本文使用的嵌合肽的运输序列可包括如上所陈述序列的D 逆反肽。

从天然出现的来源可以获得、或通过使用基因工程技术或化学合成可生产如 本文使用的嵌合肽的第一结构域的运输序列(参见，例如，Sambrook,J.,Fritsch,E.F., Maniatis,T.(1989)Molecular cloning:A laboratory manual.2nd edition.Cold Spring  Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。

可以使用的第一结构域的运输序列的来源包括例如天然蛋白质例如TAT蛋白 质(例如，如在美国专利5,804,604和5,674,980中描述的，这些文献中的每一篇通 过引用被并入本文)、VP22(例如在WO97/05265；Elliott和O'Hare,Cell88:223-233 (1997)中描述的)、非病毒蛋白(Jackson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89: 10691-10695(1992))、衍生自触角足的运输序列(例如触角足载体序列)或衍生自碱 性肽的运输序列，例如该肽具有5至15个氨基酸、优选为10到12个氨基酸的长 度，并包括至少80％、更优选85％或甚至更优选90％的碱性氨基酸，例如，诸如 精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸。此外，用作运输序列的天然蛋白质之一的变体、片 段和衍生物一并公开。关于变体、片段和衍生物，其是指本文使用的JNK抑制剂 序列的以上给出的定义。根据上述的如本文使用的JNK抑制剂序列，相应地定义 变体、片段以及衍生物。特别地，在运输序列的内容中，变体或片段或衍生物可 以被定义为如此序列，其与用作为如上定义的运输序列的天然蛋白质之一共有至 少约30％、50％、70％、80％、90％、95％、98％、或甚至99％的序列同一性。

在如本文使用的嵌合肽的优选实施方式中，第一结构域的运输序列包括或由 衍生自人类免疫缺陷病毒(HIV)1TAT蛋白的序列组成，特别是组成TAT蛋白的一 些或所有的86个氨基酸。

对于运输序列(其被包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中)，全长TAT 蛋白的部分序列可以用于形成TAT蛋白的功能有效的片段，即，包括调节进入和 摄取入细胞的区域的TAT肽。至于该序列是否是TAT蛋白的功能有效的片段，可 以使用已知的技术进行确定(例如Franked等人，Proc.Natl.Acad.Sci,USA86: 7397-7401(1989))。因此，在如本文使用的嵌合肽的第一结构中的运输序列可衍生 自TAT蛋白序列的功能有效的片段或部分，其包括小于86个氨基酸，并且其显示 摄取进入细胞，甚至任选地摄取进入细胞核。更优选地，被用作载体以调节嵌合 肽跨越细胞膜的渗透性的TAT的部分序列(片段)意欲包括全长TAT的碱性区域(氨 基酸48到57或49到57)。

根据一个更优选的实施方式，运输序列(被包括在如本文使用的嵌合肽的第一 结构域中)可包括或由包含TAT残基48到57或49到57的氨基酸序列组成，和最 优选为通用的TAT序列NH₂-X_n^b-RKKRRQRRR-X_n^b-COOH(L-通用-TAT(s))[SEQ  ID NO:7]和/或XXXXRKKRRQ RRRXXXX(L-通用-TAT)[SEQ ID NO:21]，其中 X或X_n^b为如上所定义的。此外，SEQ ID NO:8中的“X_n^b”的数量不限于所描述 的，并且可以如上所述地变化。可选地，如本文使用的嵌合肽的第一结构域中包 括的运输序列可以包括或由包含例如氨基酸序列NH₂-GRKKRRQRRR-COOH (L-TAT)[SEQ ID NO:5]的肽组成。

根据另一更优选的实施方式，运输序列(被包括在如本文使用的嵌合肽的第一 结构域中)可包括如上所述的序列的D逆反肽，即，具有序列 NH₂-X_n^b-RRRQRRKKR-X_n^b-COOH(D-通用-TAT(s))[SEQ ID NO:8]和/或 XXXXRRRQRRKKRXXXX(D-通用-TAT)[SEQ ID NO:22]的通用的TAT序列的D 逆反序列。在此，X_n^b也如上所定义(优选地表示D氨基酸)。此外，在SEQ ID NO: 8中，“X_n^b”残基的数目不限于所描述的，并且可如上所述地变化。最优选地，本 文使用的运输序列可包括D逆反序列NH₂-RRRQRRKKRG-COOH(D-TAT)[SEQ  ID NO:6]。

根据另一优选实施方式，被包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中的运 输序列可以包括或由如上所定义的运输序列的变体组成。“运输序列的变体”优选 地是衍生自如上所定义的运输序列的序列，其中所述变体包括修饰，例如，如上 所定义的运输序列中存在的至少一个氨基酸的添加、(内部的)缺失(产生片段)和/ 或取代。这种修饰(一种或多种)一般包括1到20，优选地为1到10，以及最优选 地为1到5个氨基酸的取代、添加和/或缺失。此外，所述变体优选显示出与如上 所定义的运输序列的序列同一性，更优选地与SEQ ID NO:5至8或21-22中的任 一个显示出至少大约30％、50％、70％、80％、90％、95％、98％或甚至99％的序 列同一性。

优选地，被包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中的运输序列的这种修 饰导致了运输序列增加或降低稳定性。可选地，可设计运输序列的变体以调节本 文使用的嵌合肽的细胞内位置。当外源地添加时，一般设计如上所定义的这种变 体，使得运输序列进入细胞的能力被保留(即，运输序列的变体摄取进入细胞与使 用运输序列的天然蛋白质基本相似)。例如，被认为对于核定位很重要的碱性区域 的改变(参见，例如Dang和Lee,J.Biol.Chem.264:18019-18023(1989)；Hauber 等人，J.Virol.63:1181-1187(1989)；等人，J.Virol.63:1-8(1989))可导致运输序 列的胞质定位或部分胞质定位，和因此作为本文使用的嵌合肽的成分的JNK抑制 剂序列的胞质定位或部分胞质定位。除了以上之外，进一步的修饰也可被引入所 述变体中，例如通过连接诸如胆固醇或其它脂质部分到运输序列以产生具有增加 的膜溶解性的运输序列。被包括在如本文使用的嵌合肽的第一结构域中的运输序 列的以上公开的任一变体，可以使用技术人员一般熟知的技术产生(参见，例如 Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.(1989)Molecular cloning:A laboratory manual. 2nd edition.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。

作为第二结构域，如本文使用的嵌合肽一般包括JNK抑制剂序列，其选自如 上定义的任一的JNK抑制剂序列，包括这些JNK抑制剂序列的变体、片段和/或 衍生物。

两个结构域，即，如本文使用的嵌合肽的第一和第二结构域，可连接，诸如 以形成功能单元。本领域熟知的连接第一和第二结结构域的任何方法可以被应用。

根据一个实施方式，如本文使用的嵌合肽的第一和第二结构域优选地通过共 价键连接。如本文定义的共价键可以是诸如肽键，其可通过表达如上定义的嵌入 蛋白作为融合蛋白获得。可以形成如本文描述的融合蛋白，并且以类似于如下所 描述的标准重组DNA技术或者从其容易改进的方式进行使用。然而，两个结构域 也可以经过侧链连接或可以通过化学连接体部分进行连接。

如本文使用的嵌合肽的第一和/或第二结构域可以在所述嵌合肽中以一个或多 个拷贝出现。如果两个结构域都以单拷贝存在，那么第一结构域可连接到第二结 构域的N-末端或C-末端。如果以多拷贝存在，则第一和第二结构域可以以任何可 能的顺序排列。例如，第一结构域可以在本文使用的嵌合肽中以多拷贝数量存在， 例如以2、3或更多拷贝，其优选地以连续的顺序排列。那么，第二结构域可以单 拷贝存在，出现包括第一结构域的序列的N-或C-末端。可选地，第二结构域可以 多拷贝存在，例如以2、3或更多的拷贝，并且第一结构域可以以单拷贝存在。根 据两种可选择的方法，第一和第二结构域可以以连续排列置于任何位置。示例性 的排列下述方式显示：例如，第一结构域–第一结构域–第一结构域–第二结构域； 第一结构域–第一结构域–第二结构域–第一结构域；第一结构域–第二结构域–第一 结构域–第一结构域；或例如，第二结构域–第一结构域–第一结构域–第一结构域。 本领域的技术人员将很好理解，这些实例仅用于说明的目的，而不限制本发明的 范围于此。因此，拷贝的数目和排列可以如最初定义地变化。

优选地，第一和第二结构域可以直接地彼此连接，而没有任何连接体。可选 地，它们可以经由连接体序列互相连接，所述连接体序列包括1到10个、优选地 1到5个氨基酸。形成连接体序列的氨基酸优选地选择甘氨酸或脯氨酸作为氨基酸 残基。更优选地，第一和第二结构域可通过在第一和第二结构域之间的2、3或更 多个脯氨酸残基的铰合部彼此分隔开。

如上所定义和本文使用的嵌合肽——包括至少一个第一结构域和至少一个第 二结构域——可由L-氨基酸、D-氨基酸或两者的组合组成。因此，每一个结构域(以 及使用的连接体)可以由L-氨基酸、D-氨基酸或两者的组合(例如D-TAT和L-IB1(s) 或L-TAT和D-IB1(s)等)组成。优选地，如本文使用的嵌合肽可包括至少1或甚至 2个，优选地为至少3、4或5个，更优选地为至少6、7、8或9个和甚至更优选 地为至少10个或更多个D-氨基酸和/或L-氨基酸，其中，D-和/或L-氨基酸在如本 文使用的嵌合肽中可以以模块、非模块或交替的方式排列。

根据一个具体实施方式，如本文使用的嵌合肽包括或由根据通用的L-TAT-IB 肽NH₂-X_n^b-RKKRRQRRR-X_n^b-X_n^a-RPTTLXLXXXXXXXQD-X_n^b-COOH(L-TAT-IB (通用的)(s))[SEQ ID NO:10]的L-氨基酸嵌合肽组成，其中X、X_n^a和X_n^b优选地 为如上所定义的。更优选地，如本文使用的嵌合肽包括或由L-氨基酸嵌合肽 NH₂-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH(L-TAT-IB1(s))[SEQ  ID NO:9]组成。可选地或附加地，本文使用的嵌合肽包括或由L-氨基酸嵌合肽序 列GRKKRRQRRR PPDTYRPKRP TTLNLFPQVP RSQDT(L-TAT-IB1)[SEQ ID NO: 23]、或XXXXXXXRKK RRQRRRXXXX XXXXRPTTLX LXXXXXXXQD S/TX (L-TAT-IB通用)[SEQ ID NO:24]组成，其中X也优选为如上定义，或者如本文使 用的嵌合肽包括或由L-氨基酸嵌合肽序列 RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD(L-TAT-IB1(s1))[SEQ ID NO:27]、 GRKKRRQRRRX_n^cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD(L-TAT-IB1(s2))[SEQ ID NO:28] 或RKKRRQRRRX_n^cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD(L-TAT-IB1(s3))[SEQ ID NO:29] 组成。在该内容中，每个X一般表示如上定义的氨基酸残基，更优选地X_n^c表示 肽残基的连续一段序列，每个X彼此独立地选自甘氨酸或脯氨酸，例如单调的甘 氨酸一段序列或者单调的脯氨酸一段序列，其中n(X_n^c的重复数量)一般为0-5、 5-10、10-15、15-20、20-30或者甚至更多，优选地为0-5或5-10。X_n^c可以表示D 或L氨基酸。

根据一个可选的具体实施方式，如本文使用的嵌合肽包括或由以上公开的L- 氨基酸嵌合肽的D-氨基酸嵌合肽组成。根据本发明的示例性D逆反嵌合肽是诸如 通用的D-TAT-IB肽 NH₂-Xn^b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn^a-Xn^b-RRRQRRKKR-Xn^b-COOH (D-TAT-IB(通用)(s)),[SEQ ID NO:12]。在此，X、X_n^a和X_n^b优选为如上所定义(优 选地表示D氨基酸)。更优选地，本文使用的嵌合肽包括或由根据TAT-IB1肽 NH₂-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH(D-TAT-IB1(s))[SEQ  ID NO:11]的D-氨基酸嵌合肽组成。可选地或附加地，如本文使用的嵌合肽包括或 由D-氨基酸嵌合肽序列TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTDPPRRRQRRKKRG (D-TAT-IB1)[SEQ ID NO:25]、或 XT/SDQXXXXXXXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX(D-TAT-IB 通用的)[SEQ ID NO:26]组成，其中X也优选为如上定义，或者如本文使用的嵌合 肽包括或由D-氨基酸嵌合肽序列DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKR (D-TAT-IB1(s1))[SEQ ID NO:30]、DQSRPVQPFLNLTTPRKPRX_n^cRRRQRRKKRG (D-TAT-IB1(s2))[SEQ ID NO:31]或DQSRPVQPFLNLTTPRKPRX_n^cRRRQRRKKR (D-TAT-IB1(s3))[SEQ ID NO:32]组成。X_n^c可以是如上定义的。

如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域可以通过化学或生物化学偶联彼此连 接，以本领域中已知的任何合适的方式进行，例如通过在第一和第二域之间建立 肽键，例如通过将第一和第二结构域表达为融合蛋白，或例如通过交联如上定义 的嵌合肽的第一和第二结构域。

许多已知的适合于如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域的化学交联的方法 是非特异性的，即，它们不引导偶联点到运输多肽或货物大分子上的任何具体位 置。结果，非特异性交联剂的使用可能攻击功能位点或空间阻碍活性位点，这使 得缀合蛋白质生物失活。因此，优选地，使用这种交联方法，其允许第一和第二 结构域更特异的偶联。

在该内容中，增加偶联特异性的一种方式是直接化学偶联到在被交联的第一 和第二结构域中的一个或两个都仅出现一次或几次的官能团。例如，半胱氨酸— —其是唯一的包含巯基的蛋白质氨基酸——在许多蛋白质中只出现几次。同样地， 例如，如果多肽不包含赖氨酸残基，那么对伯胺特异性的交联剂对于该多肽的氨 基末端将是选择性的。增加偶联特异性的这种方法的成功应用要求该多肽在分子 区域中具有可以被改变而不丧失分子的生物学活性的适当少且有活性的残基。当 半胱氨酸残基出现在多肽序列部分中——在该部分中它们参与交联反应将另外可 能地干扰生物学活性——的时候，该半胱酸胺残基可以被置换。当半胱酸胺残基 被置换时，一般期望最小化所引起的多肽折叠变化。当置换与半胱氨酸在化学上 和空间上类似时，多肽折叠中的变化将最小化。由于这些原因，丝氨酸优选作为 半胱氨酸的置换物。如在以下的实施例中阐述的，出于交联的目的，半胱氨酸残 基可以被引入多肽的氨基酸序列中。当半胱氨酸残基被引入时，优选在氨基或羧 基末端或附近引入。可使用常规的方法用于该氨基酸序列修饰，其中，通过化学 合成或重组DNA表达产生感兴趣的多肽。

如上定义和本文使用的嵌合肽的第一和第二结构域的偶联也可以经过偶联剂 或结合剂实现。有多种可使用的分子间交联剂(参见，例如，Means和Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS,Holden-Day,1974,pp.39-43)。在这些 当中，试剂是诸如：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)或N,N'-(1,3- 亚苯基)双马来酰亚胺(两者对于巯基都是高度特异性的，并且形成不可逆的键合)； N,N'-1,2-亚乙基-(碘代乙酰胺)或具有6到11个碳亚甲桥的其它这种试剂(它们对于 巯基是相对特异性的)；和1,5-二氟-2,4-二硝基苯(其与氨基和酪氨酸基团形成不可 逆的键合)。用于该目的其它交联剂包括：p,p'-二氟-m,m'-二硝基二苯砜(其与氨基 和酚基团形成不可逆的交联)；二甲基己二亚酰胺化物(dimethyl adipimidate)(其 对于氨基是特异性的)；苯酚-1,4-二磺酰氯(其主要与氨基反应)；1,6-己二异氰酸酯 或二异硫代氰酸酯、或苯偶氮基-对-二异氰酸盐(其主要与氨基反应)；戊二醛(其与 几个不同的侧链反应)和去重氮联苯胺(disdiazobenzidine)(其主要与酪氨酸和组氨 酸反应)。

用于交联如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域的交联剂可以是同双功能 的，即具有进行相同反应的两个官能团。优选的同双功能交联剂是二马来酰亚胺 基己烷(“BMH”)。BMH包括两个马来酰亚胺官能团，其在温和条件(pH6.5-7.7) 下与包含巯基的化合物特异性地反应。该两个马来酰亚胺基团通过烃链连接。因 此，BMH对于包含半胱氨酸残基的多肽的不可逆交联是有用的。

用于交联如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域的交联剂也可以是异双功能 的。异双功能交联剂具有两个不同的官能团，例如氨反应性基团和硫烃反应性基 团，其将分别交联具有自由氨和硫烃的两种蛋白质。异双功能交联剂的实例是琥 珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(“SMCC”)、间-马来酰亚胺苯 甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(“MBS”)和琥珀酰亚胺4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁 酸酯(“SMPB”)、和MBS延伸链类似物。这些交联剂的琥珀酰亚胺基团与伯胺 反应，并且硫烃反应性的马来酰亚胺与半胱胺酸残基的硫烃形成共价键。

适合于交联如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域的交联剂在水中通常具有 低溶解性。亲水部分例如磺酸盐基团因此可加入到交联剂中，以提高其水溶性。 在这方面，Sulfo-MBS和Sulfo-SMCC是水溶性修饰的交联剂的实例，其可以根据 本发明进行使用。

