与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方法

摘要

本发明涉及一种与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方法，本发明首次公开了如何在常规育种全程中进行分子标记辅助选择技术的具体实施方法，该方法在利用分子育种元件创制分子标记辅助育种选择群体的前提下，育种全过程均通过分子标记对基因型进行选择，克服了常规育种靠表型选择基因型的缺点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方法，属于分子标记应用技术领域。 

背景技术

作物新品种选育是随着人类文明史发展而一直进行的科学创新。从距今约1万年前开始的随机采集活动到传统农业的大规模生产，世世代代的祖先为我们留下了丰富多彩的各类农家品种，这些农家品种是各国种质库中的占有很高比例的育种材料，也是我们进行新品种创造的珍贵资源。 

1886年前后孟德尔开始的豌豆杂交是现代育种的标志性事件，自此至今的130多年里，育种家通过作物种质或近缘种间有性杂交，培育了数目众多的作物新品种，为满足快速增长的人口提供了粮食安全，对经济迅速发展、社会进步做出了巨大贡献。但常规育种主要采用表型选择方法，在很大程度上依赖于经验和机遇，由此导致的选择盲目性和不可预见性是作物育种效率低，单产徘徊不前的主要原因。 

据统计，大多数常规育种单位选育出品种的组合与杂交组合的比率只有千分之一，形成品种的株系与各代选择株系的比例只有百万分之一，大大浪费了人力物力。近十几年迅速发展起来的生物技术和生物信息技术促进了分子标记的快速发展和应用。而分子标记育种，利用目标基因可追踪的特点可直接对基因型进行选择，在组合配置、F1选留及其后代种植规模上，都会根据目标基因/QTL的有无或聚合情况预先设计和具体实施。因此，分子标记辅助育种，可大大提高育种效率，加快育种进程，一般可节省50％左右的人力物力，缩短1-2年的育种年限。但是，由于小麦基因组特别巨大(1.8×10¹⁰bp)，重复序列多及大多数重要性状为多基因控制的数量性状，仅用某性状的1-2分子标记在杂交选育中随机辅助选择的效果并不理想，因此，小麦的分子标记辅助选择方案在技术上还需完善提高，其高效化和规模化的问题急待解决，分子标记辅助育种必须与常规育种全过程有机结合，才能真正实现和发挥分子标记辅助育种的作用，培育出突破性小麦新品种。 

但目前还没有一种与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方法。 

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方法。 

本发明技术方案如下： 

与小麦常规育种全过程结合的多位点分子标记辅助选择方法，步骤如下： 

(1)在血缘、地理和性状差异的基础上，根据育种目标性状确定遗传背景清晰的亲本材料作为育种元件，然后按照两亲本目标基因/QTL有无和互补选择父本和母本，并配制杂交组合F1；再根据育种目标和有效基因/QTL在杂交后代中的贡献率预测确定1-2个目标性状的2个以上QTL的分子标记，作为后代跟踪标记； 

(2)根据杂交组合F1生长后期性状，淘汰性状差的组合，保留性状好的杂交组合F1 收获籽粒后，经培育发芽后，提取DNA进行目标基因/QTL的检测，根据目标基因/QTL有无或聚合情况，确定性状好的杂交组合F1的淘汰或选留及种植规模；将含有目标基因/QTL且表型有显著杂种优势的组合列为重点选育组合F2，进行大规模培育，将含有目标基因/QTL但表型杂种优势不突出，或不含有目标基因/QTL但表型杂种优势突出的组合列为一般组合F2，进行小规模培育，淘汰没有目标性状基因/QTL且表型无明显杂种优势的组合； 

(3)于冬前分蘖或拔节期，选择重点组合F2的生长健壮植株，提取DNA进行目标性状基因/QTL的标记检测跟踪，生长中后期，依据目标性状基因/QTL的有无及表型综合性状进行田间选优淘劣；对一般组合F2则是先选表型综合性状优良的植株，然后进行目标性状基因/QTL检测；单株收获后进行考种、目标基因/QTL和相应性状的相关分析，根据基因型和表现型的综合结果，按步骤(2)的分类标准，分类获得的重点选育组合F3和一般组合F3，并确定下代种植群体的大小； 

