用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的人工抗原及试剂盒

摘要

本发明涉及生物技术、医学免疫学与体外血清学诊断技术领域，尤其涉及一种用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的人工抗原及试剂盒。本发明提供的人工抗原，能够准确、高效、灵敏、特异地检出待测样品中存在的EB病毒Rta蛋白抗体与早期抗原EA抗体。采用所述人工抗原制成的试剂盒，与传统的检测方法相比，提高了鼻咽癌诊断的灵敏度和特异性，缩短了检测时间，使患者能得到及时的治疗，减轻痛苦。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术、医学免疫学与体外血清学诊断技术领域，尤其涉及一种用于联合 检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的人工抗原及试剂盒。

背景技术

EB病毒是Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外 悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到的疱疹病毒颗粒。该病毒是多种恶性肿 瘤(如鼻咽癌)的病因之一，它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。在中国南方 鼻咽癌患病人群中大多都检测到有EB病毒基因组存在。鼻咽癌(nasopharygeal carcinoma, NPC)是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，多发于东南亚地区，在我国南方各种恶性 肿瘤中占第一位。

经多年研究发现，鼻咽癌与EB病毒关系最为密切，EB病毒被激活感染鼻咽部细胞，由 潜伏期进入裂解复制状态时，导致鼻咽部细胞发生异常分裂增生造成癌变。鼻咽癌患者血清 中具有针对多种EB病毒抗原的抗体谱，一般通过检测血清EB病毒抗体来评估患鼻咽癌的危 险度，为鼻咽癌的诊断提供了有效的检测指标。申请号为200610113403的发明专利申请公开 了Rta是EB病毒刚刚进入裂解复制状态时就表达的立即早期基因BRLF1的编码转录激活蛋 白，是EB病毒进入裂解复制状态必需的激活元件而且仅在鼻咽癌发生时表达，对诊断鼻咽 癌具有极高的特异性。现在临床用于诊断鼻咽癌的主要指标为：EB病毒衣壳抗原(VCA)、 早期抗原(EA)，且主要是检测其IgA抗体，用于鼻咽癌患者的诊断和预警。经大量临床实 验证实EB病毒VCA-IgA抗体用于鼻咽癌诊断虽然灵敏度高，但是特异性差，在健康人群中 有很高的检出率；EB病毒EA-IgA抗体用于鼻咽癌诊断特异性好，但灵敏度差，鼻咽癌漏检 率较高。而EB病毒Rta-IgA抗体用于鼻咽癌诊断特异性非常好。

发明内容

本发明针对上述领域存在的问题，提供一种用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病 毒早期抗原(EA)抗体的人工抗原及试剂盒。

本发明请求保护的技术方案如下：

一种用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的人工抗原，其氨 基酸序列的结构为N-R1-R2-C或N-R2-R1-C，其中R1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；R2 的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种含有EB病毒Rta蛋白与早期抗原EA的抗原决定簇的抗原蛋白，包含SEQ ID NO:1 和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

编码上述人工抗原的基因。

上述人工抗原的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

含有任一上述人工抗原的基因的重组质粒。

所述重组质粒，是以表达载体pET32a(+)为骨架载体，以SEQ ID NO:3所示的基因为外 源基因的重组质粒pET32a-Rta-EA。

一种用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的试剂盒，其特征 在于：以上述人工抗原为检测抗原。

所述试剂盒包括酶标板和酶标记的抗人IgA、校准品溶液、阳性对照溶液、阴性对照溶 液、底物显色液、终止液、样品稀释液及浓缩洗涤液，所述人工抗原包被于所述酶标板的反 应孔中。

所述酶标记的抗人IgA在酶标记中所用的标记酶为辣根过氧化物酶，所述显色液由显色 A液和显色B液组成，显色A液为过氧化氢或过氧化脲，显色B液为邻苯二胺或四甲基联苯 胺，终止液为1～2mol/L硫酸或者盐酸溶液，所述辣根过氧化物酶标记的抗人IgA的工作稀 释度为1：5000～1:80000；