同样地，许多交联剂生成在细胞条件下基本上是不可切割的偶联物。然而， 一些特别适合于交联如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域的交联剂包含共价 键，例如二硫键，其在细胞条件下是可切割的。例如，Traut试剂、二硫代双(琥珀 酰亚胺基丙酸酯)(“DSP”)以及N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(“SPDP”) 都是熟知的可切割的交联剂。可切割交联剂的使用允许货物部分与运输多肽在递 送进入靶细胞后分离。直接的二硫键同样可以是有用的。

包括如上讨论的许多交联剂都是商业可获得的。它们使用的详细说明书从商 业供应商是容易获得的。蛋白质交联和偶联物制备的通常参考文献是：Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING,CRC Press (1991)。

如上定义的嵌合肽的第一和第二结构域的化学交联可以包括间隔臂的使用。 间隔臂提供分子内的柔性或调节偶联部分之间的分子内距离，并因此有助于保持 生物学活性。间隔臂可以为多肽部分的形式，其包括间隔氨基酸，例如脯氨酸。 可选地，间隔臂可以是交联剂的一部分，例如在“长链SPDP”中(Pierce Chem.Co., Rockford,IL.,cat.No.21651H)。

此外，以上所公开的嵌合肽之一的变体、片段或衍生物可以在本文中使用。 相对于片段和变体，它通常是指上面对JNK抑制剂序列所给出的定义。

具体地，在本发明的内容中，“嵌合肽的变体”优选地为衍生自根据SEQ ID  NO:9到12和23到32的任一序列的序列，其中嵌合变体包括如本文使用的根据 SEQ ID NO:9到12和23到32的嵌合肽的氨基酸的改变。这种改变一般包括根据 SEQ ID NO:9到12和23到32的氨基酸的1到20、优选为1到10和更优选为1 到5个的取代、添加和/或缺失(产生片段)，其中如本文使用的改变的嵌合肽显示 出与根据SEQ ID NO:9到12和23到32的任一序列至少大约30％、50％、70％、 80％、或95％、98％、或甚至99％的序列同一性。优选地，这些变体保留了如在本 文使用的嵌合肽包含的第一和第二结构域的生物学活性，即，如上所公开的第一 结构域的运输活性，以及第二结构域的结合JNK和/或抑制至少一个JNK活性转 录因子活化的活性。

因此，如本文使用的嵌合肽也可包括在前所公开的嵌合肽的片段，特别地是 本发明的根据SEQ ID NO:9到12和23到32的任一的嵌合肽序列的片段。因此， 在本发明的内容中，“嵌合肽的片段”优选为衍生自根据SEQ ID NO:9到12和23 到32的任一序列的序列，其中该片段包括SEQ ID NO:9到12和23到32的任一 的至少4个连续的氨基酸。该片段优选地包括足以允许从任一的这些序列中特异 性识别表位和转运该序列进入细胞、核或者进一步优选的位置中的长度。甚至更 优选地，该片段包括SEQ ID NO:9到12和23到32的任一的4到18、4到15、 或最优选地为4到10个连续的氨基酸。如本文使用的嵌合肽的片段进一步可定义 为与根据SEQ ID NO:99到12和23到32的任一的任何序列共有至少大约30％、 50％、70％、80％、或95％、98％、或甚至99％的序列同一性的序列。

最后，如本文使用的嵌合肽也包括在前所公开的嵌合肽的衍生物，特别为根 据SEQ ID NO:9到12和23到32的任一的嵌合肽序列的衍生物。

本发明另外涉及到编码如上定义的JNK抑制剂序列的核酸序列、所有如上定 义的嵌合肽或它们的片段、变体或衍生物在制备用于治疗对象中如本文定义的与 JNK信号传导强烈相关的疾病或病症的药物组合物中的应用。编码如本文使用的 JNK抑制剂序列的优选合适的核酸一般选自人类IB1核酸(GenBank登录号 (AF074091)、大鼠IB1核酸(GenBank登录号AF 108959)、人IB2(GenBank登录号 AF218778)或选自编码如上定义的任一序列的任何核酸序列，即，根据SEQ ID NO: 1-26的任何序列。

通过本领域已知的任何方法(例如，通过使用可杂交到序列的3'-和5'-末端的合 成引物的PCR扩增，和/或通过使用对特定的基因序列特异性的寡核苷酸序列从 cDNA或基因组文库克隆)，可得到编码如本文使用的JNK抑制剂序列或如本文使 用的嵌合肽的核酸。

另外，本文也公开了如此核酸序列，其在严格条件下与编码如上所定义的(天 然的)JNK抑制剂序列或嵌合肽的合适的链杂交。优选地，这些核酸序列包括至少 6个(连续的)核酸，其具有足以允许特异性杂交的长度。更优选地，这些核酸序列 包括6到38个、甚至更优选地为6到30个、以及最优选地6到20或6到10个(连 续的)核酸。

“严格条件”是序列依赖的，并且在不同的环境下将是不同的。一般而言， 严格的条件可选择为在限定的离子强度和PH下低于特定序列的热熔点(TM)大约5 ℃。该TM是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和PH 下)。一般地，严格条件将是其中在PH为7下，盐浓度为至少大约0.02摩尔以及 温度至少大约为60℃的那些。由于其他的因素可影响杂交的严格性(包括碱基组成 和互补链的大小等)、有机溶剂的存在和碱基错配的程度，所以参数的组合比任何 一个的绝对量度更重要。

“高度严格性条件”可以包括以下：例如，步骤1：对包含DNA的滤膜在65 ℃、在缓冲液中预处理8小时至过夜，该缓冲液由6×SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、 1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％菲可、0.02％BSA和500μg/ml变性的鲑精DNA 组成。步骤2：滤膜在如上预杂交的混合物中，65℃下杂交48小时，在所述预杂 交的混合物中加入100mg/ml变性的鲑精DNA和5-20×10⁶cpm的³²P标记探针。 步骤3：滤膜在包含2×SSC、0.01％PVP、0.01％菲可和0.01％BSA的溶液中，在 37℃下清洗1小时。在这之后，在0.1×SSC中、在50℃下清洗45分钟。步骤4： 滤膜被放射自显影。可使用的其它的高度严格性条件在本领域中是熟知的(参见， 例如，Ausubel等人，(eds.),1993,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley  and Sons,NY；and Kriegler,1990,Gene Transfer and Expression,a Laboratory Manual, Stockton Press,NY)。

“中等严格性条件”可包括如下：步骤1：对包含DNA的滤膜在55℃、在溶 液中预处理6小时，所述溶液包含6×SSC、5×Denhardt's溶液、0.5％SDS和100 mg/ml变性鲑精DNA。步骤2：滤膜在添加有5-20×10⁶cpm的³²P-标记探针的相 同溶液中，在55℃下杂交18-20小时。步骤3：滤膜在包含有2×SSC、0.1％SDS的 溶液中、在37℃下清洗1小时，接着，在包含有1×SSC和0.1％SDS的溶液中、 在60℃下、清洗两次共30分钟。步骤4：滤膜进行印迹干燥并且曝光进行放射自 显影。可使用的其它的中等严格性条件在本领域中是熟知的(参见例如，Ausubel等 人，(eds.),1993,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,NY；and Kriegler,1990,Gene Transfer and Expression,a Laboratory Manual,Stockton Press, NY)。

最后，“低严格性条件”可包括：步骤1：对包含DNA的滤膜在40℃、在溶 液中预处理6小时，所述溶液包含35％甲酰胺、5×SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、 5mM EDTA、0.1％PVP、0.1％菲可、1％BSA、以及500μg/ml变性的鲑精DNA。 步骤2：在添加有0.02％PVP、0.02％菲可、0.2％BSA、100μg/ml鲑精DNA、10％ (wt/vol)葡聚糖硫酸酯和5-20×10⁶cpm的³²P-标记探针的相同溶液中，在40℃条件 下杂交滤膜18-20小时。步骤3：滤膜在包含2×SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5 mM EDTA和0.1％SDS的溶液中，在55℃下清洗1.5小时。可用新的溶液替换该 清洗溶液，并在60℃下温育额外的1.5小时。步骤4：滤膜进行印迹干燥并曝光进 行放射自显影。如果需要，滤膜可在65-68℃条件下进行第三次清洗，并重新对胶 片曝光。可使用的其它的低严格性条件在本领域中是熟知的(例如，应用于跨种杂 交)。参见，例如，Ausubel等人，(eds.),1993,CURRENT PROTOCOLS IN  MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley and Sons,NY；and Kriegler,1990,GENE  TRANSFER AND EXPRESSION,A LABORATORY MANUAL,Stockton Press,NY。

根据本发明如上定义的核酸序列可用于表达肽，即，如本文使用的JNK抑制 剂序列或本文使用的嵌合肽，进行分析、表征或治疗应用；以及用作组织标记， 在所述组织中相应的肽(如本文使用的)被优先地表达(组成型的或在组织分化或发 育的特定阶段或在疾病状态中)。这些核酸的其它应用包括，例如核酸的凝胶电泳 基的分析中的分子量标记。

根据本发明进一步的实施方式，出于上述目的，表达载体可以用于重组表达 如上所定义的一种或多种本发明的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽。本文使用的术语 “表达载体”指环形或线型的DNA或RNA，其是双链的或是单链的。其进一步 包括至少一种如上定义的待被转移进入宿主细胞或进入单细胞或多细胞宿主生物 的核酸。本文使用的表达载体优选地包括如上定义的核酸，其编码如本文使用的 JNK抑制剂序列或其片段或变体、或如本文使用的嵌合肽或其片段或变体。另外 地，根据本发明的表达载体优选地包括用于支持表达的合适元件，其包括多种调 节元件，例如来自病毒、细菌、植物、哺乳动物和其它真核生物源的增强子/启动 子——其驱动插入的多核苷酸在宿主细胞中表达，例如绝缘子、边界元件、LCR(例 如，由Blackwood和Kadonaga(1998),Science281,61-63描述)或基质/支架附着区 (例如，由Li,Harju和Peterson,(1999),Trends Genet.15,403-408描述)。在一些实 施方式中，调节元件是异源的(例如，不是天然基因启动子)。可选地，通过于基因 和/或它们侧翼区的天然启动子也可提供必需的转录和翻译信号。

如本文使用的术语“启动子”指功能为控制一个或多个如上定义的核酸序列 转录的DNA区域，并且该DNA区域通过DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点和 其它DNA序列——它们相互作用以调节启动子功能——的存在结构上识别。启动 子的功能表达促进片段是保留作为启动子活性的缩短的或截短的启动子序列。通 过本领域已知的任何分析可测量启动子活性(参见，例如Wood,de Wet,Dewji,和 DeLuca,(1984),Biochem Biophys.Res.Commun.124,592-596；Seliger和McElroy, (1960),Arch.Biochem.Biophys.88,136-141)，或者从可以商业获得)。

在如本文定义的表达载体中使用的“增强子区”一般指功能为增加一个或多 个基因的转录的DNA区域。更具体地，如本文使用的术语“增强子”是增强、增 大、提高或改进基因表达的DNA调节元件，不论其相对于待表达的基因的位置和 方位，并且可以增强、增大、提高或改进多于一种启动子的表达。

在如上所定义的表达载体中使用的启动子/增强子序列可使用植物、动物、昆 虫或真菌调节序列。例如，可使用来自酵母或其它真菌的启动子/增强子元件(例如， GAL4启动子、醇脱氢酶启动子、磷酸甘油激酶启动子、碱性磷酸酶启动子)。可 选地或另外地，它们可以包括动物转录控制区，例如，(i)胰腺β细胞内活化的胰 岛素基因控制区(参见，例如，Hanahan等人，1985.Nature 315:115-122)；(ii)淋巴 细胞内活化的免疫球蛋白基因控制区(参见，例如Grosschedl等人，1984,Cell38: 647-658)；(iii)肝内活化的白蛋白基因控制区(参见，例如，Pinckert等人，1987.Genes  and Dev1:268-276)；(iv)脑少突神经胶质细胞内活化的髓鞘碱性蛋白基因控制区 (参见，例如，Readhead等人，1987,Cell48:703-712)；以及(v)下丘脑内活化的促 性腺激素-释放激素基因控制区(参见，例如，Mason等人，1986,Science234: 1372-1378)等。

另外，如本文定义的表达载体可包括扩增标记。该扩增标记可选自例如腺苷 脱胺酶(ADA)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、多重抗药性基因(MDR)、鸟氨酸脱羧酶 (ODC)和N-(磷酸乙酰)-L-天冬氨酸酯耐性(CAD)。

适合于本发明的示例性的表达载体或它们的衍生物具体地包括：例如人类或 动物病毒(例如，牛痘病毒或腺病毒)；昆虫病毒(例如，杆状病毒)；酵母载体；噬 菌体载体(例如，λ噬菌体)；质粒载体和粘粒载体。

另外，本发明可以使用多种宿主载体系统，其能够表达编码如上定义的核酸 的序列(一种或多种)的肽。这些包括但不限于：(i)牛痘病毒、腺病毒等感染的哺乳 动物细胞系统；(ii)杆状病毒等感染的昆虫细胞系统；(iii)包含有酵母载体的酵母； 或(iv)用噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。根据使用的宿主- 载体系统，可使用多种合适的转录和翻译元件的任一种。

优选地，可以选择适合于这种宿主-载体系统的宿主细胞菌株，其调节插入的 感兴趣序列的表达、或以期望的特定方式修饰或加工由该序列编码的表达肽。另 外，在选择的宿主菌株中，在某些诱导剂存在下可以增强某些启动子的表达；因 此便于控制基因工程肽的表达。而且，不同的宿主细胞具有特有和特定的用于表 达肽的翻译和翻译后的加工和修饰机制(例如，糖基化、磷酸化等)。因此，选择合 适的细胞系或宿主系统，以确保实现对外源肽的期望的修饰和加工。例如，在细 菌系统内的肽表达可用于生成非糖基化的核心肽；然而，哺乳动物细胞内的表达 确保了异源肽的“天然的”糖基化。

本发明进一步提供针对抗如上描述的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的抗体在制 备用于治疗如本文定义的与JNK信号传导强烈相关的疾病或病症的药物组合物中 的应用。此外，描述了对于根据本发明的JNK抑制剂序列、或包含这种抑制剂序 列的嵌合肽特异的抗体的生产的有效方法，并且可以将所述方法用于该目的。

根据本发明，如本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽以及其片段、变体或 衍生物可以用作免疫原，以生成免疫特异地结合这些肽成分的抗体。这些抗体包 括例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库。 在特定的实施方式中，本发明提供针对如上定义的嵌合肽或JNK抑制剂序列的抗 体。本领域已知的多种方法可用于生产这些抗体。

作为实例，通过用如上定义的任何嵌合肽或JNK抑制剂序列注射，可对多种 宿主动物进行免疫以生成多克隆抗体。可使用多种佐剂由此以增加免疫应答，其 包括但不限于弗氏佐剂(完全的或不完全的)、矿物凝胶(例如，氢氧化铝)、表面活 性物质(例如，溶血磷脂酰胆碱、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳化佐剂、二硝基酚 等)、CpG、聚合物、Pluronics、以及人类佐剂例如卡介苗和短小棒状杆菌。

为了制备针对如上所定义的嵌合肽或JNK抑制剂序列的单克隆抗体，可使用 通过连续的细胞系培养物提供抗体分子生成的任何技术。这些技术包括但不限于： 杂交瘤技术(参见，Kohler和Milstein,1975.Nature256:495-497)；三体杂交瘤技术、 人B-细胞杂交瘤技术(参见，Kozbor等人，1983,Immunol Today4:72)和EBV杂 交瘤技术，以生成人类单克隆抗体(参见，Cole等人，1985.In:Monoclonal Antibodies  and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。在本发明的实践中可使用人单克 隆抗体，并且可通过使用人杂交瘤(参见，Cote等人，1983.Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030)或通过在体外用EB病毒转化人B-细胞(参见，Cole等人，1985.In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)产生。

根据本发明，可改进技术以产生对本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽特 异的单链抗体(参见，例如美国专利4,946,778)。另外，可改进方法以构建Fab表达 文库(参见，例如Huse等人，1989.Science246:1275-1281)，以允许快速和有效的 识别对于这些JNK抑制剂序列和/或嵌合肽具有期望特异性的单克隆Fab片段。通 过本领域熟知的技术(参见，例如美国专利5,225,539)可将非人抗体“人源化”。通 过本领域已知的技术，可以生成包含对如本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽 的独特型的抗体片段，例如(i)通过抗体分子的胃蛋白酶消化生成F(ab')₂片段；(ii) 通过减少F(ab')₂片段的二硫键生成Fab片段；(iii)通过使用木瓜蛋白酶和还原剂处 理抗体分子生成Fab片段；以及(iv)Fv片段。

在本发明的一个实施方式中，可以用于筛选具有期望特异性的抗体的方法包 括但不限于：酶联免疫吸附测定(ELISA)和本领域内已知的其它免疫调节技术。在 具体的实施方式中，通过生成杂交瘤有利于选择抗体，该抗体对于如本文定义的 JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的特定表位是特异的(例如，其片段一般包括从5到 20、优选为8到18和最优选为8到11个氨基酸的长度)，所述杂交瘤与如本文定 义的具有这些表位的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽的片段结合。本文也提供对于以 上定义的表位特异的这些抗体。

如本文定义的抗体可在涉及到JNK抑制剂序列(和/或相应地如上定义的嵌合 肽)的定位和/或定量的领域中已知的方法中应用，例如，在合适的生理样品中测量 肽的水平中的应用、在诊断方法中的应用、或在成像肽中的应用等。