于冬前分蘖或拔节期，选择重点组合F3的生长健壮植株，提取DNA进行目标性状基因/QTL的标记检测跟踪，生长中后期，依据目标性状基因/QTL的有无及表型综合性状进行田间选优淘劣；对一般组合F3则是先选表型综合性状优良的植株，然后进行目标性状基因/QTL检测；单株收获后进行考种、目标基因/QTL和相应性状的相关分析，根据基因型和表现型的综合结果，按步骤(2)的分类标准，分类获得的重点选育组合F4和一般组合F4，并确定下代种植群体的大小； 

于冬前分蘖或拔节期，选择重点组合F4的生长健壮植株，提取DNA进行目标性状基因/QTL的标记检测跟踪，生长中后期，依据目标性状基因/QTL的有无及表型综合性状进行田间选优淘劣；对一般组合F4则是先选表型综合性状优良的植株，然后进行目标性状基因/QTL检测；单株收获后进行考种、目标基因/QTL和相应性状的相关分析，根据基因型和表现型的综合结果，按步骤(2)的分类标准，分类获得的重点选育组合F5和一般组合F5，并确定下代种植群体的大小； 

(4)种植重点选育组合F5和一般组合F5，F5代田间整齐度达标的株系，用分子标记跟踪目标基因/QTL的同时，选择株型优良、产量高、抗逆强的品系，即得。 

步骤(1)中血缘、地理和性状差异的标准为本领域育种常规标准，如：血缘差异即作为两个亲本材料的系谱中没有共同亲本或来源相同的姊妹系等；地理差异即两个亲本来源于不同国别、不同生态区域、不同省份等；性状差异即两个亲本在育种目标如抗病性上的差异即一个抗病、另一个不抗病或产量性状的差异即一个高产、一个低产等。具体可参见：沙征贵，余建华.几个小麦品种主要性状表现和系谱分析.《福建农业科技》，1982年05期。 

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，按照两亲本目标基因/QTL有无和互补选择父本和母本为：根据育种目标，确定含有目标基因/QTL且目标性状表现极端的个体作为育种元件，即亲本；其中，两亲本目标基因/QTL有无是指通过检测，一个亲本中含有该育种目标的目标基因/QTL，而另一个亲本中不含有该育种目标的目标基因/QTL；而两亲本目标基因/QTL的互补是指当育种目标涉及到2个及以上性状时，通过检测，一个亲本中含有一个及以上目标性状的目标基因/QTL，而另一个亲本中含有剩余目标性状的目标基因/QTL；表明这两个亲本的目标基因/QTL是互补的。 

根据本发明进一步优选的，上述确定含有目标基因/QTL的步骤为利用QTL IciMapping version3.2软件(http://www.isbreeding.net)进行确定。 

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，育种目标和有效基因/QTL在杂交后代中的贡献率预测≥10％。 

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，培育数量为杂交组合F1每一株系50～100粒籽粒。 

根据本发明优选的，所述步骤(2)或(3)中，大规模培育为种植1000～2000株；小规模培育为种植100～200株。 

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，所述含有目标基因/QTL是指通过检测含有QTL分子标记的数目至少为2个。 

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，目标基因/QTL聚合是指控制同一个性状的不同位点的聚合或控制不同目标性状的基因/QTL位点的聚合。 

所述步骤(2)中根据杂交组合F1生长后期性状，筛选性状优劣的标准采用本领域常规的评价标准，如可采用《作物育种学总论》(王世杰著，中国农业科学技术出版社，出版号：9787511600103，出版日期2009年8月)中记载的内容。 

