一种拟南芥Mo敏感变异株筛选培养基及筛选方法

摘要

一种拟南芥Mo敏感变异株的筛选方法以及筛选所用的培养基和培养方法。此方法筛选出拟南芥Mo敏感的突变体。筛选所用的培养基包括不含钼(-Mo)和含170nM钼(+Mo)的固体培养基。培养方法是：拟南芥M2种子先用75％的酒精浸泡30s，然后在1％次氯酸钠中浸泡10min，最后用无菌去离子水冲洗5-6次，消毒后的种子接种于-Mo或+Mo培养基上，经过4℃春化2天后，置于22℃、16h/8h光暗交替的光照培养箱中垂直培养。筛选方法是：以EMS诱变处理野生型拟南芥Col-0获得的M2代种子为试验材料，通过在-Mo和+Mo的培养基上进行反复筛选培养，根据拟南芥根系在两种培养基上的生长差异筛选出在-Mo培养基上根生长不好而在+Mo培养基上根生长很好的拟南芥Mo敏感变异株，并对其表型进行了分析。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物生物技术，具体涉及一种拟南芥Mo敏感变异株的筛选 方法以及筛选用的培养基。

背景技术

钼(Molybdenum，Mo)是植物生长发育必不可少的微量矿质元素。如果土壤 缺Mo植物无法生长，且植物出现典型的缺素症状，主要表现为：叶片失绿，叶脉 间的组织形成黄绿或桔红色叶斑；叶缘卷曲、凋萎以至于坏死；叶柄和叶脉干枯 等。据报道，自然界土壤中Mo浓度为3-7mg·kg^-1，而地表水中Mo浓度为10-50nM。 世界上许多地方的土壤不能提供植物生长所必需的钼元素，尤其是在酸性土壤 中，然而在自然条件土壤中钼元素含量对植物生长是不足的。

钼在土壤中以辉钼矿(MoS₂)或者水钼铁矿[Fe₂(MoO₄)₃]的形式存在，然而 植物在pH5以上的溶液中以钼酸盐(MoO₄^2-)的形态吸收和转运钼。钼酸在植物体中 主要是形成钼辅因子(Moco)参与植物生理功能。其中，钼是由CNX1催化被插 入到金属靶定的蝶呤(MPT)中，从而代替铜离子靶定的二硫酚硫，这个过程与 肌动蛋白丝相关。也就是说，MPT是GTP经过cPMP循环合成的。Moco也是一些氧化 还原酶的重要组成成分，包括硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)、亚硫酸 盐氧化酶(sulfite oxidase,SO)、黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase, XDH)以及醛氧化酶(aldehyde oxidase,AO)等。除此之外，钼在植物的生长发 育中还有以下主要功能：(1)钼可以提高铁离子等养分的吸收，从而提高植物 光合速率；(2)钼能够促进磷酸酶活性，增加植物体内VC的合成以及有利于糖 类的形成与转化；(3)钼能促进植物产生抗坏血酸以及增加种子的含糖量，从 而增强植物抗寒、抗旱和抗病能力。有机钼肥效高，对防治植物烟草花叶病效果 明显。另外，Moco在古细菌、原核生物以及真核生物中都是高度保守的。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)属于十字花科(Brassicaceae)鼠耳芥属 (Arabidopsis)，由于其基因组(125Mb)是目前已知植物基因组中最小的，这 就使得拟南芥经常被作为植物材料来研究，是典型的模式植物。另外，拟南芥生 长周期短，具有高等植物的一般特点，对研究和阐明植物的生长发育机制具有重 要意义。同时，拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率 很高，容易获得各种功能缺陷型突变体。其中，使用烷化剂甲基磺酸乙酯(ethyl  methanesulfonate,EMS)作为诱变剂现已被广泛运用，它具有突变频率高，易 获得饱和突变，基因突变的多种效应(功能完全缺失、功能部分缺失、功能的数 量性变化、功能的组成性表达)等特点，能够基本满足筛选出各种功能基因缺陷 的突变体。此外，拟南芥基因组的成功测序为基因功能分析和遗传改良奠定了坚 实的基础，继而可以通过图位克隆等方法分离鉴定突变体基因，为进一步揭示基 因的功能以及改良植物品种都具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种拟南芥Mo敏感变异株筛选培养基及筛选方法。

