miR-218-5p化合物作为慢性疼痛标志物和在治疗炎症性慢性疼痛药物中的应用

摘要

本发明涉及一种应用miRNA制备抑制炎症性性疼痛药物，尤其是涉及miR-218-5p化合物的用途，包括：(1)筛选miR-218-5p靶标基因并通过报告基因进行验证，利用完全弗氏佐剂(CFA)制作炎性慢疼痛模型小鼠；(2)利用miR-218-5p模拟物增加该miRNA在炎症慢性疼痛小鼠脊髓表达量；(3)利用Western blot法检测miR-218-5p对CFA致炎症慢性疼痛的SYNGR1蛋白表达的抑制作用；(4)检测miR-218-5p抑制炎症慢疼痛状态的脊髓神经元活动标记物c-fos的表达。本发明工艺简单成本低，采用miR-218-5p有效的抑制了炎性慢性疼痛，为慢性疼痛的防治提供有效干预靶点。具体是miR-218-5p化合物作为慢性疼痛标志物的用途和在制备治疗慢性疼痛药物中的用途。进一步对慢性疼痛病人的血液临床标本进行了定量分析，表明miR-218-5p能作为慢性疼痛发生的标志物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微小RNA分子的用途,尤其是涉及miRNA在炎性慢性疼痛中的用途,具 体是一种miR-218-5p化合物作为慢性疼痛标志物和在治疗慢性疼痛药物中的应用，属于生 物医学材料技术领域。

背景技术

疼痛是临床上最常见的症状之一，长期存在的病理性疼痛伴发着心理和情绪疾病给慢 性疼痛患者在生活上带来了难以忍受的折磨。据统计，全球慢性疼痛的患者高达3.2亿， 全世界各国政府投入了大量的人力及每年上千亿美元的财力试图去攻克这一难题，仅在中 国就存在数以亿计的疼痛患者，这无疑是人类目前迫不及待需要解决的难题。

神经细胞中含miRNA较其他组织细胞多，miRNA在突触部位的选择性聚集或缺失，可以 调节突触局部的基因表达和蛋白合成，影响神经细胞突触功能。神经系统疾病，比如帕金 森、精神分裂症、老年痴呆、亨廷顿病、神经母细胞瘤等都与miRNA表达和功能异常相关。

尽管miRNA与慢性疼痛关系的研究尚处起步阶段，但已有少量基础研究提示miRNA可 能参与痛觉调制。miRNA为新药的开发提供了一个全新思路，很可能是一个有效的药物标靶。 Bai等人通过对大鼠咀嚼肌内注射完全弗氏佐剂(CFA)造成炎症性肌肉疼痛动物模型，并 利用荧光实时定量PCR(qPCR)与原位杂交技术对不同时间点三叉神经节内神经元特异的 miRNA的表达分析发现，患侧miR-10a、miR-29a、miR-98、miR-99a、miR-124a、miR-134 及miR-183等较健侧均有不同程度的表达水平下调，这表明炎症性疼痛与神经元特异的 miRNA表达水平之间存在着一定联系。随后，Favereaux等研究了miR-103介导慢性疼痛的 发生过程，发现CFA疼痛小鼠脊髓背角miR-103表达明显降低，当脊髓背角miR-103过表 达时，钙离子通道Cav1.2-LTC(Cav1.2-comprising L-type calcium channel)的表达则 明显降低，小鼠痛阈显著升高。

关于miR-218-5p作为一种慢性疼痛疾病临床诊断标志物和在制备治疗慢性疼痛药物中 的应用目前尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种miR-218-5p化合物作为慢性疼痛疾病临床诊断的标志物及 其应用。采用化学合成的miR-218-5p有效的降低炎性慢性疼痛阈值，并抑制神经元活动标 志蛋白c-fos的表达，从而进一步明确了炎性慢性疼痛的发病机制，为防治提供有效的干 预靶点。

本发明的另一目的在于提供miR-218-5p化合物作为制备治疗慢性疼痛药物的应用。

本发明的一种应用miRNA制备抑制炎症性性疼痛药物，包括：

(1)筛选miR-218-5p靶标基因，并进行验证，利用完全弗氏佐剂对小鼠足底进行 注射，制作炎性慢疼痛模型小鼠；

(2)利用miR-218-5p模拟物增加该miRNA在小鼠脊髓的表达量；

(3)利用Western blot法检测miR-218-5p模拟物对CFA诱导的SYNGR1蛋白表达 的抑制作用；

(4)检测miR-218-5p抑制炎症慢疼痛状态的脊髓神经元活动标记物c-fos的表达。

所述步骤(1)中的CFA注射量为40微升。

所述步骤(2)中的miR-218-5p模拟物为包含miR-218-5p核酸序列“茎一环”结构 的发夹状结构，其主序列如下附表1(1)。

作为疼痛抑制基因，miR-218-5p能显著抑制慢性疼痛的发生。对慢性疼痛病人的血样 标本进行定量分析发现，miR-218-5p在病人血样中的表达也是明显下调。研究结果表明通 过检测或干涉神经中枢中miR-218-5p的表达可为慢性疼痛的诊断或治疗提供新的方案。

有益效果：

本发明工艺简单，成本低，采用化学合成的miR-218-5p有效的降低了炎症慢性疼痛热 激阈值，从而进一步明确了炎性慢性疼痛的发病机制，为防治提供有效的干预靶点及药物。