所述目标基因/QTL的检测可采用本领域常规技术，即利用目标基因/QTL的分子标记进行分子检测。 

所述步骤(4)中田间整齐度达标的标准采用本领域常规技术，如采用《作物育种学总论》(王世杰著，中国农业科学技术出版社，出版号：9787511600103，出版日期2009年8月)中记载的内容。 

所述步骤(4)中株型优良、产量高、抗逆强的标准采用本领域常规技术，如采用《作物育种学总论》(王世杰著，中国农业科学技术出版社，出版号：9787511600103，出版日期2009年8月)中记载的内容。 

有益效果 

1、本发明首次公开了如何在常规育种全程中进行分子标记辅助选择技术的具体实施方法，该方法在利用分子育种元件创制分子标记辅助育种选择群体的前提下，育种全过程均通过分子标记对基因型进行选择，克服了常规育种靠表型选择基因型的缺点。 

2、本发明首次采用育种元件创制分子标记选择群体，育种元件明确了目标基因/QTL在亲本中的要求，并对所要筛选的育种全过程实施分子标记辅助选择和多基因位点标记，按本所述方法可解决在常规育种中如何使用分子标记和如何取得有效结果的问题，可实现分子标记辅助技术和常规育种的真正结合，提高了选择准确率和选出多基因/QTL聚合的目标品种。 

3.本发明技术方案能够缩短育种周期，降低育种成本和提高育种效率，一个中等规模的小麦育种团队，每年配制杂交组合的数目可减少50％，保留F1组合的比例可减少30％，F2种植面积减少50％，F3-F4代的应选株系可减少60％，从组合配制到参试国家试验的年限缩短2年，育成品种的效率可提高50％。 

附图说明

图1 ：TaGW2-6A基因的分子标记Hap-6A-P1/P2在山农20和山农01-35中的扩增结果； 

图2：标记Hap-6A-P1/P2在F2分离世代部分株系的扩增结果； 

图中：M、marker，1-16、F2株系； 

图3：标记QGW6A-232在01-35及部分F2分离世代部分株系的扩增产物PAGE电泳结果； 

图中：M、marker；1、01-35，2-20、F2株系； 

图4：6个抗白粉病和6个抗条锈病基因分子标记的扩增结果； 

图中：各泳道自左向右依次为DL2000分子量标记、山农20、PH82-2-2和954072； 

A-F、抗白粉病基因Pm12(A)、Pm16(B)、Pm24(C)、Pm30(D)、Pm35(E)和Pm36(F)的分子标记带型；G-L、抗条锈病基因Yr5(G)、Yr9(H)、Yr15(I)、Yr24(J)、Yr26(K)和YrTp1(L)的分子标记带型。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。 

实验材料 

山农01-35、小麦山农20、PH82-2-2、954072山东农业大学农学院农业部谷物品质检测中心品质育种研究室有售； 

PCR仪型号为德国Eppendorf5531梯度PCR仪； 

实施例1 

利用2个大粒基因标记TaGW2-6A和QGW6A-232进行粒重的多位点分子标记辅助选择，包括以下步骤： 

分子育种元件的选择和F1组合配制 

分子育种元件的选择：2008年2-4月利用粒重基因TaGW2-6A的分子标记(Hap-6A-P1/P2)和QGW6A-232分别对250份“973”项目组创制的材料进行鉴定，其中分子标记标记Hap-6A-P1的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，分子标记Hap-6A-P1的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；分子标记Hap-6A-P2的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，分子标记Hap-6A-P2的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；分子标记QGW6A-232的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，分子标记QGW6A-232的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。通过琼脂糖电泳分析和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析筛选出同时含有2个小麦粒重的优异等位基因(Hap-6A-G和QGW6A-232)的育种元件山农01-35作为高粒重分子育种元件(见图1和图3)；山农01-35常年千粒重在60克左右；2008年10月将育种元件山农01-35及其它亲本材料种植于山东农业大学泰安实验农场。 