或者所述标记酶为碱性磷酸酯酶，显色液为硝基磷酸盐缓冲液，终止液为1～2mol/L氢 氧化钠溶液。

所述校准品溶液为含人EBV-Rta-EA-IgA阳性血清的pH7.4磷酸盐缓冲液，所述阳性对 照溶液为含人EBV-Rta-EA-IgA阳性血清的pH7.4磷酸盐缓冲液，所述阴性对照溶液为含人 EBV-Rta-EA-IgA阴性血清的pH7.4磷酸盐缓冲液，所述样品稀释液为含有0.3M NaCl的 50mM的磷酸盐缓冲液，所述浓缩洗涤液为含有0.02～0.05％(v/v)Proclin300和1.0～2.0％ (v/v)吐温-20的pH值为7.2～8.5的0.01～0.03mol/L的磷酸盐缓冲液。

任一上述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)制备酶标板：

用包被缓冲液将权利要求1所述的人工抗原稀释至100ng/ml，然后加入到酶标板孔中， 每孔100μl，进行反应；所述包被缓冲液为pH值9.0～9.6的0.1mol/L的碳酸盐缓冲液；

甩掉包被液后，拍干，每孔加入200μl的封闭液，反应，甩掉封闭液，拍干，保存；所 述封闭液为含有1～10％(m/m)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；

2)配制酶标记的抗人IgA：

亲和层析纯化HRP标记的抗人IgA，纯度大于95％，效价不低于1:2000；

3)配制校准品溶液、阳性对照溶液、阴性对照溶液、底物显色液、终止液、样品稀释液 及浓缩洗涤液。

本发明所述的抗原蛋白为经优化后的串联表达的EB病毒早期抗原EA和Rta蛋白。具体 地，在NCBI网站查找EB病毒EA抗原(Protein Id：CAA24844.1)、Rta蛋白的氨基酸(Protein  Id：CAA24813.1)序列(GenBank:V01555.2)，对两个蛋白所具有的抗原表位进行分析，选 择抗原表位比较集中且不影响蛋白空间结构的片段，然后对两个蛋白中选择保留的多肽片段 的氨基酸序列信息进行连接得到人工抗原的氨基酸序列，如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所 示；并对编码该人工抗原的核苷酸密码子进行优化，根据优化的基因序列进行人工抗原的基 因合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

利用PCR技术扩增上述合成的人工基因片段，构建至原核表达载体，并在大肠杆菌中表 达该重组蛋白，将纯化后的重组蛋白通过ELISA方法检测EB病毒抗体，用于辅助鼻咽癌的 临床筛查与诊断。实验数据表明，本发明的人工抗原蛋白在鼻咽癌的临床诊断中，对EB病 毒Rta-IgA抗体和EA-IgA抗体的联合检测能够弥补单独检测EA-IgA抗体时灵敏度差这一缺 点，同时增强检测的特异性，为鼻咽癌的诊断提供了有效的检测指标。用本发明的人工抗原 以一定浓度包被酶标板，制成的ELISA检测试剂盒能够准确、高效、灵敏、特异地检测样品 中存在的EB病毒Rta蛋白与早期抗原(EA)的抗体。在鼻咽癌病人血清样本和健康人血清 样本的检测中，鼻咽癌病人的阳性检出率，即灵敏度为91.4％；健康人群检测的阴性率为 96.4％，均高于目前常规使用的单独的EA、VCA抗体的检测，有利于临床鼻咽癌筛查，使患 者得到及时、恰当的治疗。

本发明提供的人工抗原的制成的试剂盒形式不限于包被酶标板，只要是基于ELISA原 理的检测载体，只要采用了本发明的人工抗原，都包括在本发明请求保护的范围内。

本发明所用的表达载体不限于特定的表达载体，只要它能与所述抗原蛋白的DNA片段 重组，形成适合蛋白表达的表达质粒即可。

本发明还提供一种用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原(EA)抗体 的试剂盒，其特征在于包括一个以本发明的人工抗原作为包被抗原的酶标板。

本发明制备的优选试剂盒中，主要试剂采用工作液形式，成本低廉，操作简便，简化了 传统检测方法的步骤，缩短了检测时间，同时能实现多样本处理，提高了检测效率，使医生 能够迅速了解患者的病情，及时提出合适的治疗方案。

