SETD4在制备胰腺癌诊断和/或预后试剂盒中的用途及SETD4阻断剂在制备治疗胰腺癌药物中的用途

摘要

本发明提供了SETD4在制备胰腺癌诊断和/或预后试剂盒中的用途。还提供了SETD4阻断剂在制备治疗胰腺癌药物中的用途。本发明通过研究证实SETD4在胰腺肿瘤细胞和肿瘤干细胞中高表达，SETD4可应用于诊断胰腺癌，并作为预测治疗效果的指标预测预后；阻断SETD4表达可抑制胰腺肿瘤生长，抑制胰腺肿瘤干细胞，可作为胰腺癌治疗新药和生物免疫治疗的新靶点。

说明书

技术领域

   本发明涉及组蛋白甲基转移酶SETD4在制备胰腺癌诊断和/或预后试剂盒中的用途以及SETD4阻断剂在制备治疗胰腺癌药物中的用途，属于医药生物技术领域。

背景技术

胰腺导管腺癌（PDAC）是目前恶性程度最高的恶性肿瘤之一，也是全世界主要的致死癌症之一，估计每年导致227,000患者死亡。通常诊断时已发展为晚期，只有低于20%的胰腺癌可以手术切除；40%呈现局部侵润，无法手术切除病灶；剩余的病人诊断时已出现病灶转移。并且胰腺癌对常规化疗、放疗不敏感（1，2）。目前的治疗方案无法明显延长患者的生命，并且临床治疗结果在过去的35年里没有大幅改进，总体5年生存率在5%左右，大部分晚期患者平均生存期不到一年（2，3）。胰腺癌的早期转移是其主要的致命原因。有证据表明，这一过程可能是通过肿瘤干细胞CSCs来实现的，并且这类细胞具有上皮间质转化(EMT)的特性（4）。

肿瘤的形成有两种学说。Stochastic学说认为每一个肿瘤细胞都是同质的，每一个肿瘤细胞都有形成一个新肿瘤的可能。但其进入细胞的增殖分裂周期是由一些小概率的随机事件控制。Hierarchy学说认为肿瘤细胞中存在一个细胞亚群：肿瘤启动细胞，只有这个亚群中的细胞才有形成新的肿瘤的能力，同时此类细胞具有自我更新和多向分化的能力。肿瘤启动细胞，即肿瘤干细胞导致了肿瘤的发生和发展（13）。

2006年AACR（11）(American Association for Cancer Research)对肿瘤干细胞的定义是：肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，该细胞能分化成组成肿瘤的不同细胞。正常干细胞与肿瘤干细胞具有相似的生物学特性：自我更新、无限增殖、多向分化等，区别在于正常干细胞的无限增殖能力受机体调控，通过突变可以使正常干细胞的增殖能力失控；而肿瘤干细胞的增殖是不受调控的。干细胞在体内存活时间长，具有自我复制的潜能，更有可能累积突变，从而由量变到质变成为肿瘤干细胞（12）。

肿瘤干细胞目前主要利用细胞表面标志来定义，每一个肿瘤细胞具有独特的细胞表面标志可以被识别出。1997年多伦多大学Dick和Bonnet等首次分离出白血病肿瘤干细胞（CD 34+/CD38-）（6）。2007年Li (李晨蔚)、Clarke和Simeone等首次证实胰腺癌干细胞存在（CD44+CD24+ESA+），该类细胞具有高致瘤能力以及可自我更新并产生不同细胞群体的肿瘤干细胞特性（7）。Hermann等报道CD133阳性细胞具有高度致瘤性和抗药性（8）。Rasheed 等的研究发现ALDH阳性肿瘤细胞具有肿瘤干细胞的特性和EMT的特性（9）。Li(李晨蔚)和Simeone  报道c-Met是一种新的胰腺癌干细胞表面标志物，并且可作为治疗的有效靶点（5）。Rhim等已经证明了进入血液循环的肿瘤细胞和原位肿瘤细胞相比CD44 + CD24 +细胞增加了 100倍（18）。

常用的肿瘤干细胞分选方法有3种。1、通过表型分选胰腺癌干细胞：肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞在形态学上没有差异。区分肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞的一种方法是通过表面标志物。Li等（7）通过异种移植模型培养人胰腺癌原代细胞，以CD44、CD24、ESA为表面标志物通过流式细胞仪分选出约0.2％~0.8％表型为CD44+CD24+ESA+的高致瘤性细胞群，并在动物成瘤模型中证实该种细胞具有高致瘤能力。Huang等（14）以CD44、CD24为表面标志物在胰腺癌细胞株PANC-1中分选出CD44+CD24+的高致瘤性细胞，并在裸鼠的体内成瘤实验中证实该表型的细胞的致瘤能力较CD44－CD24－的细胞强20倍。Hermann等（8）通过免疫磁珠分选法在人胰腺癌组织及胰腺癌细胞株L3.6pl分选出CD133+的细胞，并在无胸腺小鼠的体内致瘤实验中证实该种细胞具有高致瘤能力，500个该种细胞即可成瘤。2、侧群细胞分选：在没有明确的肿瘤干细胞的表面标记时，可以利用侧群细胞(side population，SP)泵出Hoechest染料的特性结合流式细胞技术分选SP细胞。Zhou等（15）以Hoechst 33342和PI染料染PANC-1细胞，然后通过流式细胞技术分选出侧群细胞。以荧光显微镜形态学检查证实PANC-1细胞株中存在淡染的SP细胞。3、球囊培养：悬浮细胞球囊培养法是另一种常见的干细胞分选方法。Gou等（16）以DMEM-F12为基础培养基。添加了EGF、胰岛素等因子，在PANC-1细胞株中培养出球囊细胞，通过Hoeehst染色发现98.10％±1.26％的细胞未着色。裸鼠的体内成瘤实验也证实球囊细胞较贴壁细胞的成瘤能力强约20倍。