杂交组合F1配制和分子标记辅助选择群体构建：2008年5月以大粒育种元件山农01-35为父本，以多穗、多粒的山农20、山农22、良星66和良星99等4个小麦品种作母本(不含Hap-6A-G和QGW6A-232两个高粒重基因扩增片断)进行常规杂交，获得4个杂交组合F1，这些组合及其后代即为分子标记辅助选择群体。 

确定杂交组合F1的选留和杂交组合F2种植规模 

2008年10月将4个杂交组合F1种植于大田，每个杂交组合种植2行，每行100粒。2010年夏收根据大田农艺性状和产量杂种优势表现结果，淘汰农艺性状优势较差的组合2个即组合01-35×山农22和组合01-35×良星66，保留其余2个组合；从收获各杂交组合 F2籽粒中各取50粒于7-9月份室内发芽，提取小麦的基因组DNA，用于TaGW2-6A的分子标记(Hap-6A-P1/P2)和QGW6A-232聚合情况的分子检测。 

分子检测步骤如下： 

a、每株系取1-2片小麦叶片，置于2mL离心管中，放入盛有液氮的容器内，冷冻后充分研磨，加入900μL 65℃预热的DNA提取工作液，65℃水浴1h，水浴过程中小心轻摇数次，充分混匀；室温冷却5min后加入等体积的酚：氯仿:异戊醇(体积比为25:24:1)充分混匀30min，10000g离心20min；取上清夜加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，可见絮状DNA析出，10000g离心30min；弃去上清液，用70％的乙醇洗涤沉淀2次，将DNA沉淀晾干，用100μL 1×TE溶液溶解，制得待测小麦的DNA； 

b、TaGW2-6A的分子标记以待测小麦的DNA为模板，分别用分子标记Hap-6A-P1和Hap-6A-P2的检测引物进行PCR扩增，分子标记Hap-6A-P1的上游引物，核苷酸序列如SEQID NO.1所示，分子标记Hap-6A-P1的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；分子标记Hap-6A-P2的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，分子标记Hap-6A-P2的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示； 

引物Hap-6A-P1/P2的反应体系和循环程序如下： 

首先用引物Hap-6A-P1扩增，PCR体系为20μL： 

10×buffer(含Mg²⁺)2μL、dNTP 1.6μL(10mmol L^-1)、每条引物0.4μL、模板DNA 50ng、1U Taq聚合酶、13.4μL ddH₂O。 

PCR扩增程序为95℃预变性5min；95℃变性50s，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。 

第一轮PCR扩增完成后，用引物Hap-6A-P2进行第二轮扩增，PCR体系为20μL： 

10×buffer(含Mg²⁺)2μL、dNTP1.6μL(10mmol L^-1)、每条引物0.4μL、1U Taq聚合酶、13.4μL ddH₂O。 

第一轮的PCR产物稀释100倍作为第二轮PCR反应的模板，反应程序： 

95℃预变性5min；95℃变性50s，57℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。 

扩增完毕后用限制性内切酶TaqI(按产品说明操作)酶切第二轮PCR扩增产物，反应体系为20μL: 

含TaqI酶1μL，10×TaqI buffer2μL，0.1％BSA 2μL,PCR产物10μL，ddH₂O5μL。 

反应温度为65℃，酶切5min后加入loading buffer，PCR产物和酶切片段分别用1.5wt％和2wt％的琼脂糖电泳分离。 

根据获得的结果，如果得到大小为218bp的PCR扩增产物条带，则所述待测小麦为高粒重小麦。 

c、QGW6A-232以待测小麦的DNA为模板，用分子标记QGW6A-232的检测引物进行PCR扩增，分子标记QGW6A-232的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，分子标记QGW6A-232的下游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示； 

该分子标记检测引物的反应体系和PCR扩增条件如下： 

PCR扩增体系为20μL，如表1所示： 

表1 

备注：Mix可用：或(Taq酶 0.25μL，DNA μL配置。) 