根据本发明定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽、核酸、载体、宿主细胞和/或抗 体可以在药物组合物中配制，所述药物组合物可以在预防或治疗如本文定义的疾 病的任一种中应用，特别是在预防或治疗如本文定义的与JNK信号传导强烈相关 的疾病或病症中应用。一般地，根据本发明使用的这些药物组合物包括活性成分， 例如：(i)任意的一种或多种如以上定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽、和/或其变 体、片段或衍生物，特别是根据SEQ ID NO:1至4和13至20和33-100任一序列 的JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NO:9至12和23至32的任一序列的嵌合肽， 和/或包括根据SEQ ID NO:5至8和21至22任一的运输序列的根据SEQ ID NO:1 至4和13至20以及33-100的任一序列的JNK抑制剂序列，或以上定义内的其变 体或片段；和/或(ii)编码如上定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽和/或其变体或片 段的核酸；和/或(iii)包括如上定义的任意一种或多种JNK抑制剂序列和/或嵌合肽、 和/或其变体、片段或衍生物的细胞，和/或(iv)用编码如上定义的JNK抑制剂序列 和/或嵌合肽和/或其变体或片段的载体和/或核酸转染的细胞。

根据优选的实施方式，这种根据本发明使用的药物组合物一般包括安全和有 效量的如上定义的成分，优选地为根据SEQ ID NO:1至4和13至20以及33-100 的任一序列的至少一种JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NO:9至12和23至32 的任一序列的至少一种嵌合肽，和/或包括根据SEQ ID NO:5-8和21至22的任一 的运输序列的根据SEQ ID NO:1至4和13至20和33-100的任一序列的至少一种 JNK抑制剂序列，或以上定义内的其变体或片段，或编码其的至少一种核酸、或 如上定义的至少一种载体、宿主细胞或抗体。

本发明的发明人另外地发现，如上定义的JNK抑制剂序列和嵌合肽分别显示 特别良好的进入涉及本发明疾病的细胞的摄取率。因此，给予对象的药物组合物 中的JNK抑制剂序列和嵌合肽的量各自可以——没有被限于此——具有非常低的 剂量。因此，剂量可以比本领域已知的肽药物诸如DTS-108(Florence Meyer-Losic 等人，Clin Cancer Res.,2008,2145-53)的剂量低得多。这具有数个积极的方面，例 如潜在副作用的减少和成本的降低。

优选地，剂量(每公斤体重的)是在多至10mmol/kg的范围中，优选多至1 mmol/kg，更优选多至100μmol/kg，甚至更优选为多至10μmol/kg，甚至更优选为 多至1μmol/kg，甚至更优选为多至100nmol/kg，和最优选为多至50nmol/kg。

因此，剂量范围可以优选为约1pmol/kg至约1mmol/kg、约10pmol/kg至约 0.1mmol/kg、约10pmol/kg至约0.01mmol/kg、约50pmol/kg至约1μmol/kg、约 100pmol/kg至约500nmol/kg、约200pmol/kg至约300nmol/kg、约300pmol/kg 至约100nmol/kg、约500 pmol/kg至约50 nmol/kg、约750pmol/kg至约30nmol/kg、 约250pmol/kg至约5nmol/kg、约1nmol/kg至约10nmol/kg或所述值的任两个的 组合。

在该内容中，当使用上述药物组合物治疗时的处方例如剂量的决定等一般在 全科医师和其它医生的职责内，并且一般地考虑待治疗的病症、个体患者的状况、 递送部位、给药的方法和医生已知的其它因素。如上所提到的这些技术和方案的 实例可在“REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,16th edition,Osol,A. (ed),1980.”中找到。因此，根据本发明使用的药物组合物的成分的如上定义的“安 全和有效的量”指这些成分的每一种或所有的量，其足以显著诱导如本文定义的 与JNK信号传导强烈相关的疾病或病症的积极的变化。然而，在同时，“安全和有 效量”小到足以避免严重的副作用，也就是说，使在益处和危险之间达到明智的 关系。这些限定的确定一般在明智的医学判断范围内。这种成分的“安全和有效 量”将连同被治疗的特定状况而变化，并且也连同被治疗的患者的年龄和身体状 况、状况的严重性、治疗的持续时间和辅助治疗的性质、使用的具体的药学上可 接受载体的性质和类似的因素在陪伴医生的知识和经验内变化。根据本发明的药 物组合物可以根据本发明用于人，也可以用于兽医药物的目的。

除了这些物质之一之外，根据本发明使用的药物组合物可以进一步地包括(相 容的)药学上可接受的载体、赋形剂、缓冲液、稳定剂或本领域技术人员熟知的其 它材料。

在这种内容中，表述“(相容的)药学上可接受的载体”优选地包括组合物的液 体或非液体基。术语“相容的”指如本文使用的药物组合物的组成能够与如上定 义的药物活性成分和另一种成分以如此方式混合：使得将大量减小组合物的药学 上效果的相互作用在通常使用情况下不会出现。药学上可接受的载体当然必须具 有足够高的纯度和足够低的毒性，以使它们适合于施用给待治疗的人。

如果本文使用的药物组合物以液体形式提供，那么药学上可接受的载体一般 将包括一种或多种(相容的)药学上可接受的液体载体。组合物可以包括如(相容的) 药学上可接受的液体载体，例如无热源的水；等渗盐水或者缓冲(水)溶液，例如磷 酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液，植物油，诸如，例如花生油、棉花籽油、麻油、橄 榄油、玉米油和可可油；多元醇，诸如，例如聚丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇 和聚乙二醇；褐藻酸等。具体地，对于本文使用的药物组合物的注射，可以使用 缓冲液，优选为水性缓冲液。

如果本文使用的药物组合物以固体形式提供，那么药学上可接受的载体一般 包括一种或多种(相容的)药学上可接受的固体载体。组合物可以包括如(相容的)药 学上可接受的固体载体，例如一种或多种相容的固体或液体填料，或也可以使用 稀释剂或包囊化合物(encapsulating compound)，其适合于施用给人。这种(相容的) 药学上可接受的固体载体的一些实例为诸如糖类，诸如，例如乳糖、葡萄糖和蔗 糖；淀粉类，诸如，例如，玉米淀粉或马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，诸如， 例如，羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶； 动物脂；固体助流剂，诸如，例如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙等。

(相容的)药学上可接受的载体或其它材料的准确性质可以依赖于给药途径。 (相容的)药学上可接受的载体的选择因此可以原则上通过如根据本发明使用的药 物组合物的给药方式进行确定。根据本发明使用的药物组合物可以例如全身地给 药。给药的途径包括例如肠胃外途径(例如，经过注射)，例如，静脉内、肌肉内、 皮下、皮内或者经皮途径等，肠途径例如口服药，或者直肠途径等等，局部途径， 诸如鼻途径或者鼻内途径等，或其它途径，诸如表皮途径或者贴剂递送。

使用的药物组合物的合适量可以通过使用动物模型的常规试验确定。这种模 型包括——没有暗示任何限制——兔、绵羊、小鼠、大鼠、狗和非人的灵长类动 物的模型。注射的优选的单位剂型包括水的灭菌溶液、生理盐水或者它们的混合 物。这种溶液的pH应该调节到约7.4。注射用的合适载体包括水凝胶、控释或缓 释设备、聚乳酸和胶原基质(collagen matrices)。局部施加的合适药学上可接受的载 体包括适合于在洗剂、膏、凝胶等中使用的那些。如果化合物经口给药，片剂、 胶囊剂等为优选的单位剂型。制备可以用于口服给药的单位剂型的药物学上可接 受的载体在现有技术中是熟知的。其选择将根据次要的考虑因素，诸如味道、成 本和储存能力，它们对于本发明的目的不是关键的，并且可以通过本领域技术人 员没有困难地进行。

口服给药的药物组合物可以为片剂、胶囊剂、粉末或者液体的形式。片剂可 以包括如上定义的固体载体例如明胶，和任选地包括辅助剂。口服给药的液体药 物组合物一般包括如上定义的液体载体，诸如水、石油、动物或植物油，矿物油 或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡聚糖或其它糖类溶液或者乙二醇类诸如1,2- 亚乙基二醇、丙二醇或者聚乙二醇。

对于静脉内、皮肤或皮下注射、或痛处部位的注射，活性成分将是非肠胃可 接受的水溶液，其是无热源的，并且具有合适的PH值、等渗性和稳定性。使用例 如等渗载体例如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液，本领域技术人员 可完全能够制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗 氧化剂和/或其它添加剂。无论它是多肽、肽或核酸分子、以及根据本发明的施用 给个体的其它药学上有用的化合物，给药优选地以“预防有效量”或“治疗有效 量”(视情形而定)，这足够示出对个体的益处。实际给药的数量、以及给药的速率 和时程将取决于治疗的性质和严重性。

如本文定义的疾病的预防和/或治疗一般包括给予如上定义的药物组合物。术 语“调节”包括在以上任一的疾病中，当JNK过渡表达时，抑制其表达。它也包 括例如通过使用根据SEQ ID NO:1至4和13至20和33-100的任一序列的至少一 种JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NO:9至12和23至32的任一序列的至少一 种嵌合肽，和/或包括根据SEQ ID NO:5至8和21至22的任一的运输序列的根据 SEQ ID NO:1至4和13至20和33-100的任一序列的至少一种JNK抑制剂序列， 或在以上定义内的其变体或者片段——其作为细胞中天然的c-jun、ATF2和NFAT4 结合位点的竞争抑制剂，在任一的上述疾病中抑制c-jun、ATF2或NFAT4的磷酸 化。术语“调节”也包括抑制转录因子的异数或同数复合体，例如，诸如由c-jun、 AFT2和c-fos组成的AP-1复合体，所述转录因子——不限于此——由c-jun、ATF2 或NFAT4以及它们的相关的配偶体组成。当上面定义的与JNK信号传导强烈相关 的疾病或病症与JNK过量表达相关联时，这些抑制性的JNK抑制剂序列可被引入 到细胞中。在一些例子中，“调节”则可包括JNK表达的增加，例如通过使用阻断 IB-肽与JNK结合的IB-肽特异性抗体，因此通过IB-相关的肽防止JNK抑制。

用如上公开的药物组合物预防和/或治疗对象一般通过(在体内)施用给对象 (“治疗有效的”)量的所述药物组合物来实现，其中所述对象可以是例如任何哺乳 动物诸如人类、灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马或猪。术语“治疗有 效”是指药物组合物的活性成分为足够改善与如上所述的JNK信号传导强烈相关 的疾病或病症的量。

因此，如上定义的任何肽，例如，根据SEQ ID NO:1至4和13至20和33-100 的任一序列的至少一种JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NO:9至12和23至32 的任一序列的至少一种嵌合肽，和/或包括根据SEQ ID NO:5至8和21至22的任 一的运输序列的根据SEQ ID NO:1至4和13至20和33-100的任一序列的至少一 种JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或者片段，可以在本发明的特定实 施方式中使用，以通过调节活化的JNK信号传导通路来治疗如上定义的与JNK信 号传导强烈相关的疾病或病症。

然而，如上定义的肽也可以由核酸编码，其然后可以形成本发明的药物组合 物的一部分，例如用于基因疗法。在该内容中，基因治疗指通过给对象施用如上 定义的具体核酸——例如作为如上定义的药物组合物——进行的治疗，其中所述 核酸(一种或多种)全部包括L-氨基酸。在本发明的这种实施方式中，核酸生成其编 码的肽(一种或多种)，该编码肽然后通过调节疾病或病症的功能，用于发挥其治疗 作用。本领域中可使用的与基因治疗相关的任一方法可用于实践本发明(参见，例 如Goldspiel等人，1993.Clin Pharm12:488-505)。

在一个优选的实施方式中，如上定义和用于基因治疗的核酸是如此表达载体 的一部分，所述表达载体在合适的宿主内编码和表达任意一种或多种如上定义的 IB相关肽，即，根据SEQ ID NO:1至4和13至20和33-100的任一序列的JNK 抑制剂序列和/或根据SEQ ID NO:9至12和23至32的任一序列的嵌合肽，和/或 包括根据SEQ ID NO:5至8和21至22的任一的运输序列的根据SEQ ID NO:1 至4和13至20和33-100的任一序列的JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变 体或者片段。在一个具体实施方式中，该表达载体具有可操作地连接到JNK抑制 剂序列的编码区(一个或多个)的启动子。该启动子可以为如上定义，例如为诱导型 的或组成型的、以及任选地为组织特异性的。

在另一具体的实施方式中，如上定义的核酸分子可用于基因治疗，其中如上 定义的核酸分子的编码序列(以及其任何其它期望的序列)的侧翼为促进基因组内 期望位置处同源重组的区域，因此提供这些核酸的染色体内的表达(参见，例如 Koller和Smithies,1989.Proc Natl Acad Sci USA86:8932-8935)。

出于基因治疗的目的，根据本发明的如上定义的核酸递送进入到患者内，特 别是在如上定义的上述与JNK信号传导强烈相关的疾病或病症的情况中，其可以 直接(即，患者直接暴露于核酸或包含核酸的载体)或间接(即，首先在体外用核酸 转化细胞，接着将细胞移植到患者内)。这两种方法分别已知为体内或体外基因治 疗。在本发明的具体实施方式中，在体内直接地给予核酸，在其中核酸表达以生 成编码产物。这可通过本领域已知的多种方法中的任一种实现，包括：例如将核 酸构建为合适的核酸表达载体的一部分并以如此方式将其给予，使其变为分子内 的(例如，通过使用有缺陷的或灭活的逆转录病毒或其他的病毒载体进行感染；参 见美国专利4,980,286)；直接注射裸DNA；使用微粒轰击(例如“基因枪”；生物射 弹，DuPont)；用脂质包被核酸；使用相关的细胞表面受体/转染剂；在脂质体、微 粒或微胶囊中胶囊化；以与已知进入核的肽键合将其给予；或以与易于受体介导 的细胞内吞作用的配体键合将其给予(参见，例如，Wu和Wu,1987.J Biol Chem 262:4429-4432)，这可用于“靶向”特异性表达感兴趣的受体等的细胞类型。

在本发明的实践中，基因治疗的另外的方法包括通过方法如电穿孔、脂质转 染、磷酸钙介导的转染、病毒感染等，将基因(包括如上定义的核酸)转化入体 外组织培养物的细胞中。一般而言，转化的方法包括可选择的标记对细胞的伴随 转化。接着，该细胞被置于选择压力下(例如抗生素抗性)，以便促进已摄取转化基 因并表达转化基因的那些细胞的分离。然后那些细胞被递送到患者。在具体的实 施方式中，在体内给予得到的重组细胞之前，通过本领域已知的任何方法，包括 例如转染、电穿孔、显微注射、用包含有感兴趣的核酸序列的病毒或噬菌体载体 感染、细胞融合、染色体介导的基因转化、微细胞介导的基因转化、原生质球融 合、以及确保受体细胞必要的发育和生理学功能不被转化破坏的类似方法，将核 酸引入到细胞中。参见，例如，Loeffler和Behr,1993.Meth Enzymol217:599-618。 该选择的技术应该可将核酸稳定转化到细胞，使得核酸是通过细胞可表达的。优 选地，转化的核酸是通过细胞后代可遗传和可表达的。

在本发明的优选实施方式中，通过本领域已知的多种方法可将得到的重组细 胞递送到患者，所述方法包括例如注射上皮细胞(例如皮下地)、施加作为皮肤移植 物的重组皮肤细胞到患者、以及静脉内注射重组血液细胞(例如，造血干细胞或祖 细胞)。预想要使用的细胞的总量取决于期望的效果、患者的状态等，并可由本领 域的技术人员决定。出于基因治疗的目的，可引入核酸的细胞包括任何期望的、 可用的细胞类型，并且可以是异源的、异种的、同种的或自体的。细胞的类型包 括但不限于：分化的细胞例如上皮细胞、内皮细胞、角化细胞、成纤维细胞、肌 细胞、肝细胞和血细胞、或各种干细胞或祖细胞，特别是胚胎心肌细胞、肝干细 胞(国际专利公开WO94/08598)、神经干细胞(Stemple和Anderson,1992,Cell71: 973-985)、造血干细胞或祖细胞——例如从骨髓、脐带血、外周血、胎儿肝脏等得 到的。在优选的实施方式中，用于基因治疗的细胞是患者自体的。

可选地和/或另外地，为了治疗本文上述疾病，可使用靶向治疗以通过使用靶 向系统例如(靶向)抗体或细胞特异性配体，递送如上定义的、对某些细胞类型更特 异性的JNK抑制剂序列、嵌合肽和/或核酸。用于靶向的抗体一般对于与如下定义 的疾病相关的细胞的细胞表面蛋白是特异的。作为实例，这些抗体可以涉及到细 胞表面抗体例如，诸如B细胞相关的表面蛋白例如MHC II类DR蛋白、 CD18(LFA-1β链)、CD45RO、CD40或Bgp95，或细胞表面蛋白，其选自例如CD2、 CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD10、CD13、CD16、CD19、CD20、CD21、 CD22、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD39、CD4、CD43、 CD45、CD52、CD56、CD68、CD71、CD138等。靶向构建物一般可以通过共价 地结合如本文定义的根据本发明的JNK抑制剂序列、嵌合肽和核酸到对细胞表面 蛋白特异性的抗体，或通过结合到细胞特异性配体进行制备。例如，蛋白可结合 到这类抗体，或通过肽键或通过化学偶联、交联等连接于此。然后，通过如下定 义的任一给药途径，例如腹膜内、鼻、静脉内、口的或贴剂递送途径，给予患者 药学上有效量的靶向构建物，来进行靶向治疗。优选地，例如通过共价键的水解、 通过肽酶或通过任何其它合适的方法，结合到如上所定义的靶向抗体或细胞特异 性配体的根据本发明如本文定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸可在体外或体 内释放。可选地，如果根据本发明如本文定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸 结合到小的细胞特异性配体，那么可以不进行该配体的释放。如果存在于细胞表 面，那么在其运输序列活化后，嵌合肽可进入细胞。由于多种原因，可能期望靶 向；例如，如果根据本发明如本文定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸是不可 接受的毒性的或如果其另外需要太高的剂量。