本发明解决技术问题采用如下技术方案：

一种拟南芥Mo敏感变异株筛选培养基，其特点在于由+Mo培养基和-Mo培养 基组成；

所述+Mo培养基组成为每升+Mo培养基中含有pH5.8的1.75mM磷酸钠缓冲液、 1.5mM MgSO₄、2.0mM Ca(NO₃)₂、3.0mM KNO₃、67μM Na₂EDTA、8.6μM FeSO₄、10.3μM  MnSO₄、30μM H₃BO₃、1.0μM ZnSO₄、24nM(NH₄)₆Mo₇O₂₄、130nM CoCl₂、1μM CuSO₄母液各5ml，蔗糖10g，结冷胶5g，余量为水，pH为5.8。

所述-Mo固体培养基为去除(NH₄)₆Mo₇O₂₄成分的+Mo培养基组分。

一种拟南芥Mo敏感变异株的筛选方法，其特点在于，包括如下步骤：

(1)用EMS诱变处理野生型拟南芥Col-0种子，即为M1；将M1种子种植， 收获拟南芥种子M2；

(2)将经消毒处理的拟南芥种子M2接种于-Mo培养基上；在4℃春化2天 后，置于22℃、16h/8h光暗交替的光照培养箱中垂直培养；

(3)将在-Mo培养基上培养一周后的根系较短的幼苗选出，转移到+Mo培 养基上；在22℃、16h/8h光周期的光照培养箱中垂直培养4-5天后，把根系伸 长较好的幼苗再转移到-Mo培养基上；同样条件下培养一周后，将根系生长停滞 或几乎不生长的幼苗移栽到充满蛭石的石棉上，在温室中生长至开花结实，单株 收获拟南芥种子M3；

(4)再将步骤(3)所得的拟南芥种子M3消毒后，分别取同一单株的5粒 种子接种于-Mo和+Mo培养基上，在22℃、16h/8h光周期的光照培养箱中同时 垂直培养进行第二次筛选，若M3种子在-Mo培养基上根长相对较短，且在+Mo 培养基根长相对较长，则该单株植株为Mo敏感的拟南芥变异株；

(5)将筛选出的Mo敏感变异株，移栽到充满蛭石的石棉上，在温室中生 长至开花结实，单株收获拟南芥种子M4；将每个单株收获的M4种子取10粒消 毒后分别接种于含0nM、1.7nM、170nM Mo的+Mo培养基中，以Col-0野生型种 子为对照，通过比较其根系的长度和形态以及叶片的生长情况分析，验证其为 Mo敏感的拟南芥变异株；

所述+Mo培养基组分为每升+Mo培养基中含有1.75mM磷酸钠缓冲液(pH5.8)、 1.5mM MgSO₄、2.0mM Ca(NO₃)₂、3.0mM KNO₃、67μM Na₂EDTA、8.6μM FeSO₄、10.3μM  MnSO₄、30μM H₃BO₄、1.0μM ZnSO₄、24nM(NH₄)₆Mo₇O₂₄、130nM CoCl₂、1μM CuSO₄母液各5ml，蔗糖10g，结冷胶5g，余量为水，pH为5.8。

所述-Mo固体培养基为去除(NH₄)₆Mo₇O₂₄成分的+Mo培养基组分。

所述步骤(1)中拟南芥M2种子消毒处理是指将拟南芥M2种子先用质量分 数75％的酒精浸泡30s，然后在质量分数1％次氯酸钠中浸泡10min，最后用无菌 去离子水冲洗5-6次。

与已有技术相比，本发明有益效果体现在：

本发明采用EMS作为化学诱变剂，它具有突变频率高、易获得基因突变的 多种效应(功能完全缺失、功能部分缺失、功能的数量性变化、功能的组成性表 达)等特点，能够基本满足筛选出各种功能基因缺陷的突变体。另外，Mo是植 物生长发育的必需矿质元素，如果植物缺Mo，会产生专一的病症。同时拟南芥 具有生长周期短、容易培养等优点，为本筛选方法奠定了理论基础。此外，拟南 芥基因组小且成功测序为基因功能分析和遗传改良奠定了坚实的基础，继而可以 通过图位克隆等方法分离鉴定突变体的功能基因。

本发明所筛选出的拟南芥Mo敏感变异株可利用图位克隆技术分离突变体 功能基因，并验证其吸收与转运Mo的功能，为从分子水平阐明植物吸收与运输 Mo的机理以及改良植物品种提供依据。

附图说明

图1：M2代种子在初筛中的根系生长状况。

图2：M3代种子在+Mo和-Mo中的生长情况。

图3：Mo敏感变异株的表型。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施方式对本发明技术方案做进一步解释说明。