附图说明

图1为CFA状态下小鼠脊髓miR-218-5p差异表达；

图2为鞘内注射miR-218-5p模拟物降低CFA小鼠疼痛阈值；

图3为计算机软件分析显示SYNGR1的3’非翻译区存在一个miR-218-5p的作用靶点；

图4为miR-218-5p能够抑制携带SYNGR1靶序列萤光素酶的相对活性；

图5为miR-218-5p能够抑制神经可塑性相关基因SYNGR1蛋白水平的表达；

图6为miR-218-5p能够有效减少炎症状态脊髓神经元标志物c-fos的表达。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。

1、CFA慢性关节炎疼痛模型制备及脊髓水平miR-218-5p表达：

SPF级雄性6周昆明雄性小鼠在异氟醚麻醉下，围绕左后足足跖关节部选择两点皮内 注射无菌完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA；Sigma公司)40μl,该注射浓度可 诱导产生关节炎。在注射后的24小时即出现热和机械痛觉阈值的降低并可维持3周以上。

MiR-218-5p的表达分析：运用miRNA检测试剂盒对miR-218-5p进行荧光定量分析， 结果显示，CFA三天小鼠脊髓表达量发生显著下调表达(附图1)。

2、采用miR-218-5p模拟物在体过量表达脊髓miRNA。

采用合成miR-218-5p的RNA序列。先将miR-218-5p用脂质体包裹：脂质体与5％葡 萄糖液按2:3比例混匀后，迅速加入等体积的miR-218-5p(25μM)溶液，充分混匀，室温下 静置10分钟后应用，即为脂质体miR-218-5p混合物。再将混合物进行鞘内注射：每只小 鼠每天麻醉后，注射2次miR-218-5p(25μM)，每次10μl，每次时间12小时，注射后注射 器停留组织内60s，共2天，最后一次注射2h后开始检测。

疼痛行为监测：热痛觉过敏：将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，按Hargreaves 法用热辐射刺激以照射大鼠足底紧贴玻璃板部位。记录照射开始至大鼠出现抬足时间，截 止时间为20s。每只动物测定3次，取其平均值，每次测定时间间隔5min。结果表明，鞘 内注射miR-218-5p模拟物后可显著降低疼痛阈值(附图2)。

3、miR-218-5p靶基因的筛选方法

运用TargetScan,PicTar等软件检索miR-218-5p可能的靶基因，发现SYNGR1基因的3’ 非翻译区(3'UTR)含有1个miR-218-5p的靶位点(附图3)，靶位点序列见附表1(2)。选定 神经可塑性相关基因SYNGR1作为候选被调控基因。

4、报告基因验证SYNGR1是miR-218-5p的靶基因

构建psiCHECK2-SYNGR1-3'UTR重组质粒，与miR-218-5p模拟物共转染工具细胞 293T，转染24h后冻融细胞一次，用专用裂解液裂解细胞，每孔100u1，吹打均匀，充分 裂解后样品备用。采用Promega公司的萤光素酶检测试剂盒，在1.5m1离心管中加入LAR 工工50u1和裂解液5u1混匀，酶标仪检测萤火虫萤光素酶；加入50u1Stop&Glo溶液灭 活萤火虫萤光素酶，酶标仪检测海肾萤光素酶。结果显示，转染scRNA对萤光素的表达无 影响。而转染miR-218-5p模拟物后萤光素的表达分别下降了约40％左右(见附图4)。

5、利用Western blot法检测miR-218-5p模拟物对CFA诱导的SYNGR1蛋白表达的抑 制作用

制备CFA炎性慢疼痛小鼠，鞘内注射miR-218-5p模拟物，2天后取小鼠脊髓腰膨大 区蛋白样品进行电泳。电泳时，按每孔20u g蛋白上样量等量上样。以150V电泳1.5h,100V 电压下转膜1h。将膜放入自封袋中，加入5％脱脂奶粉/TBST，完全浸泡膜并封口，于室温 下振荡封闭1h。加入TBST稀释后SYNGR1或对照GAPDH抗体一抗(抗血管紧张素1型 受体抗体按1:1000稀释，抗GAPDH抗体按1:1000稀释)，4℃振荡孵育过夜。吸净一抗， TBST漂洗膜5min X3；加入稀释后的二抗(均为1:5000稀释)，水平摇床室温孵育1h。吸净 二抗，TBST漂洗膜，5min X3，等体积混合ECL(AB液)，充分覆盖湿润NC膜表面，静 置lmin；于暗室中用保鲜膜将NC膜封好，将X光片平放于NC膜上显影并记录数据。结果 可见，在CFA的刺激下，脊髓腰膨大区SYNGR1蛋白的表达量明显升高。然而鞘内增加了 miR-218-5p模拟物的表达量后，CFA诱导的SYNGR1蛋白的表达量明显下降。(见附图5)

6、免疫组化检测鞘内注射miR-218-5p模拟物c-fos表达

石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每 次3分钟(3×3’)。取一定量pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾， 将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处 理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后 用PBS冲洗2×3’。每张切片加1滴3％H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化 物酶的活性。PBS冲洗3×3’。去除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体(c-fos抗 体)，室温下孵育2小时。PBS冲洗3×5’。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂， 室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物， 室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’。除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液(二 氨基联苯胺)，显微镜下观察5分钟。苏木素复染，0.1％HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切 片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。鞘内增加了miR-218-5p 模拟物的表达量后，CFA诱导的c-fos蛋白的表达量明显下降。(见附图6)