代替直接给予根据本发明的如本文定义的JNK抑制剂序列和/或嵌合肽，通过 从引入细胞的编码基因——例如从被给予的病毒载体——进行表达，在靶细胞中 可生成它们。该病毒载体一般编码根据本发明的如本文定义的JNK抑制剂序列和/ 或嵌合肽。该载体可被靶向待治疗的特定细胞。而且，该载体可包含调节元件， 并可依据限定的调控，通过靶细胞或多或少地选择性地打开调节元件。该技术代 表了VDEPT技术(病毒定向酶前药治疗(virus-directed enzyme prodrug therapy， VDEPT)的变体，其使用成熟蛋白而不是它们的前体形式。

可选地，通过使用抗体或病毒，可以以前体形式给予如本文定义的JNK抑制 剂序列和/或嵌合肽。然后通过在待治疗的细胞中生成或靶向到治疗的细胞的活化 剂，可将这些JNK抑制剂序列和/或嵌合肽转化为活化形式。该类方法有时称为 ADEPT(抗体定向酶的药物前体治疗(antibody-directed enzyme prodrug therapy)或病 毒定向酶前药治疗；前者包括通过结合到细胞特异性抗体将活化剂靶向细胞，而 后者包括通过从病毒载体中的编码DNA的表达，在载体中生成活化剂，例如JNK 抑制剂序列或嵌合肽(参加，例如，EP-A-415731和WO90/07936)。

根据进一步的实施方式，如本文定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽、核酸序列 或JNK抑制剂序列或嵌合肽的抗体，例如，根据SEQ ID NO:1至4和13至20和 33-100的任一序列的JNK抑制剂序列和/或根据SEQ ID NO:9至12和23至32的 任一序列的嵌合肽，和/或包括根据SEQ ID NO:5至8和21至22的任一的运输序 列的根据SEQ ID NO:1至4和13至20和33-100的任一序列的JNK抑制剂序列， 或在以上定义内的其变体或者片段，可以在(体外)测定(例如免疫测定)中使用，以 检测、预测、诊断或监测选自如上定义的与JNK信号传导强烈相关的疾病或病症 的各种状况和疾病状态，或监测其治疗。通过包括以下的方法，可进行免疫测定： 使源自患者的样品与如上定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸序列的抗体在使 得免疫特异结合可以发生的条件下接触，并且随后检测或测量任何被抗体免疫特 异结合的量。在具体的实施方式中，对JNK抑制剂序列、嵌合肽或核酸序列特异 性的抗体可用于分析患者的组织或血清样品中JNK或JNK抑制剂序列的存在，其 中JNK的异常水平表示疾病状况。可使用的免疫测定包括但不限于竞争性和非竞 争性测定系统，其使用技术，例如蛋白质印迹、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫 吸附测定(ELISA)、“夹心”免疫测定(“sandwish”immunoassay)、免疫沉淀测定、 沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、凝集测定、荧光免疫测定、补体 结合测定、免疫放射测定、以及蛋白质-A免疫测定等。可选地，通过递送如上定 义的JNK抑制剂序列、嵌合肽、核酸序列或JNK抑制剂序列或者嵌合肽的抗体至 例如一般选自培养的动物细胞、人细胞或微生物的靶细胞，可以进行(体外)测定， 并通过本领域的技术人员熟知的生物物理方法监控细胞的应答。本文一般使用的 靶细胞可以为培养细胞(体外)或者体内细胞，即构成活的动物或人的器官或组织的 细胞、或在活的动物或人体中发现的微生物。

本发明另外提供用于诊断或治疗目的试剂盒的用途，特别用于治疗、预防或 监测如上定义的与JNK信号传导强烈相关的疾病或病症，其中所述试剂盒包括一 个或多个容器，其包含如上定义的JNK抑制剂序列、嵌合肽、核酸序列和/或这些 JNK抑制剂序列或嵌合肽的抗体，例如以下的抗JNK抑制剂序列抗体：根据SEQ ID NO:1至4和13至20和33-100的任一序列的JNK抑制剂序列，根据SEQ ID NO:9至12和23至32的任一序列的嵌合肽，包括根据SEQ ID NO:5至8和21 至22的任一的运输序列的根据SEQ ID NO:1至4和13至20和33-100的任一序 列的JNK抑制剂序列，或在以上定义内的其变体或者片段，或者这种抗JNK抑制 剂序列抗体以及任选地所述抗体的标记结合配偶体。本文并入抗体的标记包括但 不限于：化学发光的、酶的、荧光的、比色的(酶显色的，colorimetric)或放射性 的部分。在另一个具体的实施方式中，提供了试剂盒，其在治疗、预防或监测如 上定义的与JNK信号传导强烈相关的疾病或病症中用于诊断，包括一个或多个包 含核酸的容器，所述核酸编码或者可选地互补于如上定义的JNK抑制剂序列和/ 或嵌合肽，任选地，也提供这些核酸的标记结合配偶体。在可选的具体实施方式 中，所述试剂盒可以为用于以上目的的一种试剂盒，其包括一个或多个容器、一 对寡核苷酸引物(例如，每个长度为6到30个核苷酸)，所述引物能够作为扩增引 物用于聚合酶链反应(PCR；参见，例如Innis等人，1990.PCR PROTOCOLS, Academic Press,Inc.,San Diego,CA)、连接酶链反应、循环探针反应等，或者本领 域已知的在如上定义的核酸内容中使用的其它方法。任选地，所述试剂盒可以进 一步可包括预先确定量的如上定义的纯化JNK抑制剂序列、如上定义的嵌合肽或 编码这些的核酸，用作出于上述目的的测定中的诊断、标准或对照。

本发明不限于本文描述的具体实施方式的范围。实际上，除了在本文描述的 那些外，本发明的各种修改根据前述描述和附图对于本领域技术人员将是显而易 见的。这些修改落入所附权利要求的范围内。

在此所引用的各种出版物，其公开内容通过引用整体并入。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普 通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与在此描述的那些方法和材料的类似或 相同的方法和材料可在本发明的实践或测试中应用，但是下面将描述合适的方法 和材料。在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其它文献通过引用整体并入。 在冲突的情况下，本说明书包括定义为主。另外，材料、方法和实施例仅是说明 性，而不意欲是限制性的。本发明的其它特征和优点根据以下详细描述和权利要 求将是显而易见的。

附图描述

图1A-C是显示在示出的转录因子中保守JBD结构域区域的比对的图。通过 进行序列比对，鉴定本文使用的JNK抑制剂序列。这种比对的结果在图1A-1C中 示例性显示。图1A描述了在IB1、IB2、c-Jun和ATF2的JBD之间的最高同源性 区域。图1B出于比较原因，描述了L-IB1(s)和L-IB1的JBD的氨基酸序列。完全 保守的残基用星号示出，而在GFP-JBD_23Mut载体中改变为Ala的残基通过开圆示 出。图1C示出包括JNK抑制剂序列和运输序列的嵌入蛋白的氨基酸序列。在显 示的实例中，运输序列衍生自人类免疫缺陷病毒(HIV)TAT多肽，而JNK抑制剂 序列衍生自IB1(s)多肽。在图B和C中，人类、小鼠和大鼠序列是相同的。

图2是示出来自人类、小鼠和大鼠的通用TAT-IB融合肽的序列的图。

图3描述在合用一孔的方法(one-well approach)中使用根据SEQ ID NO:9和11 的融合肽抑制HepG2细胞中内源性JNK活性的结果。从图3——特别在图3的图 d——中可以看出，根据SEQ ID NO:11的D-TAT-IB1(s)(在此简写为D-JNKI)有效 地抑制JNK活性，甚至比根据SEQ ID NO:9的L-TAT-IB1(s)(在此简写为L-JNKI) 更好。

图4示出根据SEQ ID NO:11的嵌合JNK抑制剂序列(也称为XG-102(参见实 施例12))的细胞毒性测定的结果。可以看出，XG-102(SEQ ID NO:11)对于HFF不 是细胞毒性的。HFF在96-孔组织培养板中接种。包含DMSO(与5μM药物相同的 水平)或1、2和5μM的XG-102的培养基加入24h。简单地加入中性红，固定细 胞，然后提取染料。在540nm测量吸光度。在DMSO和1μM XG-102之间没有观 察到差别。

图5描述对于测试根据SEQ ID NO:11的嵌合JNK抑制剂序列的活性进行的 空斑数减少测定的结果，也称为XG-102对水痘带状疱疹病毒(VZV)(参见实施例 12)。由此可见，XG-102(SEQ ID NO:11)是水痘带状疱疹病毒(VZV)的有效抑制剂， 特别是在0.5μM和1μM的浓度下。

图6显示使用根据SEQ ID NO:11的嵌合JNK抑制剂序列——也称为XG-102 ——抑制在培养的人成纤维细胞中的水痘带状疱疹病毒(VZV)结果(参见实施例 12)。由此可见，VZV对于XG-102(SEQ ID NO:11)显示了显著的灵敏性。VZV复 制在阴性对照(XG-100，单独的Tat肽)存在下是正常的。XG-102(SEQ ID NO:11) 因此在0.25μM的最低试验浓度下已经阻止了VZV复制。

图7描述在使用博来霉素诱导的急性肺炎的动物模型治疗慢性阻塞性肺疾患 (COPD)中，在肺匀浆中，XG-102(SEQ ID NO:11)对使用MPO的肺中细胞募集的 活性。由此可见，MPO在博来霉素施用后没有被显著地诱导。XG-102(SEQ ID NO: 11)因此对于肺中的MPO水平只有很小的影响。

图8描述在使用博来霉素诱导的急性肺纤维化的动物模型治疗慢性阻塞性肺 疾患(COPD)中，XG-102(SEQ ID NO:11)对TNF水平的的活性。当测量TNF水平 时，在BLM模型中观察到在施用XG-102(SEQ ID NO:11)之后的BALF中TNF 水平的下降趋势。在BLM之后，TNF水平是非常低的。

图9描述在使用博来霉素诱导的急性肺纤维化的动物模型治疗慢性阻塞性肺 疾患(COPD)中，XG-102(SEQ ID NO:11)对支气管肺泡灌洗空间中细胞募集的活 性。在0.1mg/kg，XG-102(SEQ ID NO:11)显著地降低了在炎症阶段期间的淋巴细 胞募集和募集的总细胞的数量，在这点上，炎症阶段的特征为淋巴细胞募集。在 0.1mg/kg，XG-102(SEQ ID NO:11)增强了进入支气管肺泡空间中的淋巴细胞募集 或者总细胞的数量(每组小鼠n＝5；*,p<0.05；**,p<0.001)。

图10描述在使用博来霉素诱导的急性肺纤维化的动物模型治疗慢性阻塞性肺 疾患(COPD)中组织学的结果。3μm的肺切片用苏木素和曙红染色。炎性细胞积累、 纤维化区、肺结构的损坏在施用BLM之后的10天被观察到。由此可见，在施用 低剂量(0.001mg/kg)的XG-102之后观察到这些参数的下降，但是在高剂量(0.1 mg/kg)没有观察到。

图11示出用XG-102(SEQ ID NO:11)处理对通过ELISA测定的脑β_1-40和 Aβ_1-42水平的作用。图表示用Triton 40和Triton42在不同脑均浆部分中通过ELISA 测定的Aβ_1-40(左)和Aβ_1-42(右)的水平。数据被表示为个体值(黑色)和组平均值± SEM的散点图。显著差别用星号(*p<0.05；**p<0.01)标记。显著的组差别只在 Aβ_1-42的Triton X-100组分中观察到。

图12描述用XG-102(SEQ ID NO:11)处理对通过ELISA测定的CSF Aβ_1-40和 Aβ_1-42水平的作用。图表示在CSF中通过ELISA测定的Aβ_1-40(左)和Aβ_1-42(右)的 水平。数据被表示为个体值(黑色)和组平均值±SEM的散点图。显著差别用星号(* p<0.05；**p<0.01)标记。用两个剂量的XG-102(SEQ ID NO:11)治疗均导致了CSF 中Aβ_1-40和Aβ_1-42的显著下降。

图13示出对hAPP Tg小鼠中空斑硫磺素S染色可见空斑的数量的处理作用。 图表示在皮层和海马中每mm²的硫磺素S染色的空斑的数量。XG-102(SEQ ID NO: 11)处理负剂量依赖性地减少海马中空斑的数量。数据表示为平均值+SEM.N＝8， 每组。*…p<0.05；**…p<0.01。

图14描述对hAPP Tg小鼠中硫磺素S可见空斑面积[％]的处理作用：图表示 在皮层和海马中硫磺素S阳性空斑的空斑面积[％]。XG-102(SEQ ID NO:11)显著 地降低海马中由空斑获得的面积。数据表示为平均值+SEM。N＝8，每组。

图15描述在II型糖尿病动物模型中施用XG-102(SEQ ID NO:11)对禁食血糖 水平(绝对和相对)的结果。禁食血糖水平每三天测量一次直到68天，并且定期地 直到在组A和C中的第111天终止。我们观察到与载体对照相比，用XG-102(SEQ  ID NO:11)(10mg/kg)治疗的糖尿病db/db小鼠的禁食血糖水平清楚且显著 (p<0.001)的降低。用XG-102(SEQ ID NO:11)(10mg/kg)处理的小鼠的禁食血糖水 平达到大约5mmol/L的低稳定水平。这种作用在给药的14后是明显的，并且在 整个研究中持续，因此在从21天道111天的整个洗出时间段期间持续。相比之下， 我们在剂量给药的28天期间没有观察到低剂量XG-102(SEQ ID NO:11)(1mg/kg) 的作用。

图16描述在II型糖尿病动物模型中施用XG-102(SEQ ID NO:11)、10mg/kg 体重的结果。我们观察到与载体对照相比，用XG-102(SEQ ID NO:11)(10mg/kg) 处理的小鼠中体重增加清楚和显著(p<0.001)的抑制。这种作用从给药的28天是明 显的，并且保持直到终止第111天的天。相比之下，我们在剂量给药的28天期间 没有观察到低剂量的XG-102(SEQ ID NO:11)(1mg/kg)对体重的作用。

图17、18描述II型糖尿病动物模型中载体或XG-102(SEQ ID NO:11)(10 mg/kg)对24小时食物和水摄取的作用，在图17(g)和18中研究第68天的代谢笼中 测量的尿和粪便产生(归一化到体重的克数)。我们观察到与载体对照相比XG-102 (SEQ ID NO:11)(10mg/kg)对任一测量参数没有显著的作用，虽然观察到在食物摄 取和尿产生方面减小的趋势。

图19、20描述在II型糖尿病的动物模型中，如在第55、57和108天测量的 载体或XG-102(SEQ ID NO:11)(10mg/kg)对下述的作用：图19中的胰岛素、 MCP-1和IL-6的血浆水平；图20中tPAI-1、TNF和抵抗素的血浆水平；与载体 对照相比，我们没有观察到XG-102(SEQ ID NO:11)(10mg/kg)对任一测量参数的 显著作用，除了血浆抵抗素水平，其在XG-102(SEQ ID NO:11)处理的动物中在第 77和108天是显著较高的。

图21示出在II型糖尿病动物模型中载体或XG-102(SEQ ID NO:11)(10mg/kg) 对于附睾、腹股沟皮下和腹膜后的脂肪垫的组织重量的作用。我们观察到与载体 对照相比，在用XG-102处理的小鼠中的附睾(p<0.05)和腹膜后(p<0.01)的脂肪质量 的显著降低。

图22描述在II型糖尿动物病模型中载体或XG-102(SEQ ID NO:11)(10mg/kg) 对于脑、脾和心脏的组织重量的影响。我们观察到与载体对照相比，XG-102(SEQ ID NO:11)(10mg/kg)对于这些参数没有显著的作用。

图23描述在II型糖尿动物病模型中载体或XG-102(SEQ ID NO:11)(10mg/kg) 对于肾和肝的组织重量的影响。我们观察到与载体对照相比，用XG-102(SEQ ID  NO:11)(10mg/kg)处理的小鼠中肾(p<0.05)和肝(p<0.01)质量的显著减少。

图24原代培养的巨噬细胞用XG-102(SEQ ID NO:11)温育并且充分地清洗。 使用对XG-102特异的抗体显示XG-102(SEQ ID NO:11)的存在。XG-102被良好 地掺入原代巨噬细胞中。

图25小鼠经过三种不同途径给药(s.c.、i.v.、i.p.)用具有C¹⁴的放射性标记的肽 (1mg/kg)进行治疗。动物在注射后72小时被杀死并进行免疫放射自显影处理。矢 状部分进行曝光并显示XG-102肽主要在肝、脾和骨髓中的积累(XG-102:SEQ ID  NO:11)。

图26显示用1mg/kg的XG-102i.v.注射的大鼠的肝中的XG-102(SEQ ID NO: 11)的免疫染色。动物在注射24小时后被杀死。使用DAB底物进行显示。该图再 次显示XG-102在肝中显著的积累，特别是在Kupffer细胞(巨噬细胞)中。