本发明的试剂盒采用板式酶标板，能够适应国内普及的检测设备，并且能保证检测的灵 敏度高、特异性好、准确度高、稳定性好。

综上，本发明提供的人工抗原，能够准确、高效、灵敏、特异地检出待测样品中存在的 EB病毒Rta蛋白抗体与早期抗原EA抗体。采用所述人工抗原制成的试剂盒，与传统的检测 方法相比，提高了鼻咽癌诊断的灵敏度和特异性，缩短了检测时间，使患者能得到及时的治 疗，减轻痛苦。

附图说明

图1pET32a-Rta-EA重组质粒图谱

图2BCA-100蛋白质定量试剂盒标准蛋白曲线

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对 本发明的内容和保护范围构成限制。任何人在本发明的启示下或是将本发明与其它现有技术 的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

本发明所用试剂来源及规格如下：

实验所用载体、限制性内切酶、T4DNA连接酶、pMD18-T和pET32a购自TaKaRa公司；

序列合成、引物合成、测序由上海生物工程公司完成；

辣根过氧化物酶购于SIGMA，批号为9003-99-0；

过氧化氢购于SIGMA，批号为7722-84-1；

过氧化脲购于SIGMA，批号为U1753；

邻苯二胺或四甲基联苯胺购于SIGMA，批号为T2885；

1—2mol/L硫酸购于北京化工厂，批号为7647-02-0；

盐酸溶液购于北京化工厂，批号为7647-01-0；

1—2mol/L氢氧化钠溶液购于北京化工厂，批号为1310-73-2。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的常规实验方 法。

实施例1 EB病毒Rta蛋白、EA抗原在大肠杆菌中的串联表达

在NCBI网站查找EB病毒Rta蛋白、EA抗原的氨基酸序列(见序列表SEQ ID NO:7 和SEQ ID NO:8)，采用http://www.imtech.res.in/raghava/bcepred/bcepred_submission.html对 其抗原表位进行分析，对其抗原表位进行选择，获得优化的EB病毒Rta蛋白片段(Seq ID No： 1)和优化的EB病毒EA抗原(Seq ID No：2)，并对密码子进行优化。将优化后的Rta、EA 抗原基因序列组合并合成，用Primer5.0引物设计软件设计引物，

上游引物P1：5’-CCTCGAGATGGCTTCTTCTAACCGT-3’,

下游引物P2：5’-CTGGATCCTTTGGTTTTGAAACGCAG-3’。

Pl、P2引物中分别含有Xho I、BarmH I酶切位点。

利用PCR技术扩增上述合成基因。

PCR反应体系：

PCR反应参数：94℃预变性5min，94℃变性60S，54℃退火60S，72℃延伸60S，共 30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经凝胶电泳后回收大小为1155bp的DNA条带， 如Seq ID No.3所示，为人工抗原基因序列。

将回收后的目的片段与pMD18-T载体连接，转化(具体操作按照《分子克隆指南》进行)， 将经PCR、酶切鉴定的阳性质粒pMD18-Rta-EA进行测序验证，合格后将pMD18-Rta-EA及 表达载体pET32a(+)分别进行Xho I/BarmH I双酶切，回收后进行连接，转化后所得阳性质粒 命名为pET32a-Rta-EA，经测序合格后，将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取转化子， 接种于含100mg/L卡那抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。

将培养物按l％比例接种于含卡那抗生素的新鲜LB培养基中，37℃振荡培养至D_600nm为 0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L，37℃诱导培 养4h，按常规方法离心收集菌体，将采用超声波破碎的细菌上清、沉淀及细菌总蛋白进行 SDS-PAGE电泳分析。结果在64KD附近出现明显的蛋白条带，大小与预期融合蛋白的分子 量一致，用BandScan软件分析，表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的52.3％。按照BCA-100 蛋白质定量试剂盒(北京赛驰生物，产品货号300001-B)操作说明书进行试验，为表达的蛋 白进行定量测定，具体为根据BCA-100蛋白质定量试剂盒标准蛋白所测平均OD值为纵坐标， 各孔的蛋白质浓度(mg/m1)为横坐标制作标准蛋白曲线，经线性回归拟合得回归方程，将样本 的OD值代入，计算出EB病毒pET32a-Rta-EA蛋白浓度为1.78mg/ml。

