一种从栀子豉汤中分离纯化总环烯醚萜苷和总大豆异黄酮的方法

摘要

本发明涉及医药技术领域，是一种从栀子豉汤中分离纯化总环烯醚萜苷和总大豆异黄酮的方法。本发明的方法包括用水或乙醇水溶液浸泡或回流制备栀子豉汤粗提物，再采用大孔吸附树脂分别以少量水和不同浓度乙醇水溶液洗脱纯化，减压浓缩后得高纯度总环烯醚萜苷和总大豆异黄酮。本发明制备方法操作简单，成本低廉，产品纯度高、得率高，不污染环境，适于工业化生产。

说明书

技术领域：

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种从栀子豉汤中分离纯化总环 烯醚萜苷和总大豆异黄酮的方法。

背景技术：

栀子豉汤出自《伤寒论》，由栀子和淡豆豉组成。方中栀子是茜草科植 物山栀Gardenia jasminoides Ellis.的果实，具有利胆、促胰腺分泌、降压、 镇静、降温、抗菌抗炎作用，活性成分为环烯醚萜苷，包括栀子苷、京尼 平-1-β-D-龙胆双糖苷、羟异栀子苷、栀子新苷、鸡矢藤次苷甲酯、去乙酰 基车前草酸甲酯、栀子苷酸、栀子素等；方中淡豆豉是由豆科植物大豆 Glycine max(L.)Merr.的成熟种子和青蒿、桑叶等中药经发酵加工而成的制 品，具有抗癌抗突变、防骨质疏松、神经保护、降脂、抗血栓、免疫调节 等作用，主要活性成分为大豆异黄酮类化合物，包括大豆苷、黄豆黄苷、 染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素等。(孙成行，牟光庆等.豆豉 活性成分的研究进展.食品研究与开发，2006，27(9)：157)。栀子豉汤在 临床上的应用表明其可以有效调节和改善焦虑、抑郁、失眠及神经衰弱等 疾病。

目前，国内外对于栀子豉汤有效部位群的制备方法多集中在对于单味 药材栀子有效部位总环烯醚萜苷和淡豆豉有效部位总大豆异黄酮的制备， 例如本申请人的中国专利ZL200510026144.5，公开号为CN1706860A， 发明名称为“一种用栀子果实制备总环烯醚萜苷的方法”，公开了一种包括 用水或乙醇水溶液浸泡或回流制备栀子果实粗提物，再采用大孔吸附树脂 分别以少量水和低浓度乙醇水溶液洗脱纯化，减压浓缩后得高纯度总环烯 醚萜苷的方法。另如河北医科大学的中国专利申请CN200910119135.9，公 开号为CN101530455A，发明名称为“一种从淡豆豉中提取抗氧化活性物 质的方法”，公开了一种采用乙醇提取、聚酰胺纯化、洗脱液浓缩、干燥， 从淡豆豉中提取到抗氧化活性物质的方法，该专利申请未明确提取到的抗 氧化活性物质为哪一类化合物。以上研究从单味药材中提取有效部位，不 能体现复方药材合煎时其相互作用对各有效成分含量和组成的影响，无法 客观全面的反应药对配伍的合理性。

另外，中国专利ZL03153151.2，公开号为CN1579463A，发明名称为 “复方栀豉总提取物及其制剂和用途”，公开了一种以栀子、淡豆豉原料， 使用溶剂提取法、溶剂萃取法、树脂吸附法等工艺制备得到复方栀豉总提 取物，该总提取物可以用于治疗更年期综合征，并且有抗氧化、抗凝血、 抗肿瘤等作用。但该专利未明确总提取物中所含活性成份，特别是前述的 栀子活性成分—总环烯醚萜苷，淡豆豉活性成分—总大豆异黄酮类在总提 取物中的含量不得而知，并且该总提取物的药效未体现栀子豉汤作为经典 方在临床上的应用—有效调节和改善焦虑、抑郁、失眠及神经衰弱等。

因此，尚无文献报导从栀子豉汤中分离纯化得到活性成份--总环烯醚萜 苷和总大豆异黄酮的方法。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种从栀子豉汤中分离纯化总环烯醚萜苷和总 大豆异黄酮的方法。