图27显示在两个细胞系中细胞因子和趋化因子释放的抑制。XG-102(SEQ ID  NO:11)抑制骨髓和淋巴细胞系中的细胞因子的释放，减少THP-1细胞中LPS-诱导 的TNF-α、IL-6和MCP-1的释放(图A-C)和Jurkat细胞中的PMA和离子霉素诱导 的IFNγ、IL-6和IL-2的生成(图D-F)。对照(XG-101)由于其较小的稳定性而较不 有效。

图28显示初级细胞中细胞因子释放的抑制。XG-102(SEQ ID NO:11)也抑制初 级淋巴细胞和骨髓细胞中的细胞因子的释放，减少了鼠科动物巨噬细胞中的LPS- 诱导的TNF-α、IL-6和Rantes释放(图A-C)和鼠科动物T细胞中的PMA和离子霉 素-诱导的TNFα和IFNγ生成(图D-E)。效果在XG-102的非细胞毒性浓度处出现 (图F)。

图29显示大鼠的IB1cDNA序列和其预测的氨基酸序列(SEQ ID NO:102)。

图30显示通过rIB1基因的外显子内含子边界——剪接供体——编码的大鼠的 IB1蛋白质序列(SEQ ID NO:103)。

图31显示智人的IB1蛋白质序列(SEQ ID NO:104)。

图32显示智人IB1cDNA序列(SEQ ID NO:105)。

实施例

实施例1：JNK抑制剂序列的鉴定

通过已知的JNK结合结构域JBD之间的序列比对，鉴定对与JNK进行有效 相互作用重要的氨基酸序列。IB1[SEQ ID NO:13]、IB2[SEQ ID NO:14]、c-Jun [SEQ ID NO:15]和ATF2[SEQ ID NO:16]的JBD之间的序列比较限定了弱保守的 8个氨基酸序列(参见图1A)。由于IB1和IB2的JBD在结合JNK方面如c-Jun或 ATF2的大约100倍一样有效(Dickens等人，Science277:693(1997)，说明了IB1 和IB2之间的保守残基对于赋予最大结合是重要的。IB1和IB2的JBD之间的比 较限定了在两个序列之间是高度保守的7个氨基酸和3个氨基酸的两个区段。

这两个区段被包含在L-IB1(s)[SEQ ID NO:1]中的19个氨基酸的肽序列内，并 由于比较的原因也已知在衍生自IB1[SEQ ID NO:17]的23个氨基酸肽序列中示 出。图1B中示出这些序列，L-IB1序列中的虚线指出序列中的缺口，以与L-IB1(S) 比对保守残基。

实施例2:JNK抑制剂融合蛋白的制备

通过经过由两个脯氨酸残基组成的连接体共价地将SEQ ID NO:1的C-末端连 接到10氨基酸长的载体肽的N-末端，合成根据SEQ ID NO:9的JNK抑制剂融合 蛋白，所述载体肽衍生自根据SEQ ID NO:5的HIV-TAT4g57(等人，J Biol.Chem. 272:16010(1997))。该连接体用于允许最大的柔性，并防止不想要的二级结构的变 化。也制备了基本构建物并分别被命名L-IB1(s)(SEQ ID NO:1)和L-TAT[SEQ ID  NO:5]。

从而，合成根据SEQ ID NO:11的所有-D逆反肽。基本构建物也被制备并分 别被命名D-IB1(s)[SEQ ID NO:2]和D-TAT[SEQ ID NO:6]。

通过经典的Fmock合成生成根据SEQ ID NOs:9,10,11和12的所有的D和L 融合肽，并通过质谱进一步分析。最后通过HPLC进行纯化。为了确定脯氨酸连 接体的影响，可制备两种类型的TAT肽，一个具有两个脯氨酸，另一个不具有两 个脯氨酸。这两个脯氨酸的添加没有示出修饰进入细胞内或在细胞内的TAT肽的 定位。图2中给出显示保守的氨基酸残基的通用肽。

实施例3:通过JBD19抑制细胞死亡

研究了IB1(s)的19个氨基酸长的JBD序列对JNK生物学活性的作用。该19 个氨基酸序列的N-末端被连接到绿荧光蛋白(GFP JBD19构建物)，并估计该构建 物对由IL1诱导的胰腺β细胞凋亡的作用。以前显示这种凋亡模式被用JBD_1-280转染所阻断，而如本领域已知的ERK1/2或p38的特异性抑制剂没有保护。

合成与JBD相应并包括19个氨基酸的保守序列以及在完全保守区域突变的序 列的寡核苷酸，并且将其直接插入到编码绿荧光蛋白(GFP)(来自Clontech)的 pEGFP-N1载体的EcoRI和SalI位点。在补充有10％胎牛血清、100μg/mL链霉素、 100单位/mL青霉素和2mM谷氨酰胺的RPMI1640培养液中，培养产生胰岛素的 TC-3细胞。使用指出的载体转染产生胰岛素的TC-3细胞，并添加IL-1(10ng/mL) 到该细胞培养基中。在添加IL-1后48小时，使用倒置荧光显微镜计数凋亡细胞的 数量。通过细胞质特征性的“胞膜空泡化(blebbing out)”区分凋亡细胞和正常细胞， 并在两天后进行计数。

GFP是用作对照的绿荧光蛋白表达载体；JBD19是表达连接到衍生自IB1的 JBD的19个氨基酸序列的嵌合GFP的载体；JBD19Mut是与GFP-JBD19相同的 载体，但如在图1B示出在四个保守残基具有突变的JBD；而JBD_1-280是连接到整 个JBD(氨基酸1-280)的GFP载体。GFP-JBD19表达构建物阻止IL-1诱导的胰腺 细胞凋亡，其与整个JBD_1-280一样有效。

作为另外的对照，在完全保守的IB1(s)残基处突变的序列极大地降低了阻止凋 亡的能力。

实施例4：TAT-IB1(s)肽的细胞输入

评估TAT和TAT-IB1(s)肽(“TAT-IB肽”)的L-和D-对映异构形式进入细胞 的能力。通过与荧光素结合的甘氨酸的N-末端添加，标记L-TAT、D-TAT、 L-TAT-IB1(s)和D-TAT-IB1(s)肽[分别为SEQ ID NO:5、6、9和12]。将标记的肽 (1μM)添加到TC-3细胞培养物中，其如在实施例3中描述地进行保持。在预定的 时间，用PBS清洗细胞，并在冰冷的甲醇-丙酮(1:1)中固定5分钟，之后在荧光显 微镜下对其进行检查。荧光素标记的BSA(1μM,12摩尔/摩尔BSA)用作对照。结 果证明在加入到培养基后，所有的上述荧光素标记的肽高效、快速地(少于5分钟) 进入细胞。相反地，荧光素标记的牛血清白蛋白(1μM BSA，12摩尔荧光素/摩尔 BSA)不进入细胞中。

时程研究指出，在24小时时期后，L-对映异构的肽的荧光信号的强度降低70 ％。在48小时很少至没有信号存在。相比较，在细胞内D-TAT和D-TAT-IB1(s) 非常稳定。

一个星期后，所有的D逆反肽的荧光信号仍然很强，并且在处理两星期后， 该信号仅少许地减弱。

实施例5:c-JUN、ATF2和Elk1磷酸化的体外抑制

在体外研究肽对于它们的靶转录因子的JNK介导的磷酸化的作用。使用转录 和翻译兔网织红细胞裂解物试剂盒(Promega)生成重组和未活化的JNK1、JNK2和 JNK3，并其将与单独的c-Jun、ATF2和Elk1或者融合到谷胱甘肽-S-转移酶(GST) 作为底物的c-Jun、ATF2和Elk1一起在固相激酶测定中使用。进行剂量应答研究， 其中L-TAT或L-TAT-IB1(s)肽(0-25μM)与重组的JNK1、JNK2、或JNK3激酶在反 应缓冲液(20mM Tris-乙酸、1mM EGTA、10mM对-硝基苯基磷酸盐(pNPP)、5mM 焦磷酸钠、10mM对-甘油磷酸盐、1mM二硫苏糖醇)中混合20分钟。然后通过添 加10mM MgCl₂和5pCi³³P-dATP和1μg的GST-Jun(氨基酸1-89)、GST-AFT2(氨 基酸1-96)或GST-ELK1(氨基酸307-428)引发激酶反应。可从Stratagene(La Jolla, CA)购得GST融合蛋白。

也添加10μL的谷胱甘肽琼脂糖珠子到该混合物中。然后在变性的10％聚丙 烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分离反应产物。干燥该凝胶，接着对X射线胶片 (Kodak)曝光。在TAT-IB(s)肽剂量低至2.5μM下，观察到通过JNK几乎完全抑制 c-Jun、ATF2和Elk1的磷酸化。然而，一个明显的例外是不存在Elk1的JNK3磷 酸化的TAT-IB(s)抑制。总之，TAT-IB1(s)肽在抑制它们的靶转录因子的JNK家族 的磷酸化方面显示了很好的效果。如上所述，分析D-TAT、D-TAT-IB1(s)和 L-TAT-IB1(s)肽(0-250μM剂量研究)通过重组JNK1、JNK2和JNK3抑制GST-Jun (氨基酸1-73)磷酸化的能力。总之,D-TAT-IB1(s)肽降低了c-Jun的JNK介导的磷酸 化，但其水平比L-TAT-IB1(s)小大约10至20倍。

实施例6:通过活化的JNK抑制c-JUN磷酸化

使用GST-Jun降低UV光照射的海拉细胞(Hela cell)或IL-1处理的PTC细 胞的JNK，评估如本文定义的L-TAT或L-TAT-IB1(s)肽对压力刺激活化的JNK的 作用。PTC细胞如上所述进行培养。海拉细胞在补充有10％胎牛血清、100μg/mL 链霉素、100单位/ml青霉素和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基中培养。在用于细 胞提取制备之前1小时，如上所述用活化PTC细胞，而海拉细胞通过UV-光 (20J/m²)活化。通过刮除在裂解缓冲液(20mM Tris-乙酸、1mM EGTA、1％Triton X-100、10mM P-硝基苯基磷酸盐、5mM焦磷酸钠、10mM对-甘油磷酸盐、1mM 二硫苏糖醇)中的细胞培养物，从对照、UV-光照射海拉细胞和处理的TC-3细 胞制备细胞提取物。通过在SS-34Beckman转子中以15,000rpm离心5分钟去除 碎片。在室温将100μg的提取物与1μg GST-jun(氨基酸1到89)和10μL谷胱甘肽 琼脂糖珠(Sigma)温育1小时。在使用刮除缓冲液清洗4次后，该珠重新悬浮在补 充有L-TAT或L-TAT-IB1(s)肽(25μM)的同样的缓冲液中20分钟。然后通过添加10 mM MgCl₂和5pCi³³P-γ-dATP引发激酶反应并在30℃下温育30分钟。

然后通过在变性的10％聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE分离反应产物。干燥 该凝胶，随后将其对X摄像胶片(Kodak)曝光。在这些实验中，TAT-IB(s)肽有效地 防止了活化JNK磷酸化c-Jun。

实施例7:通过本文定义的TAT-IB(s)肽体内抑制c-JUN磷酸化

为了确定本文定义的能透过细胞的肽是否能阻断体内JNK信号传导，我们使 用异源的GAL4系统。如上所述培养的海拉细胞用5×GAL-LUC报道载体连同 GAL-Jun表达构建物(Stratagene)一起共转染，所述GAL-Jun表达构建物包括连接 到GAL4DNA结合结构域的c-Jun(氨基酸1到89)的活化结构域。通过共转染表达 紧邻上游激酶MKK4和MKK7的载体，实现JNK的活化(参见，Whitmarsh等人， Science285:1573(1999))。简单地说，依照制造商的指示使用DOTAP(Boehringer  Mannheim)，在3.5-cm盘中，使用质粒转染3×10⁵个细胞。对于涉及GAL-Jun的 实验，使用1μg报道质粒pFR-Luc(Stratagene)和0.5μg MKK4或MKK7表达质粒 转染20ng的质粒。在转染3小时后，改变细胞培养基并添加TAT和TAT-IB1(s)肽 (1μM)。16小时后，使用来自Promega的“双报道系统”在蛋白质含量归一化后 测量荧光素酶的活性。在MKK4和MKK7介导的JNK活化后，添加TAT-IB1(s) 肽阻断c-Jun的活化。因为海拉细胞表达JNK1和JNK2同种型而不表达JNK3，所 以使用JNK3转染细胞。同样地，TAT-IB(s)肽抑制JNK2介导的c-Jun的活化。

实施例8:所有-D逆反IB(s)肽和其变体的合成

本发明肽可以是反向合成的全-D氨基酸肽，以防止天然的蛋白质水解(即，全 -D逆反肽)。本发明的全D逆反肽将提供具有类似于天然肽的功能属性的肽，其中 组成氨基酸的侧基将对应于天然肽比对，但保留抗蛋白酶抗性主链。

本发明的逆反肽是通过在肽链中连接述氨基酸使用D氨基酸合成的类似物， 使得逆反肽类似物中氨基酸的序列正好与作为模型的选择肽中的序列相反。为了 说明，如果天然产生的TAT蛋白(由L氨基酸形成)具有序列GRKKRRQRRR[SEQ  ID NO:5]，那么该肽的逆反肽类似物(由D氨基酸形成)将具有序列RRRQRRKKRG [SEQ ID NO:6]。合成D氨基酸链以形成逆反肽的方法在本领域是已知的(参见， 例如Jameson等人，Nature,368,744-746(1994)；Brady等人，Nature,368,692-693 (1994)；Guichard等人，J.Med.Chem.39,2030-2039(1996))。具体地，通过经典的 F-mock合成生成根据SEQ ID NO:2、4、6、8、11-12、18、20、22和25-26的逆 反肽，并通过质谱进一步分析。最后通过HPLC纯化它们。

因为天然肽的固有问题是被天然蛋白酶降解和固有的免疫原性，因此本发明 的异形二价(heterobivalent)或异形多价(heteromultivalent)化合物将被制备以包 括期望肽的“逆反异构体”。因此，保护肽免于天然蛋白质水解因此应该增加特定 的异形二价或异形多价化合物的效力，两者都通过延长半衰期和降低旨在积极地 破坏肽的免疫应答的程度实现。

实施例9:全D逆反IB(s)肽和其变体的长期生物活性

如实施例5中所示，由于为了保护D-TAT-IB(s)肽免于由天然蛋白酶降解，在 与天然L氨基酸类似物比较时，预测包含D-TAT-IB(s)逆反的肽异源偶联物 (heteroconjugate)(参见上述嵌合序列)的长期生物活性。

分析D-TAT-IB1(s)肽对IL-1诱导的胰腺β细胞死亡的抑制。将TC-3细胞与单 一添加的指示肽(1μM)如上所述温育30分钟，然后加入IL-1(10ng/ml)。

然后，在使用IL-1温育两天后，通过使用碘化丙啶和Hoechst33342核染色计 数凋亡细胞。每次实验计数1,000个细胞的最小值。平均值的标准误差(SEM)被 指出，n＝5。D-TAT-IB1肽降低IL-1诱导的凋亡与L-TAT-IB肽的程度类似。

也分析D-TAT-IB1肽对IL-1P诱导的细胞死亡的长期抑制。将TC-3细胞与单 一添加的指示肽(1μM)如上温育30分钟，然后加入IL-1(10ng/ml)，之后每两天添 加细胞因子。然后，在使用IL-1温育15天后，通过使用碘化丙啶和Hoechst33342 核染色计数凋亡细胞。需要说明的是，单一添加的TAT-IB1肽不给予长期保护。 每次实验计数1000个细胞的最小值。结果，D-TAT-IB1(s)而不是L-TAT-IB1(s)能够 给予长期(15天)的保护。

实施例10:通过根据本发明使用的L-TAT-IB1(s)肽抑制JNK转录因子

使用AP-1双标记探针(5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3'(SEQ ID NO: 27)进行凝胶阻滞试验。如指出，用5ng/ml TNF-α处理海拉细胞核提取物1小时或 没有处理。在TNF-α之前30分钟，加入根据本发明使用的TAT和L-TAT-IB1(s) 肽。仅显示具有特定的AP-1DNA复合物的部分凝胶(通过使用未标记特异性的和 非特异性的竞争剂的竞争实验证明)。

在TNF-α存在的情况下，根据本发明使用的L-TAT-IB1(s)肽减少了AP-1DNA 结合复合物的形成。

实施例11：使用合入一孔的方法(all-in one well approach)抑制HepG2细胞中内源性JNK的活性(参见图3)。

实验的前一天，以3000个细胞/孔接种HepG2细胞。然后，加入增加浓度的 白细胞介素-1[IL-1βν)]或肿瘤坏死因子[TNFα(·))]。(a)以活化JNK30分钟。细胞 在20mM Hepes、0.5％吐温pH7.4中裂解并进行AlphaScreen JNK处理。(b)Z’为通 过10ng/ml IL-1诱导和在384孔/板(n＝96)中测量的JNK活性。(c)使用化学JNK抑 制剂[星形孢菌素(°)和SP600125(·)]抑制内源的IL-1β诱导的JNK活性。(d)根据 SEQ ID NO:9的肽抑制剂L-TAT-IB1(s)(在此缩写为L-JNKi(ν))、根据SEQ ID NO: 11的肽抑制剂D-TAT-IB1(s)(在此缩写为D-JNKi(◆))和肽抑制剂JBD(·)(相当于没 有TAT序列的L-JNKI)对于IL-1依赖的JNK活性的影响。所有图表示3个独立的 实验(n＝3)。