扩增条件如表2所示： 

表2 

上述扩增产物用专一性酶HaeIII(酶切位点GGCC，购自大连宝生物工程有限公司)酶切，酶切体系及酶切反应条件如下： 

酶切体系10μL：专一性酶HaeIII 0.3μL，PCR产物3μL，10×NE buffer 0.7μL，ddH₂O 6μL； 

酶切反应条件：酶切体系37℃水浴30min，然后将酶切体系65℃灭活5min。 

将上述扩增产物分别在8wt％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，扩增产物分子量大小为668电泳带，该产物经专一性酶HaeIII(酶切位点GGCC)酶切后，经8wt％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，如不含有303bp片段的小麦材料中，具有千粒重增效基因位点QGW6A-232；若扩增产物酶切成后含有303bp片段，则该小麦材料中不具有QGW6A-232千粒重增效基因。 

本发明所述8wt％聚丙烯酰胺凝胶是指100mL聚丙烯酰胺溶液中含有7.8g丙烯酰胺和0.2g的甲叉丙烯酰胺。 

d、根据TaGW2-6A(Hap-6A-P1/P2)和QGW6A-232两个分子标记位点检测情况，确定F1组合的选留和F2种植规模 

2个F1组合的TaGW2-6A(Hap-6A-P1/P2)和QGW6A-232有利等位基因位点检测情况见表3(图2和图3)，可知在组合01-35×山农20的F2籽粒中两个标记高粒重扩增片段单独出现的概率都超过了60％，而组合01-35×良星99的F2籽粒中两个标记高粒重扩增片段单独出现的概率接近或小于50％，尤其是在两个标记高粒重扩增片段同时出现的概率在两个 组合中差异较大，组合01-35×山农20远远高于组合01-35×良星99，因此，选留组合01-35×山农20，作为重点组合，淘汰组合01-35×良星99。 

表3 2个粒重分子标记在2个组合中的分子检测情况(各检测50粒) 

分离世代的分子标记跟踪检测 

从2009年开始利用这2个粒重的分子标记对F2-5分离世代进行分子标记检测(见图2和图3、表3)，方法同上述分子检测步骤；F2-3世代种植40行(行长2米)，种植600株，每行15株；其中利用TaGW2-6A对600个F2-3单株群体进行检测，425个单株检测含有218bp大片段，154个单株检测含有167bp小片段，21个株系两条带均存在(可能由于TaqⅠ限制性内切酶没切开或种子杂合)。出现大、小片段株系比率约为2.64：1.0。而QGW6A-232分子标记在600个F2-3单株群体中，380个单株检测不含有303bp片段，其余单株是含有303bp片段；其出现的比率约为2:1。在分子标记的600个F2-3单株的平均粒重为45.12g，千粒重范围27.28-65.97g，变异系数为0.1279。粒重大于45克的有458个单株，占总株系数的76.33％，粒重小于45克的有142个单株，占总株系数的23.67％。将分子标记检测和表型调查结合，发现高粒重的分离比例和分子标记检测频率基本一致；同样，在F3-5世代也存在这种趋势。 

将2个粒重分子标记的结果综合分析，并结合粒重表型数据，发现当单株只含有一个粒重有利位点时，其粒重增加的效果不如同时含有这2个粒重有利位点时效果明显。 

通过粒重分子标记结合田间性状选择，先已选育出成穗数和穗粒数同山农20，同时含有这2个粒重有利位点且粒重大大提高(54克以上)的优异稳定株系20株。 

表4 粒重分子标记在F2-3株系中的检测 

实施例2 

在常规育种中利用抗白粉病和抗条锈病基因分子标记进行抗病基因多位点聚合的分子标记辅助选择，培育出高产多抗小麦山农20，包括以下步骤： 

I、含有抗白粉病和抗条锈病基因的亲本的筛选：利用目前已开发且使用效果较好的抗 白粉病基因的分子标记15个、抗条锈病基因的分子标记12个(分子标记序列见表5)，对100份小麦材料进行鉴定筛选，结合调查的农艺性状，筛选出含有抗白粉病基因6个(Pm12、Pm16、Pm24、Pm30、Pm31和Pm35)和抗条锈病基因4个(Yr9、Yr24、Yr26和YrTp1)的亲本PH82-2-2和产量相关性状符合育种目标且含有6个抗白粉病基因(Pm12、Pm24、Pm30、Pm31、Pm35和Pm36)和6个抗条锈病基因(Yr5、Yr9、Yr15、Yr24、Yr26和YrTp1)的亲本954072。 