(1)二种筛选培养基配制

培养基母液配方：①磷酸钠缓冲液(pH5.8)，1.75mM；②MgSO₄，1.5mM；③ Ca(NO₃)₂，2.0mM；KNO₃，3.0mM；④Na₂EDTA，67μM；FeSO₄，8.6μM；MnSO₄，10.3μM； H₃BO₄，30μM；ZnSO₄，1.0μM；(NH₄)₆Mo₇O₂₄，24nM；CoCl₂，130nM；CuSO₄，1μM。

表1 培养基母液配方

制备过程：依次取上述母液各5mL；蔗糖，10g；结冷胶，5g，加入980mL 蒸馏水，调pH至5.8，置于1L三角瓶中。将三角瓶置于灭菌锅中进行灭菌，灭菌 条件：121℃,20min。灭菌结束后，在超净工作台近火焰无菌条件中，将上述溶 液立即倒平板，在室温、无菌条件下静置、冷却、凝固。+Mo固体培养基中含有 上述所有成分，-Mo固体培养基中不含(NH₄)₆Mo₇O₂₄成分。

筛选方法步骤如下：

(1)用EMS诱变处理的野生型拟南芥Col-0种子，即为M1；将M1种子种 植，收获拟南芥种子M2；其中拟南芥种子M2可通过直接购买获得，也可以将市 购的野生型拟南芥Col-0种子经现有EMS诱变处理方法得到M1种子，然后将M1 种子种植，收获拟南芥种子M2；

(2)将32000多粒拟南芥M2种子先用75％的酒精浸泡30s，然后在1％次氯 酸钠中浸泡10min，最后用无菌去离子水冲洗5-6次，消毒后的种子接种于-Mo 培养基上。经过4℃春化2天后，置于22℃、16h/8h光暗交替的光照培养箱中 垂直培养。

(3)将在-Mo培养基上培养一周后的根系较短的5000株幼苗挑选出来，转 移到+Mo培养基上。在22℃、16h/8h光暗交替的光照培养箱中垂直培养4-5天 后，把根系伸长较好的3200多株幼苗再转移到-Mo培养基上。同样条件下培养 一周后，将根系生长停滞或几乎不生长的576株幼苗移栽到充满蛭石的石棉上， 在温室中生长至开花结实，单株收获300多株拟南芥种子(M3)。

图1所示的为部分经步骤(2)筛选得到的根系较短的拟南芥种子M2幼苗在 +Mo培养基上的根长生长状况，其中同一株幼苗根部靠上的横线为幼苗在-Mo培 养基上的伸长长度，靠下的横线为在+Mo培养基上的伸长长度，而整个幼苗的根 长是经步骤(2)、以及步骤(3)+Mo培养基和-Mo培养基培养后的总根长，图 中可以看出，有多株幼苗在+Mo培养基培养时根伸长较好，但再次转入-Mo培养 基后，根系生长停滞或几乎不再生长。

(4)再将步骤(3)所得的拟南芥种子M3消毒后，分别取同一单株的5粒 种子接种于-Mo和+Mo培养基上，在22℃、16h/8h光周期的光照培养箱中同时 垂直培养进行第二次筛选，若M3种子在-Mo培养基上根长相对较短，且在+Mo 培养基根长相对较长，则该单株植株为Mo敏感的突变体植株，总共筛选出31 株Mo敏感变异株。

如图2所示，6株经步骤(2)和(3)筛选的M3种子取5粒分别接种于-Mo 和+Mo培养基上幼苗的生长状况。其中，-Mo和+Mo培养基上，自左向右各为 5株筛选株，第6株为野生型对照，从图中可以看出，自左向右第2、3株为本 发明所筛选获得的Mo敏感突变体植株。

(5)针对筛选出的Mo敏感突变体植株，移栽到充满蛭石的石棉上，在温室 中生长至开花结实，收获拟南芥种子(M4)。将每个单株收获的M4种子取10粒 消毒后分别接种于含0nM、1.7nM、170nM Mo的+Mo培养基中(所述培养基与+Mo 培养基组份相同，仅将(NH₄)₆Mo₇O₂₄调整为相应的浓度)，以Col-0野生型种子为 对照(图3)，比较其根系的长度和形态以及叶片的生长情况，分析变异株与野 生型在表型上的差异；培养2-3周后，结果显示，与野生型拟南芥相比，在-Mo 培养基中变异株生长明显受到抑制，主要表现为：植株矮小，根系较短，叶片失 绿，叶缘卷曲。而在+Mo培养基中野生型与变异株的生长状况没有明显差异。且 随着培养基中Mo浓度的增加，Mo敏感变异株的缺钼症状在不断恢复。从比对结 果可以进一步验证本发明方法所筛选的突变体植株确为Mo敏感突变体植株。