实施例2 用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与早期抗原EA抗体的试剂盒的制备

(一)试剂盒的组成

1、包被有Rta-EA抗原的酶标板：包被蛋白为高纯度基因重组Rta-EA蛋白，包被浓度可 以为0.05-0.25μg/ml；

2、HRP标记的羊抗人IgA，其工作稀释度可以为1：5000—1:80000；

3、校准品溶液、阳性对照溶液、阴性对照溶液，各1瓶，1ml/瓶；

4、样品稀释液：为含0.3M NaCL的50mM的磷酸盐缓冲液，25ml/瓶，2瓶；

5、底物显色液：由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，7ml/瓶，1瓶；底 物显色液B液为四甲基联苯胺，7ml/瓶，1瓶；

6、终止液：2mol/l硫酸；

7、浓缩洗涤液：pH值为7.4，含有终浓度为0.05％的Proclin300、终浓度为2.0％的吐温 -20、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，40ml/瓶，1瓶。

(二)试剂盒的制备

1、包被有高纯度基因重组Rta-EA抗原的酶标板的制备

(1)包被蛋白为实施例1制备的高纯度基因重组Rta-EA抗原。

(2)抗原包被酶标板的制备：

用包被缓冲液(pH值为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液)将以上EB病毒Rta-EA抗原进行 1：10000稀释，加入到酶标板孔中，每孔100μl，37℃反应2小时，甩掉包被液后，拍干， 每孔加入200μl的封闭液(含终浓度为2％牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液)，37℃反应2小时， 甩掉封闭液，拍干，干燥，用铝箔袋真空包装保存。

2、工作浓度酶溶液的配制

HRP标记羊抗人IgA需经亲和层析纯化，种属特异性强，纯度大于95％，效价不低于 1:2000。选择商品化酶联物稀释液，由biopanda诊断试剂公司生产。

3、校准品、阳性对照、阴性对照的配制

校准品、阳性对照用经检测HIV抗体、HCV抗体和HBsAg均为阴性，用本发明试剂盒 检测EBV Rta-EA-IgA为阳性的血清样本，用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释为相应浓度。

阴性对照用经检测HIV抗体、HCV抗体和HBsAg均为阴性，用本发明试剂盒检测EBV Rta-EA-IgA为阴性的血清样本，用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释为相应浓度。

(三)试剂盒的使用方法

1、检测

向包被高纯度基因重组Rta-EA蛋白的酶标板中加入样本稀释液100μl，每孔加样本10μl， 并在预留的孔中加入EBV Rta-IgG校准品溶液、阴性对照、阳性对照各100μl，用盖板膜封板， 37℃恒温箱中反应30分钟，洗板5次，拍干；每孔中各加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgA 100μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应20分钟，甩干孔内液体，洗板5次，拍干；每孔 加入底物显色液A液过氧化脲50μl，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)50μl，轻轻振荡 混匀，37℃恒温箱避光显色10分钟，每孔加入2mol/L硫酸终止液50μl，轻轻振荡混匀，将 酶标仪波长设定在450/630nm处，测定每孔吸光值(OD值)。

2、检测结果分析

以校准品的吸光度值作为临界值，检测结果高于临界值的样本为阳性，低于临界值的样 本为阴性。

实施例3 本发明试剂盒的临床试验评价

用本发明制备的试剂盒对55例正常人样本和58例确诊鼻咽癌的病人样本进行检测，检 测程序和结果判断严格按照实施例2提供的试剂盒的使用方法进行，同时选用VCA抗体检测 试剂盒和EA抗体检测试剂盒(均商购自中国预防医学病毒学研究所)进行平行检测，具体 操作按照试剂盒说明书进行。检测结果如表1所示。

表1 检测结果比较

由以上结果可以看出，本发明提供的试剂盒在鼻咽癌的诊断和筛查中性能极好，灵敏度 为91.4％，特异性为96.4％，可用于临床使用。