II、配制组合：以PH82-2-2为母本、954072为父本进行常规杂交，获得F1，同年种植于大田。 

III、分离世代的选择：利用上述亲本中含有的6个抗白粉病基因和6个抗条锈病基因的分子标记对F2代分离群体2200株进行分子标记鉴定，分子标记鉴定步骤参见实施例1，筛选出即含有抗白粉基因又含有抗条锈病基因的单株约200株。 

然后进行自交，F3-5代继续利用这些分子标记进行鉴定，同时进行大田强致病力菌种接种调查抗病性及产量相关性状的调查，筛选出即含有这些抗病性基因且大田表现抗病，同时产量性状如千粒重、穗粒数、产量等表现优异的单株； 

IV、中选单株继续自交，高代稳定后种成6行小区，利用上述6个抗白粉基因和6个抗条锈病基因的分子标记对稳定材料进行分子鉴定，并进行大田强致病力菌种接种调查抗病性，然后调查成穗率、落黄性、株高、株型、抗倒伏性、穗粒数、千粒重、小区产量等性状，综合分析，最后选育出高产多抗小麦新品种山农20。 

表5 用于抗病性基因检测的分子标记 

V、小麦山农20抗病性及产量表现： 

为了更准确地鉴定山农20在生产种植中的抗病性,2010—2013年分别在山东的济宁、泰安、菏泽,安徽的宿州、濉溪、阜阳,河南的商丘、郑州、濮阳及江苏的徐州、新沂、连云港安排了0.67hm²生产示范种植,并按照《小麦白粉病测报调查规范》(NY/T 613-2002)、《小麦条锈病测报技术规范》(GB/T15795-2011)调查田间病害,反应型分为免疫(0)、高抗(1)、中抗(2)、中感(3)、高感(4)。每年每省选3点鉴定抗病性,按抗性最弱点的抗病表现记载结果。 

国家区试中,山农20对2种病害的抗病性在黄淮南片和北片表现不尽相同，年度间也有差异，但总体呈现对白粉、条锈和叶锈病有良好抗性，多为免疫或高抗、或慢锈病(表4)。连续3个生长季在山东、安徽、河南和江苏田间自然感病条件下,对山农20进行抗病性鉴定。总体来看，白粉病由免疫到轻度发生；条锈病由免疫至高抗。山东的抗病表现最好，安徽、河南和江苏抗病性依次减弱(如表6所示)。 

表6 山农20在国家区试中的抗病性鉴定结果 

表中：I:免疫；HR:高抗；MR:中抗；MS:中感；HS:高感；Slow-rusting:慢锈病。 

表7 自然感病条件下山农20对2种主要病害的抗病性鉴定 

表中：0:免疫；1:高抗；2:中抗；3:中感；4:高感。 

分子鉴定发现在山农20中含有6个抗白粉病基因(Pm12、Pm24、Pm30、Pm31、Pm35和Pm36)和6个抗条锈病基因(Yr5、Yr9、Yr15、Yr24、Yr26和YrTp1)(见图4)，聚合了两个亲本中含有的抗白粉病和抗条锈病基因。 

产量表现：在国家黄淮南片中，平均亩成穗44.5万，穗粒数32.4粒，千粒重41.7克，两年平均亩产分别为564.9公斤和542.3公斤，国家生产试验比对照周麦18增产5.47％，居参试品系第1位；在国家黄淮北片中，平均亩成穗42.9万，穗粒数35.1粒，千粒重42.5克，平均亩产548.1公斤，比对照石4185增产5.3％。