方法：Alphascreen激酶测定

原理:AlphaScreen是一种基于非放射珠的技术，其用于以微量培养板形式研究 生物分子的相互作用。缩写ALPHA代表放大的发光接近同质测定(Amplified  Luminescence Proximity Homogenous Assay)。其包括使“供体”和“受体”珠子紧 密接近，然后级联的化学反应作用以生成放大的信号的生物相互作用。当激光在 680nm处激发时，“供体”珠子中的光敏剂(酞菁染料)将周围的氧转换成激发单重 态。在其4μsec的半衰期内，单重态氧分子在溶液中扩散多至200nm，而如果受体 珠子在那接近内时，单重态氧将与“受体”珠子中的二甲基噻吩衍生物发生反应， 生成在370nm化学发光，其进一步活化在同一“受体”珠中包含的荧光团。激发 的荧光团随后发出520-620nm的光。不存在受体珠的情况下，单重态氧降为基态 并不产生信号。

首先在激酶缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.6、10mM MgCl₂、1mM DTT、100μM Na₃VO₄、0.01％吐温-20)中稀释激酶试剂(B-GST-cJun、抗P-cJun抗体和活性 JNK3)，并加到孔中(15μl)。然后，反应在10μM ATP存在下在23℃下温育1小时； 通过加入10μl珠混合物(蛋白A受体20μg/ml和链亲和素供体20μg/ml)、在检测 缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.4、20mM NaCl、80mM EDTA、0.3％BSA)中稀释， 然后在黑暗中23℃下再温育1小时进行检测。为了测量JNK内源性活性，如上描 述进行激酶测定，除了用细胞裂解产物取代活性JNK3，在细胞裂解后加入反应激 酶成分。以相同的浓度使用B-GST-cjun和P-cJun抗体，但是以50μM而不是10μM 使用ATP。在Fusion或En Vision装置上直接分析AlphaScreen信号。

实施例12：测定全D逆反IB(s)肽和其变体在治疗病毒感染——水痘-带状疱疹病毒(VZV)中的活性

如根据本发明使用的IB(s)肽和全D逆反IB(s)肽的活性的测定使用JNK抑制 剂肽XG-102(SEQ ID NO:11)作为测试化合物在培养的宿主细胞(人包皮成纤维细 胞(HFFs))中进行测试。病毒是专性的细胞内寄生虫，其需要功能性细胞环境以完 成它们的生命周期；快死的细胞不支持病毒复制。另外，细胞功能的抑制剂可能 对于细胞是毒性的，其能够非特异地抑制病毒生长。因此，病的或快死的宿主细 胞可能显示非特异地降低的病毒效价。由于这可以伪造结果，所以首先进行细胞 毒性测定，测定培养细胞对试验化合物的耐性。随后，进行空斑数降低测定，然 后在感染细胞中相对于水痘带状疱疹病毒(viral zoster virus，VZV)测试JNK抑制 剂肽XG-102(SEQ ID NO:11)的活性。

A)全D逆反IB(s)肽的细胞毒性的测定：

对于毒性的测定，将培养的细胞(人包皮成纤维细胞(HFF))接种在96-孔组织 培养板中。包含DMSO(与5μM XG-102(SEQ ID NO:11)相同水平)或XG-102(SEQ  ID NO:11)的培养基以数个浓度(1、2和5μM)加入，持续24小时。随后，进行中 性红测定。用于细胞毒性测定的中性红比色测定(以6个重复的组)用于设定随后效 力测定的最大剂量(如在Taylor等人，2004,J.Virology,78:2853-2862中进行的)。 活细胞吸收中性红，因此，吸光度水平是细胞存活率和数量的定量测量。中性红 摄取与细胞的数量直接成比例，并且也反映正常的细胞内吞作用。因此，在0或 24小时短暂脉冲式加入中性红至培养基。在固定和提取后，染料加入并且每个样 品中的染料的量在540nm下、在ELISA板读出器中测量(参见图4)。对于任何量 的XG-102(SEQ ID NO:11)没有观察到细胞毒性，并且与单独的DMSO稀释剂(对 照)相比细胞生长没有被限制。因此，1μM的标准浓度对于HFF细胞没有明显的 影响，并且较高的剂量也被很好地耐受。

B)空斑数降低测定以评估XG-102(SEQ ID NO:11)对水痘-带状疱疹病毒 (VZV)的抗病毒作用

为了确定XG-102(SEQ ID NO:11)是否具有剂量依赖性的抗病毒作用，测试在 标准的1μM剂量周围的一定范围的浓度。在这个空斑数降低测定中，24-孔板中 汇合的人包皮成纤维细胞(HFF)与VZV-感染的HFF以1:100的比率(感染的多样性 MOI＝0.01)温育并且吸附到细胞2小时。过量的病毒被洗出，加入包含0(只有 DMSO)、0.5、1或2μM的XG-102(SEQ ID NO:11)的培养基。在这个时间取一个 样品以测量感染的初始水平；其中每个孔包含大约150pfu。在24小时后，重复孔 进行胰蛋白酶化，并且随后在MeWo细胞单层上一式三份滴定细胞悬浮液，以测 定在每个样品中VZV-感染细胞的数量。在没有限制的生长期间，VZV通常在1 天当中增加10倍，只是因为其通过细胞间播散繁殖。这是对于只用DMSO处理的 培养物所观察到的，其产生1200±430pfu(图5)。测定的结果如下：

XG-102(SEQ ID NO:11) VZV(pfu)的播散±SD 0μM(DMSO) 1233±432 0.5μM 260±53 1.0μM 212±48 2.0μM 312±79

XG-102(SEQ ID NO:11)在所有的试验浓度具有强的抗病毒作用，VZV产量在 200-300pfu附近。使用这些结果的图以内推EC₅₀，计算出大约0.3μM XG-102(SEQ  ID NO:11)引起VZV产量下降50％。

根据细胞毒性和效力数据，计算5.0μM/0.3μM的初步选择指数(Tox/EC₅₀)， 其给出大约17的值，其中真实的SI被认为更高，因为仍然没有达到XG-102(SEQ  ID NO:11)杀死50％的细胞的浓度。

C)在人包皮成纤维细胞(HFF)中，使用XG-102(SEQ ID NO:11)的水痘-带状疱 疹病毒(VZV)复制的测量

为了确定用XG-102(SEQ ID NO:11)阻止人包皮成纤维细胞(HFF)中水痘-带 状疱疹病毒(VZV)复制的XG-102的最小有效剂量，汇合单层的HFF与 VZV-BAC-Luc菌株一起接种2h，然后用0.25、0.5或1.0μM浓度的XG-102(SEQ  ID NO:11)或者用阴性对照(XG-100,1.0μM)处理24h。病毒产量通过萤光素酶检测 进行测量。样品为一式三份并示出平均发光；误差条表示平均值的标准偏差。

结果，VZV复制在阴性对照存在下(只有Tat肽)是正常的。试验最低浓度0.25 μM的XG-102(SEQ ID NO:11)阻止VZV复制。最小有效量在这个试验中不能够 确定。虽然仍然不知道为什么VZV在感染期间依赖于JNK活性，但是似乎该酶是 至关重要的要求。低浓度(0.25μM)的XG-102(SEQ ID NO:11)因此足以完全地阻断 培养物中的VZV播散。这种作用的一种可能的解释是这个量的XG-102(SEQ ID  NO:11)结合感染细胞中所有的JNK分子。可选地，0.25μM XG-102(SEQ ID NO:11) 可以降低JNK活性在阈值水平以下，所述阈值水平对于VZV复制是最佳的。这个 试验的结果在图6中总结。

实施例13：测定全D逆反IB(s)肽和其变体在治疗慢性阻塞性肺疾患(COPD)中的活性

为了测定示例性全D逆反IB(s)肽XG-102(SEQ ID NO:11)在治疗慢性阻塞性 肺疾患(COPD)中的活性，XG-102(SEQ ID NO:11)在博来霉素诱导的急性肺炎症和 纤维质生成的动物模型中使用。博来霉素诱导的炎症和纤维质生成的方案在文献 中先前已经描述过。试验的目的是研究通过皮下(s.c.)途径的XG-102(SEQ ID NO: 11)对博来霉素诱导的炎症和纤维质生成中的支气管肺泡灌洗(BAL)和肺中的嗜中 性粒细胞募集的影响：

-在单次博来霉素施用(10mg/kg)后的第1天

-和在第10天，纤维质生成形成

1)方法和实验步骤

两个剂量的的试验化合物XG-102(SEQ ID NO:11)和载体对照被s.c.给予，单 次鼻内施用博来霉素，在第1天和10天后分析小鼠。在模型中使用的动物是每组 10只C57BL/6小鼠(8周龄)。实验组包括载体、0.001mg/kg XG-102(SEQ ID NO:11) 和0.1mg/kg XG-102(SEQ ID NO:11)，并且治疗由重复皮下施用XG-102(SEQ ID  NO:11)，之后每3天施用博来霉素组成。在24h，急性肺炎症通过BAL灌洗、细 胞学、细胞计数和肺髓过氧物酶活性进行监测。化合物的作用与载体对照比较。 肺纤维质生成在博来霉素单次剂量后第10天使用苏木素和曙红染色进行组织学评 估。

1.1)博来霉素施用

来自Bellon实验室(Montrouge,France)的盐水中的博来霉素硫酸盐(10mg/kg 体重)或盐水在轻度克他命-赛拉嗪(ketamine-xylasine)麻醉下由鼻滴注通过导气管 给予40μL的体积。对于博来霉素诱导的炎症和纤维质生成的博来霉素给药的组 都包括：载体，0.001mg/kg XG-102(SEQ ID NO:11)和0.1mg/kg XG-102(SEQ ID  NO:11)。博来霉素诱导炎症的途径是皮下(s.c.)途径，以单剂量进行给药。博来霉 素诱导纤维质生成的途径是皮下(s.c.)途径，并且在10天中给药进行3次。

1.2)支气管肺泡灌洗液(BALF)

在切开气管后，插入塑料导管，并且使用0.3ml加热至37℃的PBS溶液清洗 气室。收集的样品分配为2份：第一份(1ml，对应于2次第一灌洗)用于介质 (mediator)测量和第二份用于细胞测定(4ml)。第一份离心(600g，10min)，分离 上清液，并且在-80℃保存直到介质测定。细胞团然后在0.4ml的无菌0.9％的NaCl 中重新悬浮，然后与第二份汇集，并用于细胞计数。

1.3)肺匀浆

在BAL之后，整个肺被移出并置于具有1ml的PBS的微管(Lysing matrix D,Q  Bio Gene,Illkrich,法国)内，全部肺组织提取物使用系统(FP120,Q Bio Gene,Illkrich,France)进行制备，然后离心提取物，和在用Sircol Collagen Assay (France Biochem Division,法国)介质测量和胶原测定之前，上清液在-80℃贮藏。

1.4)细胞计数和测定

总的细胞计数在BAL液中使用Malassez血球计进行测定。差分细胞计数在用 MGG Diff-quick(Dade Behring AG)染色后，在细胞离心涂片器制备物(Cytospin3, Thermo Shandon)上进行。使用标准的形态学标准，差分细胞计数200个细胞。

1.5)TNF测量

使用ELISA测定试剂盒(Mouse DuoSet,R&D system,Minneapolis,USA)，根据 制造商的说明书进行测定BALF中的TNF水平。结果报告为pg/ml。

1.6)MPO-测量

在施用XG-102后，测量MPO-水平。在该实验中，博来霉素之后，MPO没 有被显著地诱导。而且，XG-102对肺中的MPO水平没有影响。

1.7)组织学

在BAL和肺灌注之后，大叶在4％缓冲的甲醛中固定用于标准的显微镜分析。 3-m切片用苏木素和曙红(H&E)染色。

2.)结果

A)第一研究：博来霉素(BLM)诱导的急性肺炎症

组：载体、XG-102(SEQ ID NO:11)0.001mg/kg和XG-102(SEQ ID NO:11)0.1 mg/kg

途径：s.c.途径，单剂量

a)支气管肺泡灌洗空间中的细胞募集

在0.1mg/kg，XG-102(SEQ ID NO:11)显著降低在炎症阶段期间的嗜中性粒细 胞的募集和募集的总细胞的数量。在0.001mg/kg，XG-102(SEQ ID NO:11)对于进 入支气管肺泡空间中的嗜中性粒细胞的募集或者其它细胞类型(一个代表性的试 验，其中每组n＝5小鼠；*,p<0.05；**,p<0.001)没有影响。

b)在肺均浆中，使用MPO的肺中的细胞募集

髓过氧物酶(MPO)在宿主防御系统中扮演了重要的角色。这种140kDa蛋白质 ——由两条53kDa的重链和两条15kDa的轻链组成，首先在20世纪60年代发现。 响应白细胞的活化，从嗜中性粒细胞和单核细胞的颗粒释放MPO允许过氧化氢和 氯离子转化成为次氯酸(HOCl)——一种强的氧化剂。虽然MPO在防御系统中用于 重要目的，但是多个研究显示MPO在多种炎症状况中也起作用，其中升高的MPO 水平例如已经与冠状动脉疾病相关联。此外，组织MPO水平反映嗜中性粒细胞的 活化状态并给出嗜中性组织浸润的指示。

在本实验中，在施用博来霉素后，MPO没有被显著地诱导。因此，XG-102(SEQ  ID NO:11)对于肺中的MPO水平没有影响(参见图7)。

c)TNF测量

当测量TNF水平时，观察到在施用XG-102(SEQ ID NO:11)之后，BALF中 的TNF水平下降的趋势，虽然TNF水平在BLM施用之后是非常低的(参见图8)。

d)结论

可以观察到在0.1mg/kg，XG-102(SEQ ID NO:11)减小进入支气管肺泡空间中 嗜中性粒细胞和总细胞募集，并且导致TNF水平减小的趋势。此外，组织学切片 研究显示在支气管周围的空间中炎性细胞聚集减少。因此可以推断XG-102(SEQ  ID NO:11)减轻了博来霉素-诱导的炎症。

根据获得的结果，在纤维质生成模型中另外地进行实验。

B)第二研究：博来霉素(BLM)诱导的肺纤维质生成

组：载体、XG-102(SEQ ID NO:11)0.001mg/kg和XG-102(SEQ ID NO:11)0.1 mg/kg

途径：s.c.途径，10天中3次

a)支气管肺泡灌洗空间中的细胞募集

在0.001mg/kg，XG-102(SEQ ID NO:11)显著减少在炎症阶段期间的淋巴细胞 募集和募集的总细胞的数量，这点上所述炎症阶段的特征为淋巴细胞募集。在0.1 mg/kg，XG-102(SEQ ID NO:11)没有作用(n＝5小鼠，每组；*,p<0.05；**,p<0.001) (参见图9)。

a)组织学

3μm的肺切片用苏木素和曙红染色。在BLM施用后10天，观察到炎症细胞 聚集、纤维化区域、肺结构的损坏。在施用低剂量(0.001mg/kg)的XG-102之后观 察到这些参数的下降，但是在高剂量(0.1mg/kg)没有观察到(参见图10)。

b)结论：

可以推断以0.001mg/kg的低剂量施用XG-102(SEQ ID NO:11)3次减少了博 来霉素诱导的稍后的炎症，特别是减少了在此时观察到的淋巴细胞募集。此外， 这个剂量施用3次试验物质削弱了博来霉素-诱导的纤维质生成。可以观察到更小 范围的纤维化区域与更多保存的肺结构。

实施例14：测定全D逆反IB(s)肽和其变体在治疗阿耳茨海默病中的活性

为了测定示例性全D逆反IB(s)肽XG-102(SEQ ID NO:11)在阿耳茨海默病中的 活性，XG-102(SEQ ID NO:11)在具有伦敦型和瑞典型突变的过量表达APP751的 hAPP-转基因小鼠模型中进行评估，其使用行为Morris水迷宫试验(Morris Water  Maze test)以及测量空斑负载(plaque load)的免疫组织学试验和测量小鼠脑中的β- 淀粉状蛋白_1-40和β-淀粉状蛋白_1-42水平的ELISA试验。

a)方法

i)介绍

该研究旨在使用5个月(±2周)龄的雌性hAPP Tg小鼠评估试验物质(XG-102, SEQ ID NO:11)对行为、生物化学和组织标记的效力。因此，小鼠每二或三周处理 一次多至4个月，并且在处理时期的结束时，在Morris水迷宫中评估行为。在牺牲 时，收集脑、CSF和血。Aβ40和Aβ42水平在四个不同的脑匀浆组分中以及Tg小鼠 的CSF中测定。量化在每个处理组中的8Tg动物的皮层和海马中的空斑负载。

ii)动物

具有C57BL/6xDBA背景和5月龄(±2周)的雌性Tg小鼠被随机分配至处理组1至 3个(n＝12)。动物经受以两个不同浓度施用的载体或XG-102(SEQ ID NO:11)，在5 月龄开始并连续多至4个月，每二周或三周皮下施加(s.c.)。用于本研究的所有动物 具有黑眼睛并且可能察觉MWM池之外的界标。然而，动物的视觉能力不佳的必须 被排除，其在可见平台训练——所谓的预试验——中检验，在所有动物的处理开 始之前，包括保持封闭(圈养，enclosed)于该研究。如果具体动物的视觉障碍已经 被确认，那么该小鼠将被从研究中排除。

iii)动物鉴定和住所

小鼠通过耳标记进行个体地识别。它们住在由提供的标准的啮齿 动物草垫上的单独的通风笼(IVC)中。每个笼子包含最多五只小鼠。小鼠根据基于 国际标准撰写的JSW标准操作程序(SOP GEN011)进行饲养。每个笼子通过彩色卡 片进行识别，所述彩色卡片指出研究数量、性别、动物的个体登记号、出生日期 以及筛选日期和治疗组分配。在研究期间的温度维持在大约24℃，相对湿度维持 在大约40-70％。动物在恒定的光周期(12小时光/黑暗)下饲养。普通的自来水对于 动物可随意获得。

iv)处理

如下处理四十只雌性hAPP转基因小鼠：0.1mg/kg b.w./每两周或者10mg/kg b.w./每三周的试验物质XG-102(SEQ ID NO:11)以两个不同剂量(n＝12/组)处理或 者用载体(n＝12)s.c.每三周一次在四个月中处理。

v)Morris水迷宫(MWM)