本发明的主要技术方案在于：为了尽可能提高从栀子豉汤中分离出活 性成份的得率和纯度，采用大孔吸附树脂分离纯化栀子豉汤中的总环烯醚 萜苷和总大豆异黄酮，首先是用少量水洗脱，既可以洗掉部分水溶性杂质， 又可减少强极性的有效成分成分流失，从而提高得率；其次是根据环烯醚 萜苷类成分和大豆异黄酮类成分的极性特点，先用低浓度乙醇(10％～30％) 首先洗脱出环烯醚萜苷类成分，可减少大豆异黄酮中强极性成分被洗脱， 再用高浓度乙醇(40％～80％)洗脱出大豆异黄酮类成分，从而提高纯度。

本发明提供了一种从栀子豉汤中分离纯化总环烯醚萜苷和总大豆异黄 酮的方法，该方法包括以下步骤：

A、制备栀子豉汤粗提物：将干燥栀子果实粗粉和淡豆豉粗粉按重量百 分比为1︰1至4︰1的配比，以水或乙醇水溶液浸泡或回流提取1～3次， 过滤，将滤液减压浓缩至稀浸膏，再真空干燥得栀子豉汤粗提物；

B、分离纯化：将步骤A制得的栀子豉汤粗提物加适量水混悬后，过 大孔吸附树脂，先用少量水洗脱至洗脱液不浑浊，弃去；再用10％～30％ 低浓度乙醇洗脱；最后用40％～80％高浓度乙醇洗脱液洗脱，分别收集洗 脱液，减压浓缩干燥，得总环烯醚萜苷粉末和大豆异黄酮粉末。

步骤A中，栀子果实粗粉和淡豆豉粗粉的重量百分比为1:1、2:1、3:1 或4:1，优选为1:1或2:1。

步骤A中，回流提取用到的乙醇浓度为1％～100％。

步骤B中，用少量水洗脱至洗脱液不浑浊，所述的少量水体积为不超 过1倍树脂量。

步骤B中，所述的低浓度乙醇为10％、20％，或30％乙醇，优选为20％ 乙醇。

步骤B中，所述的高浓度乙醇为50％、60％、70％，或80％乙醇，优 选为60％乙醇。

步骤B中，所述的大孔吸附树脂为1300、D101，或AB-8型大孔吸附 树脂。

本发明方法分离纯化得到的总环烯醚萜苷粉末和大豆异黄酮粉末，按 紫外分光光度法(《中国药典》2010年版一部附录VA)分别在238nm和 260nm处波长处进行检测，测得总环烯醚萜苷纯度不低于70％，得率为 5～10％；总大豆异黄酮纯度不低于40％，得率为5～10％。

对提取物分别进行高效液相分析表明，20％乙醇洗脱液中主要成分有 羟异栀子苷、栀子苷酸、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、栀子苷等环烯醚萜苷 类化合物；60％乙醇洗脱液中主要成分有大豆苷，黄豆黄苷，染料木苷， 大豆苷元、黄豆黄素、染料木素等大豆异黄酮类化合物。

本发明的方法操作简便、成本低廉、得率和纯度高且不污染环境，最 重要的是采用大孔吸附树脂同时分离纯化栀子豉汤中总环烯醚萜苷和总大 豆异黄酮，有效避免单一提取带来的资源浪费，提高效率，为综合研究栀 子豉汤药对的各有效部位药效提供简便易行的方法。

本发明制备工艺简单，总环烯醚萜苷和大豆异黄酮能充分得到分离且 纯度也高，适合工业化生产。

附图说明：

图1为本发明实施例1的流程示意图；

图2为本发明栀子豉汤高效液相色谱(HPLC)的色谱图；

图3为本发明总环烯醚萜苷高效液相色谱(HPLC)的色谱图；

图4为本发明总大豆异黄酮高效液相色谱(HPLC)的色谱图。

具体实施方式：

以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下 实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1：

如图1所示，一种从栀子豉汤中分离纯化总环烯醚萜苷和总大豆异黄 酮的方法，包括：

1.制备栀子豉汤粗提物：取干燥栀子果实药材粗粉300g、淡豆豉药材 粗粉150g，用10倍量50％乙醇回流提取2次，每次1小时，过滤，合并 滤液，60℃减压浓缩至稀浸膏，真空干燥得栀子豉汤粗提物，得率为23.1％。