Morris水迷宫(MWM)任务在100cm的直径的黑色圆形池中进行。自来水装满、 具有22±1℃的温度，并且该池实际上分成四个部分。透明的平台(8cm直径)被放 置在水表面下大约0.5cm处。在整个试验时间期间，除了预实验之外，平台位于该 池的西南象限。在4天持续训练时间之前的一天，动物必须进行所谓的“预-试验” (两个60秒的持续试验)，以保证每个动物的视觉能力是正常的。只有完成了该任务 的动物被装入用于MWM测试。在MWM任务中，每只小鼠在四个连续日上必须进 行三个试验。单个的试验持续最大1分钟的最大值。在这个时间期间，小鼠有机会 发现隐藏、透明的靶标。如果动物不能够发现离开水的“路”，那么研究者引导或 者将小鼠放置到平台上。在每次试验之后，小鼠被允许在平台上休息10-15秒。在 这个时间期间，小鼠具有在环境中定位的可能性。研究在暗淡的光情况下进行， 以阻止跟踪系统免于不良影响(Kaminski；PCS,Biomedical Research Systems)。在游 泳池周围的墙壁上，黑色、粗体几何符号(例如圆圈和正方形)的招贴被固定，小鼠 可以使用所述符号作为它们方位的界标。每个试验的一个游泳组由五至六只小鼠 组成，以确保大约五至十分钟的间隔时间。对于逃出反应时间(时间[秒]，小鼠发 现隐藏的平台和因此从水中逃出所需要的时间)、路径(到达靶标的道路的长度[米]) 和在目标象限中的持续(abidance)的量化，使用计算机化的跟踪系统。计算机连 接到放置在该池的中心上面的相机。相机检测发光二极管(LED)的信号，所述发光 二极管用小的发夹固定在小鼠的尾巴上。在第四天最后的试验之后一小时，小鼠 必须进行所谓的探查试验(probe trial)。在这个时间，平台从该池移出，并且在一 分钟的探查试验期间，试验者计数到先前靶标位置的交叉口的数量。另外，计算 在该象限以及其它三个象限中的持续。在整个该试验中，小鼠不能够从平台得到 任何的线索，不论怎样的脾气(natured)。

vi)组织取样

在处理期间的结束时，并在所有行为试验之后，杀死所有剩下的小鼠(n＝28)。 因此，通过标准的吸入麻醉药(异氟烷、巴克斯特(Baxter))使所有小鼠镇静，如在 SOP MET030中描述。脑脊液(CSF)通过钝性剖割和暴露枕骨大孔(foramen magnum) 获得。在暴露后，巴氏滴管被插入至大约0.3–1mm的深度进入枕骨大孔中。CSF 通过抽吸和毛细管作用收集直到流动完全停止。每个样品的两个等分试样立即冷 冻和保持在-80℃直到准备用ELISA技术进一步分析。在CSF取样后，每只小鼠以 背侧卧放置，胸部打开并且将连接到1cc注射器的26-号针插入右心室腔。对针施 加轻轻的抽吸，并将血液收集入EDTA中，从而用于获得血浆。为了得到血浆，每 只小鼠的血液样品在使用浮桶式转头(GH-3.8Beckman)的离心机(GS-6R  Beckman)中以1,750rpm(700g)旋转10分钟。血浆被冷冻并且在-20℃贮存直到进一 步分析。在血液取样后，转基因小鼠用0.9％氯化钠进行心内灌注。快速地移出大 脑，切掉小脑。所有小鼠的大脑右半球室温下浸没固定在新制的4％多聚甲醛/PBS (pH7.4)中一个小时。在此之后，将大脑转移至15％蔗糖PBS溶液中24小时，以确 保超低温保护。在第二天，大脑在异戊烷中冷冻并且贮存在-80℃直到用于组织学 研究(SOP MET042)。称重大脑左半球和在液氮中冷冻，并且在-80℃贮存用于生物 化学分析。

vii)Aβ_1-40和Aβ_1-42的测定

在每只Tg小鼠的四个不同大脑匀浆部分中以及在CSF样品中，用ELISA技术评 估Aβ_1-40和Aβ_1-42水平。高度灵敏的Aβ_1-40和Aβ_1-42ELISA检测试剂盒从The Genetics  Company^TM,Switzerland(SOP MET058)购买。CSF如上描述制备。对于大脑匀浆， 冷冻半球在包含蛋白酶抑制剂混合物的TRIS缓冲盐水(TBS)缓冲液(5ml)中匀浆。 1.25ml的这种初始大脑TBS匀浆在-80℃贮存，1.25ml进行进一步地研究。离心剩余 的大脑匀浆(2.5ml)并且将得到的上清液(＝TBS部分)等分并且保持在-20℃，直到 ELISA测定。沉淀悬浮在Triton X-100(2.5ml)中，离心，而将上清液(＝Triton X-100 部分)等分并保持在-20℃。用SDS(2.5ml)重复这些步骤。脱离SDS部分的沉淀悬浮 在70％甲酸(0.5ml)中，然后随后离心。得到的上清液用1M TRIS(9.5ml)中和，等 分并且保持在-20℃(＝FA部分)。四个大脑匀浆部分的样品(TBS、Triton X-100、SDS 和FA)用于使用ELISA技术的Aβ_1-40和Aβ_1-42测定。ELISA检测试剂盒从Genetics  Company^TM,Switzerland(SOP MET062)购买。可以假设TBS和Triton X-100溶解单体 至寡聚体结构。像初原纤维的聚合物和水不溶的原纤维可以溶解在SDS和FA中。 在这点上，所有四个部分的研究也提供A聚合状态的了解。

viii)大脑形态学的评估

所有研究的Tg动物的脑组织以完全一样地方式处理以避免由于该方法的变化 引起的偏差。来自24只Tg小鼠(每组8只)的大脑一半，每层20个冷冻切片(总共5 层)，每个10μm厚(Leica CM 3050S)，被矢状地切开，并且对5个(每层一个)进行处 理并评估空斑负载的量。所述五个矢状层根据来自Paxinos and Franklin的“The  Mouse Brain”(2nd edition)的形态学图集对应于图104至105、107至108、111至112、 115至116和118至119。按要求第一层被规定包括具有其CA1、CA2、CA3、GDlb 和GDmb区的整个海马。使用单克隆人Aβ-特异性抗体6E10(Signet)以及硫黄素S染 色，定量地评估在海马中和皮层中的免疫反应。没有使用的剩余脑半球或组织被 保存并在JSW CNS储存直到项目的结束。

b)评估

i)行为

在Morris水迷宫试验中，使用特定的计算机软件测量每只Tg动物的游泳路径的 长度、逃出反应时间、游泳速度和探查试验中到先前模型平台的交叉口以及在该 池的每个象限中消耗的时间。

ii)生物化学评估

来自所有Tg小鼠CSF样品以及大脑制备物的样品用商业可获得的Aβ_1-40和 Aβ_1-42ELISA进行分析。同时进行适当标准品的测量。来自大脑制备物的样品以一 式两份进行分析。由于小的样品量，CSF样品只以单次测量进行分析。

iii)组织学

i1)淀粉状蛋白沉积和空斑负载的测量

对于6E10免疫组织化学，使用以下的评估步骤：

aa)不对图像应用对比(反差)的情况下，对比切片边缘的可视化的图像。

bb)皮层轮廓的交互作图和随后测量皮层面积(＝区域面积)。

cc)感兴趣区域(AOI)的交互作图，在所述感兴趣区域中染色物体基于阈值水 平(对于每个图像是相同的)的一定强度以上和8μm²大小以上进行检测。

dd)在增强信噪比的平滑对比后(对于每个图像是相同的)，测量每个物体的面 积，AOI中的染色面积的总和以及物体的数量。

ee)对海马重复aa)-dd)。

ff)计算平均的空斑大小(＝“空斑的总面积/空斑的数量”)、相对空斑数量和 面积(＝“空斑的数量/区域面积”和“空斑的总的面积/区域面积*100”)。

gg)自动的数据导入Excel电子数据表，包括参数“图像标题、区域面积、空斑 的数量、空斑面积的总和、相对空斑数量、相对空斑面积和平均空斑大小”。标记 的区域分别用于记录图像质量和排除标准。排除标准是切片的缺少部分、多皱纹、 显著缺陷或者染色不一致(例如，由于膨胀，其可以阻止封闭剂的完全反应)。

hh)关闭图像而不保存(为保留原始数据处于原始状态)。

c)结果

i)总的观察结果

总的在40只雌性hAPP Tg小鼠被封闭于该研究。在处理期间完成之前，由于未 知原因这些小鼠中12只动物死亡。

ii)行为结果

MWM中空间学习仍然没有被XG-102(SEQ ID NO:11)处理广泛地影响。 0.1mg/kg处理的小鼠显示在第1天和第4天之间具有更坏的学习表现的趋势。对于所 有组来说，在第1天和第4天的平均表现的两因素方差分析(two-way ANOVA)显示高 度显著的学习(p<0.001)，但也显示处理因素的显著影响(p＝0.045)。然而， Bonferroni后试验没有达到显著性。

iii)生物化学结果

aa)大脑匀浆组分的Aβ水平

用试验化合物XG-102(SEQ ID NO:11)的处理没有影响大脑匀浆Aβ_1-40水平 (参见图11)。Aβ_1-42水平的组差别只在Triton X-100部分中出现。其中，与载体组 (p<0.05)以及高剂量组(p<0.01)相比，用低剂量的试验化合物XG-102(SEQ ID NO: 11)(0.1mg/kg)处理的动物展示显著的减少。

bb)CSF Aβ水平

在用试验物质XG-102(SEQ ID NO:2)处理后，与载体组相比，在CSF中Aβ_1-40和Aβ_1-42水平显著地下降。对于两者，Aβ_1-40和Aβ_1-42的p-值对于高剂量(10mg/kg) 的XG-102(SEQ ID NO:2)为p<0.01和对于低剂量的XG-102(SEQ ID NO:2)为<0.05 (参见图12)。

iv)脑组织学和免疫组织化学的结果

aa)淀粉样蛋白沉积和空斑负载

空斑负载用两种不同方法定量。一方面，进行用6E10的IHC染色，其主要针对 人淀粉状肽的AA1-17，在另一方面，进行硫黄素S染色，标记成熟的神经炎空斑的 β折叠结构和核。首先，测量的区域面积、皮层和海马在整个所有组中是高度稳定 的，表明在切断和IHC步骤中的问题可以被排除，并且在一定程度上也排除处理诱 导的萎缩(用这个方法可以检测到>5％的变化)。6E10和硫黄素S定量显示在XG-102 (SEQ ID NO:11)处理后空斑的中心的β-折叠结构的选择性减少，而人淀粉状蛋白 仍然保持不受处理的影响或者稍微地增加。具体地，皮层6E10IR空斑负载在10 mg/kg XG-102(SEQ ID NO:11)处理的小鼠中相对于载体增加，然而，对于海马空 斑的数量达到显著的水平。图13和14显示，与6E10IHC相比，XG-102(SEQ ID NO: 11)处理产生海马硫黄素S阳性空斑的数量以及面积百分比呈负的剂量依赖性减少 (空斑的数量：XG-102(SEQ ID NO:11)10mg/kg，p<0.05；0.1mg/kg，p<0.01)。 0.1mg/kg XG-102(SEQ ID NO:11)处理也减少平均空斑大小，然而这种作用在 ANOVA中没有达到显著水平(未配对的双尾t检验:p＝0.074)。对于皮层空斑没有给 出这些作用，其是最可能由于海马中的空斑病理比在皮层中稍后发作的情况。处 理在五个月龄开始，正好碰到海马中空斑沉积的时间点，而在三个月龄时皮层空 斑对于定量使用的放大倍率开始变得可见。定量地，6E10与硫黄素S染色的空斑的 比例增加，并且β折叠空斑核尺寸变得更小，如在双标记的切片中可见的。总而 言之，这些数据支持XG-102(SEQ ID NO:11)处理分别对于空斑沉积的早期β折叠 形成和空斑核中的β折叠形成起作用。

d)作用总结和结论

·Morris水迷宫中测量的空间导航仍然保持广泛地不受处理影响。0.1 mg/kg XG-102(SEQ ID NO:11)处理导致在第一训练日和最后训练日之间的稍微差 的学习表现。

·除了Triton X-100部分中的减少，在0.1mg/kg XG-102(SEQ ID NO:11) 组中，Aβ_1-40和Aβ_1-42大脑水平保持稳定。

·在CSF中，Aβ水平的减小对于两个剂量和片段都是可检测的。

·XG-102(SEQ ID NO:11)处理导致6E10定量中的较高剂量组中人淀粉状 蛋白β的倾向性增加，其符合在AβELISA中获得的数据。

·与通过硫黄素S染色检测的海马β折叠负载在XG-102(SEQ ID NO:11) 处理后剂量依赖地减小——在较低剂量的0.1mg/kg XG-102(SEQ ID NO:11)下达 到较高地程度——相比，皮层空斑负载保持不变。根据在处理开始海马中空斑沉 积的年龄依赖的发作，这暗示对于空斑沉积的早期中β折叠形成的早期作用。

实施例15：测定全D逆反IB(s)肽和其变体在II型糖尿病的治疗中的活性

实施例15旨在测定IB(s)肽和全D逆反IB(s)肽和其变体在II型糖尿病的治疗中 的活性，特别是通过每三天评估禁食血糖水平(28天)测定在II型糖尿病的db/db小鼠 模型中用XG-102(SEQ ID NO:11)慢性治疗的效果。

a)材料和方法

i)动物

总共二十只(20)雄性的db/db小鼠(8周龄)从Charles River(德国)获得。当到达 时，动物被分组居住(n＝6-7/组)，并提供常规的啮齿动物食物(Altromin标准#1324 食物；C.Petersen,Ringsted,Denmark)和随意的水，除非另外说明。

小鼠在12:12L/D周期下(灯在4:00打开和在16:00关闭)以及在温度和湿度控制 的房间中居住。

ii)组和随机分组

在第4天，小鼠根据血糖水平(禁食；血糖在Biosen S line analyzer(EKF diagnostic, Germany)上测量)随机分组以参与以下药物治疗组之一(n＝6)：

1)载体对照，S.C.(生理盐水)

2)XG-102(SEQ ID NO:11)；1mg/kg；s.c

3)XG-102(SEQ ID NO:11)；10mg/kg；s.c

列出的所有剂量以游离碱计算。药物纯度：95.28％，肽含量：78.0％。所有化 合物以3ml/kg的体积皮下(s.c.)施用。载体对照和XG-102(SEQ ID NO:11)的配方说 明如下：

首先，XG-102(SEQ ID NO:11)在载体中溶解。配方(0.33和3.3mg/ml的浓度， 分别对应于1和10mg/kg的剂量)依照以下详述的步骤进行制备。考虑试验样品纯度 和肽含量，计算和表述浓度(倍增系数是1.346)。

■储备溶液的制备：冷冻干燥的试验化合物XG-102(SEQ ID NO: 11)解冻1小时并在载体中制备为1mM的储备溶液(对应于3.823mg/mL)。对于每个 处理日，准备等分试样，并在-80℃贮存。在每个处理日稀释该储备溶液到需要的 浓度；

■储备溶液的贮存：在大约-80℃；

■稀释制备物的贮存：最室温下，最多24小时。

在溶解之前，将粉末在-20℃贮存。储备溶液的稳定性在大约-80℃为3个月； 动物给药的稀释配方的稳定性是在室温下24小时。如果保存在4-8℃，没有使用的 稀释材料可以贮存多至7天。

c)实验步骤

在8天的环境适应性后，根据计划组，小鼠在每天08.00AM通过SC给药8小时， 然后在04.00 PM灯关闭，处理21天。然后，在研究第21天上，停止最高浓度的XG-102 (SEQ ID NO:2)(10mg/kg)的给药，而载体对照和XG-102(SEQ ID NO:2)(1mg/kg) 的每天给药继续直到研究第28天。从第28天直到在第111天终止，载体和XG-102 (SEQ ID NO:2)(10mg/kg)处理的小鼠在洗出期间中观察(没有给药)，而用XG-102 (SEQ ID NO:2)(1mg/kg)处理的小鼠在处理28天后被终止。

i)血糖

在给药6小时后，从7小时禁食的动物中测量血糖，这通过在血细胞比容管中 从尾静脉收集10μl血液样品，和随后在Biosen s-line分析仪(EKF-diagnostic；德国) 上分析。

ii)代谢笼

组1+3：小鼠放置在代谢笼中用于记录24小时食物和水摄取以及24小时尿和 粪便产生。小鼠被分成n＝6-7的两个亚组，和随后在研究71-72天上进行代谢表 征。

iii)脂肪因子图(Adipokine panel)