2.纯化：取上述栀子豉汤粗提物，加水混悬后总体积为2000ml。加 入到装有1500g经预处理过的D101大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸 附2小时。用1500ml水洗脱(弃去)。再用6000ml20％乙醇洗脱，乙醇洗 脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得总环烯醚萜苷粉末24.75g，得率 为8.25％，再用6000ml60％乙醇洗脱，乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干 燥(60℃)，得大豆异黄酮粉末9.75g，得率为6.5％。

将所得粉末按紫外分光光度法(《中国药典》2010年版一部附录VA) 分别在238nm和260nm波长处检测，测得总环烯醚萜苷纯度为73.9％，测 得大豆异黄酮纯度为58.9％。

对栀子豉汤粗提物以及各提取物分别进行高效液相分析表明，20％乙 醇洗脱液中主要成分有羟异栀子苷、栀子苷酸、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、 栀子苷等环烯醚萜苷类化合物；60％乙醇洗脱液中主要成分有大豆苷，黄 豆黄苷，染料木苷，大豆苷元、黄豆黄素、染料木素等大豆异黄酮类化合 物。HPLC分析条件：色谱柱Unitary C₁₈(4.6×250mm i.d.5μm)；流动相为A (0.1％甲酸水溶液):B(乙腈)；梯度洗脱；流速1ml/min；柱温25℃，检 测波长250nm，在此条件下栀子豉汤粗提物色谱图见图2，总环烯醚萜苷 色谱图见图3，其中峰1为京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷，峰2为栀子苷；总 大豆异黄酮色谱图见图4，其中峰3为大豆苷，峰4为染料木苷，峰5为大 豆苷元，峰6为染料木素。

实施例2：

1.制备栀子豉汤粗提物：取干燥栀子果实药材粗粉和大豆异黄酮粗粉 各250g，用10倍量50％乙醇回流提取2次，每次1小时，过滤，合并滤 液，60℃减压浓缩至稀浸膏，真空干燥得栀子豉汤粗提物，得率为21.02％。

2.纯化：取上述栀子豉汤粗提物，加水混悬后总体积为2000ml。加 入到装有1500g经预处理过的AB-8大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸 附2小时。用1500ml水洗脱(弃去)。用5000ml20％乙醇洗脱，乙醇洗脱 流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得总环烯醚萜苷粉末20.00g，总环烯 醚萜苷纯度为70.6％，得率为8.0％。再用5000ml70％乙醇洗脱，乙醇洗脱 流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得总大豆异黄酮粉末15.00g，总大豆 异黄酮纯度为43.6％，得率6.0％。检测方法同实施例1。

实施例3：

1.制备栀子豉汤粗提物：取干燥栀子果实药材粗粉300g、淡豆豉药材 粗粉150g，用8倍量水回流提取2次，每次1小时，过滤，合并滤液，60℃ 减压浓缩至稀浸膏，真空干燥得栀子豉汤粗提物，得率为24.6％。

2.纯化：取上述栀子豉汤粗提物，加水混悬后总体积为2000ml。加 入到装有1500g经预处理过的1300大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸 附2小时。用1500ml水洗脱(弃去)。用4000ml30％乙醇洗脱，乙醇洗脱 流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得总环烯醚萜苷粉末25.60g，总环烯 醚萜苷纯度为70.6％，得率为8.5％。再用8000ml50％乙醇洗脱，乙醇洗脱 流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得总大豆异黄酮粉末8.64g，总大豆 异黄酮纯度为45.9％。得率5.7％。检测方法同实施例1。

实施例4：

1.制备栀子豉汤粗提物：取干燥栀子果实药材粗粉和大豆异黄酮粗粉 各250g，用10倍量水回流提取2次，每次1小时，过滤，合并滤液，60℃ 减压浓缩至稀浸膏，真空干燥得栀子豉汤粗提物，得率为22.1％。

2.纯化：取上述栀子豉汤粗提物，加水混悬后总体积为2000ml。加 入到装有1500g经预处理过的D101大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸 附2小时。用1500ml水洗脱(弃去)。用5000ml30％乙醇洗脱，乙醇洗脱 流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得总环烯醚萜苷粉末19.80g，总环烯 醚萜苷纯度为71.3％，得率为7.9％。再用3000ml80％乙醇洗脱，乙醇洗脱 流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得总大豆异黄酮粉末8.64g，总大豆 异黄酮纯度为42.1％。得率6.2％。检测方法同实施例1。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并 不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前 提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在 本申请权利要求所限定的范围内。