组1+3：在三个时机(研究第57、66和108天)，使用EDTA包被的血细胞比 容管从尾静脉收集血液(100μl)。在血液离心后，收集血浆和在-20℃贮存直到测量。 然后，下述的脂肪因子/细胞因子的图使用Luminex基的7-丛(plex)进行测定：瘦蛋 白、抵抗素、MCP-1、PAI-1、TNF、胰岛素和白细胞介素-6(IL-6)。

iv)终止

组1+3(第111天)：以下器官切除并称重：腹股沟皮下脂肪、附睾脂肪、腹膜后 脂肪、大脑、肝、肾、脾和心脏。以上描述的所有器官是在4％PFA中的样品用于 可能的将来组织-病理检查。同样地，胰腺(整块)进行取样用于可能的体视学和免 疫组织化学分析，并且对眼睛进行取样用于视网膜病的可能的稍后分析。

组2(第28天)：不收集组织或血浆。

c)结果

i)总的观察

在急性给药期间，动物显示正常水平的警觉和活动性，而在药物处理的动物 中没有镇静的迹象。在载体处理的动物中，食物和水摄取在正常范围内。然而， 在大约两周给药后，在皮下组织中观察到结节性纤维质生成，作为对高剂量的 XG-102(SEQ ID NO:2)化合物的反应，这些发展进入组C的所有小鼠的开放性创 伤中。在组B中，观察到轻微的结节性纤维质生成。因而，使用改变的注射部位。 在动物给药结束之后，动物伤愈并且结节性纤维质生成正逐渐消失。我们在载体 处理的动物中没有观察到临床效果。

ii)血糖

禁食血糖水平(绝对和相对)在图15中显示。在组A和C中禁食血糖每三天测 量直到第68天，并且定期地直到在第111天结束。我们观察到，与载体对照相比， 用XG-102(SEQ ID NO:2)(10mg/kg)处理的糖尿病db/db小鼠的禁食血糖水平的 清楚和显著(p<0.001)的下降。用XG-102(SEQ ID NO:2)(10mg/kg)处理的小鼠的 禁食血糖水平达到大约5mmol/L的低稳定水平。这种作用在给药的14天后是明 显的，并且在整个研究中持续，因此在在从第21天至第111天的整个洗出期间的 过程中持续。相比之下，我们在给药的28天期间没有观察到低剂量XG-102(SEQ  ID NO:2)(1mg/kg)的作用。

iii)体重

体重测定(绝对和相对)在图16中显示。我们观察到与载体对照相比，在用 XG-102(SEQ ID NO:2)(10mg/kg)处理的小鼠中清楚且显著(p<0.001)阻止体重增 加。这种作用从给药的第28天是明显的，并且保持直到第111天终止的那天。相 比之下，我们在给药的28天期间没有观察到XG-102(SEQ ID NO:2)(1mg/kg)低 剂量对于体重的作用。

iv)代谢笼

载体或者XG-102(SEQ ID NO:2)(10mg/kg)对于24小时食物和水摄取的作 用，和在研究第68天，在代谢笼中测量的尿和粪便产生在图17(g)和18(归一化 到体重的克数)中显示。我们观察到与载体对照相比，XG-102(SEQ ID NO:2)(10 mg/kg)对任一测量的参数上没有显著的作用，虽然观察到食物摄取和尿产生趋于减 小。

v)脂肪因子

在第57、77和108天测量的载体或者XG-102(SEQ ID NO:2)(10mg/kg)对胰 岛素、MCP-1和IL-6的血浆水平的作用在图19中显示；对tPAI-1、TNF和抵抗 素的血浆水平的作用在图20中显示；我们观察到与载体对照相比，除了血浆抵抗 素的水平之外，XG-102(SEQ ID NO:2)(10mg/kg)对于任一的测量参数没有显著的 作用，所述血浆抵抗素的水平在第77天和108天的XG-102(SEQ ID NO:2)处理的 动物中是显著地高。

vi)结束时组织重量

载体或XG-102(SEQ ID NO:2)(10mg/kg)对于附睾、腹股沟皮下和腹膜后脂 肪垫的组织重量的作用在图21中显示。我们观察到与载体对照相比，在用XG-102 处理的小鼠中附睾(p<0.05)和腹膜后(p<0.01)脂肪质量显著下降。载体或者XG-102 (SEQ ID NO:2)(10mg/kg)对于大脑、脾和心脏的组织重量的作用在图22中显示。 我们观察到与载体对照相比，XG-102(SEQ ID NO:2)(10mg/kg)对于这些参数没有 显著的作用。最后，载体或XG-102(SEQ ID NO:2)(10mg/kg)对于肾和肝的组织 重量的作用在图23中显示。我们观察到与载体对照相比，XG-102(SEQ ID NO:2) 处理的小鼠中肾(p<0.05)和肝(p<0.01)质量显著减小。

总结结果，施用XG-102(SEQ ID NO:11)——10 mg/kg——表现导致血糖水平 的显著下降，因此XG-102(SEQ ID NO:11)似乎是用于治疗糖尿病和升高的血糖水 平的有希望的新工具。

实施例16：优选的实施方式

在以下当中，列出了根据本发明的一些优选的实施方式：

1.包括长度小于150个氨基酸的JNK抑制剂序列在制备用于治疗对象中与 JNK信号传导强烈相关的疾病或病症的药物组合物中的应用，其中所述对象中与 JNK信号传导强烈相关的疾病或病症选自：自身免疫性疾病，心血管疾病，癌疾 病，糖尿病——包括I型或II型糖尿病，炎性疾病，脱发——包括斑秃，肺病， 神经元疾病或神经变性疾病，肝病，脊柱疾病，子宫疾病，病毒感染的疾病和抑 郁症。

2.根据实施方式1所述的应用，其中所述JNK抑制剂序列衍生自由根据SEQ  ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105任一序列限定 或者编码的人或大鼠的IB1序列或者其任何片段或者变体。

3.根据实施方式1或2所述的应用，其中所述自身免疫性疾病选自自身免疫 性疾病，其包括狼疮、红斑狼疮、斯耶格伦综合征。

4.根据实施方式1或2所述的应用，其中所述心血管疾病选自：心脏病和冠 心病，动脉硬化，中风，腹主动脉的扩张诸如肾动脉瘤高血压，心肌梗死。

5.根据实施方式1或2所述的应用，其中所述癌疾病选自：卡波西肉瘤，急 性粒细胞白血病——包括红白血病，黑素瘤，恶性黑素瘤，结肠癌，淋巴瘤，肉 瘤，胚细胞瘤，肾癌，消化道肿瘤，神经胶质瘤，前列腺肿瘤，膀胱癌，直肠癌， 胃癌，食道癌，胰腺癌，肝癌，乳腺癌(＝乳腺癌)，子宫癌，宫颈癌，急性骨髓性 白血病(AML)，急性淋巴白血病(ALL)，慢性髓细胞性白血病(CML)，慢性淋巴 细胞性白血病(CLL)，肝癌，不同病毒诱导的肿瘤诸如例如乳头状瘤病毒诱导的癌 (例如，子宫颈癌＝宫颈癌)，腺癌，疱疹病毒诱导肿瘤(例如，伯基特淋巴瘤，EBV- 诱导的B细胞淋巴瘤)，乙型肝炎诱导的肿瘤(肝细胞癌)，HTLV-1-和HTLV-2-诱导 的淋巴瘤，听神经神经鞘瘤，肺肿瘤(＝肺癌＝支气管癌)，小细胞肺癌，咽喉癌，肛 门癌，成胶质母细胞瘤，直肠癌，星细胞瘤，脑瘤，视网膜母细胞瘤，底细胞癌， 脑转移瘤，成神经管细胞瘤，阴道癌，睾丸癌，甲状腺癌，何杰金综合征，脑膜 瘤，Schneeberger的疾病，功能性垂体瘤，蕈样肉芽肿病，类癌瘤，神经细胞瘤， spinalioma，伯基特淋巴瘤，喉癌，肾癌，胸腺瘤，子宫体癌，骨癌，非何杰金淋 巴瘤，尿道癌，CUP综合征，头/颈肿瘤，少突胶质细胞瘤，阴道癌，肠癌，直肠 癌，食管肿瘤(＝食道癌)，瘤状况况，小肠肿瘤，颅咽管瘤，卵巢癌，软组织肿瘤， 卵巢癌(＝卵巢癌)，胰腺癌(＝胰腺癌)，子宫内膜，肝转移，阴茎癌，舌癌，胆囊 癌，白血病，浆细胞瘤，眼睑肿瘤，前列腺癌(＝前列腺肿瘤)等，或者传染病， 选自：流行性感冒，疟疾，SARS，黄热病，AIDS，莱姆疏螺旋体病，利什曼病， 炭疽和脑膜炎。

6.根据实施方式1或2所述的应用，其中所述炎性疾病选自所述肺的炎症或 者肺病——包括急性呼吸衰竭综合症(ARDS)或肺纤维化，组织的炎症——包括纤 维化组织的形成，其包括纤维囊泡症、脑膜炎、移植物排斥或移植排斥反应。

7.根据实施方式1或2所述的应用，其中所述肺病选自：所述肺的炎症或者 肺病——包括急性呼吸衰竭综合症(ARDS)，涉及呼吸系统的慢性病——包括哮喘， 慢性阻塞性肺疾患(COPD)，肺炎，肺纤维化。

8.根据实施方式1或2所述的应用，其中所述神经元疾病或神经变性疾病： 阿耳茨海默病，帕金森病，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，张力障碍，癫痫，视神经疾 病——包括青光眼，眼感染，多发性硬化，脑膜炎，由神经系统病症或疾病引起 的神经元疾病或者病症或神经系统病症或疾病——包括轴突的“切断”或破裂诸 如轴索显微外科术，疼痛特别是神经性疼痛，病毒性脑病。

9.根据实施方式1或2所述的应用，其中所述肝病选自肝炎、肝毒性。

10.根据实施方式1或2所述的应用，其中所述脊柱疾病选自腰椎间盘突出症。

11.根据实施方式1或2所述的应用，其中所述子宫疾病选自子宫内膜异位。

12.根据实施方式1或2所述的应用，其中所述病毒(感染性)疾病选自或者由 选自以下的病毒引起：HSV，卡波西肉瘤，尖锐湿疣，传染性软疣，登革热，三 日热，埃博拉病毒，感冒，初夏脑膜脑炎(ESME)，带状疱疹，肝炎，单纯疱疹病 毒I型，单纯疱疹病毒II型，带状疱疹，流感病毒，日本脑炎，拉沙热，马尔堡 病毒，麻疹，手足口病，单核细胞增多症，腮腺炎，诺瓦克病毒感染，传染性单 核细胞增多症，天花，脊髓灰质炎(小儿麻痹症)，假格鲁布，传染性红斑，狂犬病， 疣，西尼罗河热，水痘，细胞巨化病毒(CMV)，正痘天花病毒，正痘亚天花病毒， 绵羊副痘病毒，传染性软疣病毒，1型单纯疱疹病毒，2型单纯疱疹病毒，疱疹B 病毒，水痘带状疱疹病毒，伪狂犬病毒，人巨细胞病毒，人疱疹病毒6，人疱疹病 毒7，爱泼斯坦－巴尔病毒，人疱疹病毒8，乙型肝炎病毒，基孔肯雅病毒，奥恙 思恙病毒，风疹病毒，丙型肝炎病毒，GB病毒C，西尼罗河病毒，登革热病毒， 黄热病病毒，羊跳跃病病毒，圣路易脑炎病毒，日本乙型脑炎病毒，波瓦森病毒， FSME病毒，SARS-相关冠状病毒，人冠状病毒229E，人冠状病毒Oc43，环曲病 毒，人类T淋巴细胞病毒I型，人类T淋巴细胞病毒II型，HIV(AIDS)即人免疫 缺陷病毒1型或人免疫缺陷病毒2型，拉沙病毒，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒， 塔卡里伯病毒，胡宁病毒，马丘坡病毒，波尔那病毒，布尼亚病毒，加利福尼亚 脑炎病毒，裂谷热病毒，沙蝇热病毒，托斯卡纳病毒，克里米亚－刚果出血热病 毒，哈扎拉病毒，凯山病毒，汉坦病毒，汉城型病毒，希望山病毒，普马拉病毒， 多布拉伐-贝尔格莱德病毒，图拉病毒，辛诺柏病毒，维多利亚湖马尔堡病毒，扎 伊尔埃博拉病毒，苏丹埃博拉病毒，象牙海岸埃博拉病毒，甲型流感病毒，乙型 流感病毒，丙型流感病毒，副流感病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，呼吸道合胞病 毒，人偏肺病毒，水泡性口炎印第安纳病毒，狂犬病病毒，莫科拉病毒，杜温哈 格病毒，欧洲蝙蝠狂犬病病毒1+2，澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒，腺病毒A-F，人 乳头状瘤病毒，湿疣病毒6，湿疣病毒11，多瘤病毒，腺相关病毒2，轮状病毒， 或环状病毒，水痘——包括水痘带状疱疹，和疟疾病毒。

13.根据实施方式1或2所述的应用，其中所述抑郁症选自：严重抑郁病症， 严重抑郁症，单相抑郁症，临床抑郁症，抑郁症、双相抑郁症、躁狂症和躁狂抑 郁症。

14.根据实施方式1至13任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中所述JNK 抑制剂序列包括范围为5个至150个的氨基酸残基，更优选为10个至100个氨基 酸残基，甚至更优选为10个至75个氨基酸残基，和最优选为范围为10个至50 个的氨基酸残基。

15.根据实施方式1至14任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中所述JNK 抑制剂序列结合c-jun氨基末端激酶(JNK)。

16.根据实施方式1至15任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中当所述 JNK抑制剂序列存在于JNK表达细胞中时，所述JNK抑制剂序列抑制至少一种 JNK靶向转录因子的活化。

17.根据实施方式1至16任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中所述JNK 靶向转录因子选自c-Jun、ATF2和Elkl。

18.根据实施方式1至17任一项所述的JNK抑制剂序列的应用，其中当存在 于JNK表达细胞中时，所述JNK抑制剂序列改变JNK作用。

19.根据实施方式1至18任一项所述的应用，其中所述JNK抑制剂序列由 L-氨基酸、D-氨基酸或者两者的组合组成，优选包括至少1个或者甚至2个，优 选至少3、4或5个，更优选至少6、7、8或9个和甚至更优选至少10个或更多 个D-和/或L-氨基酸，其中在所述JNK抑制剂序列中所述D-和/或L-氨基酸可以以 模块化、非模块化或交替的方式排列。

20.根据实施方式1至19任一项所述的应用，所述JNK抑制剂序列包括或由 以下组成：根据SEQ ID NO:1至4、13至20和33至100的至少一种氨基酸序列， 或其片段、衍生物或者变体。

21.包括通过共价键连接的至少一个第一结构域和至少一个第二结构域的嵌 合肽在制备用于治疗对象中与JNK信号传导强烈相关的疾病或病症的药物组合物 中的应用，所述第一结构域包括运输序列，和所述第二结构域包括在实施方式1 至20任一项定义的JNK抑制剂序列，其中对象中与JNK信号传导强烈相关的所 述疾病或病症为如在实施方式1至13任一项中限定的。

22.根据实施方式21所述的嵌合肽的应用，其中所述嵌合肽由L-氨基酸、D- 氨基酸或者两者的组合组成，优选包括至少1个或者甚至2个，优选至少3、4或 5个，更优选至少6、7、8或9个和甚至更优选至少10个或更多个D-和/或L-氨 基酸，其中所述D-和/或L-氨基酸在所述嵌合肽中可以以模块化、非模块化或交替 的方式排列。

23.根据实施方式21或22任一项所述的嵌合肽的应用，其中所述运输序列包 括人免疫缺陷病毒TAT多肽的氨基酸序列。

24.根据实施方式21至23任一项所述的嵌合肽的应用，其中所述运输序列包 括或由SEQ ID NO:5、6、7、8、21或22的氨基酸序列组成。

25.根据实施方式21至24任一项所述的嵌合肽的应用，其中所述运输序列增 加所述肽的细胞摄取。

26.根据实施方式21至25任一项所述的嵌合肽的应用，其中所述运输序列指 引所述肽的核定位。

27.根据实施方式21至26任一项所述的嵌合肽的应用，其中所述嵌合肽包括 或由以下组成：SEQ ID NO:9至12和23至32任一的氨基酸序列，或其片段，或 其变体。

28.编码实施方式1至20任一项中定义的JNK抑制剂序列或者实施方式21 至27任一项中定义的嵌合肽的分离核酸在制备用于治疗对象中与JNK信号传导强 烈相关的疾病或病症的药物组合物中的应用，其中对象中与JNK信号传导强烈相 关的所述疾病或病症为如在实施方式1至13任一项中限定的。

29.包括实施方式28中定义的所述核酸的载体在制备用于治疗对象中与JNK 信号传导强烈相关的疾病或病症的药物组合物中的应用，其中对象中与JNK信号 传导强烈相关的所述疾病或病症为如在实施方式1至13任一项中限定的。

30.包括实施方式29中定义的所述载体的细胞在制备用于治疗对象中与JNK 信号传导强烈相关的疾病或病症的药物组合物中的应用，其中对象中与JNK信号 传导强烈相关的所述疾病或病症为如在实施方式1至13任一项中限定的。

31.与根据实施方式1至20任一项的JNK抑制剂序列或者根据实施方式21 至27任一项的嵌合肽免疫特异性结合的抗体在制备用于治疗对象中与JNK信号传 导强烈相关的疾病或病症的药物组合物中的应用物，其中对象中与JNK信号传导 强烈相关的所述疾病或病症为如在实施方式1至13任一项中限定的。

32.根据前述实施方式任一项的应用，其中所述药物组合物通过选自以下的给 药途径施用：肠胃外途径，包括静脉内的、肌肉内的、皮下的、皮内的或者经皮 的；肠途径，包括口服的或者直肠的；局部途径，包括鼻的或者鼻内的；和其它 途径，包括表皮的或者贴剂递送。