最初在果蝇的3个调节因子即Su(var)3?9, Enhancer of zeste (E(z))和 trithorax (trx)的梭基末端均发现一由130左右氨基酸组成的共同的序列基序,故取其字首字母将该序列基序命名为SET结构域（17）。SET结构域是一高度保守的结构域,在真核生物中,SET结构域广泛参与活化及抑制性复合体的形成,对生物体的发生发展起重要作用。目前已发现300多种已分离鉴定以及理论假设的含有SET结构域的蛋白,将其统称为SET基因家族。

组蛋白氨基末端的多样化修饰已经形成了一个复杂的网络,大大丰富了传统遗传密码的信息含量。组蛋白的甲基化修饰主要是由一类含有 SET 结构域的组蛋白甲基转移酶来执行的, 但并非含有 SET 结构域的蛋白质都是甲基化组蛋白, 目前已经发现和证实有大概700 多种含 SET 结构域的组蛋白甲基转移酶, 其中人源的就有 100 多种, 它们参与了异染色质形成、基因印记、X 染色体失活和转录调控等多种生理功能（18）。组蛋白甲基化的异常与多种人类疾病如肿瘤的发生等相关。现已明确SET基因家族大部分成员具有组蛋白甲基转移酶的功能。由于SET基因家族的成员较多，目前研究较多的为：

（1）SU(VAR)3-9亚家族： SU (VAR)3-9亚家族有30多个成员,主要包括Suv39h1、Suv39h2、G9a、ESET、EuHMTaseI等蛋白。实验显示双基因敲除鼠的Suv39h1/h2后,H3K9甲基化水平降低,基因组明显缺乏稳定性；淋巴结穿刺证实有33%的鼠存在B细胞淋巴瘤。目前认为,suv39h1/h2是通过与Rb相互作用调节Cyeline E ,因此任何破坏Suv39h1/h2与Rb结合的因素在肿瘤发生中均发挥重要作用（19）。

（2）SET 1亚家族： SET 1亚家族包括E(z)亚家族,即poly-comb蛋白、Enhancer  of  Zeste1和2(EZH1、EZH2),以及人类Trithorax蛋白MLL1-3及Tritho-rax相关蛋白(ALR)。该家族成员的共同特征为紧邻SET结构域的下游存在一个半胱氨酸富含区CXC。由于SET 1家族基因控制细胞分裂、分化及发育,故PcG、trxG等基因的失调会引起肿瘤的发生。实验已证实trxG亚家族成员与肿瘤形成有密切的关系，如:MLL1所在染色体11q23区带在白血病人中常发生基因重排、转座,使得MLL1基因发生断裂,表达缺失SET结构域,失去MLL1基因本身的功能,或发生部分复制、缺失,形成融合蛋白获得新的功能（20）。大约80%的不同类型白血病患儿中也发生此类突变。

（3）SET 2亚家族：SET2亚家族包括SET2,NSD(nuclear receptor-binding SET-domain-containing)。SET2具有H3K36甲基转移酶的活性。由于NSD包含SET结构域,与ySET2高度同源,推测NSD蛋白亦有甲基转移酶的活性,参与染色体的调节（21）。   当NSD2过表达时,可诱导转化。如骨髓瘤病人可见免疫球蛋白H链与NSD2融合,导致H链的过分表达。由此可见NSD2低水平表达时可促进发展,高水平表达或表达失调则引起细胞恶性转化,导致肿瘤形成。

（4）RIZ亚家族：RIZ是Rb结合蛋白,也是雌激素受体的辅因子。在氨基端有SET结构域,梭基端存在另一保守的结构域,故可被二聚体化。在许多肿瘤中常见RIZ1基因的减少和缺失,RIZ2的高表达,提示RIZ有特殊的阴阳调节作用。此外在37%原发肿瘤如结肠、胃、胰腺癌中可见RIZ基因SET结构域区或邻近SET结构域区发生移码突变及错义突变,使SET结构域中的106位半胱氨酸转变为苏氨酸,失去甲基转移酶的活性,引起细胞增殖和肿瘤形成。目前RIZ基因家族已被用于临床肿瘤治疗的靶标。

SETD4（组蛋白甲基转移酶）属于SET家族蛋白中的新成员，目前关于SETD4的功能研究少有文献报道。SETD4主要由两个结构域组成，位于羧基末端的SET结构域(人第34到279位氨基酸)和位于氨基端末端的底物结合结构域(人第307位到425的氨基酸)。SET结构域由两端的SET-N，SET-C以及中间的SET-I组成，SET-N和SET-C高度保守，羧基端包含许多直接与活性相关的氨基酸残基，SET-I的插入数目可多可少，能特异性识别甲基转移酶的底物和辅助因子。

研究发现阻断SETD4增加HepG2肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。索拉非尼和阻断SETD4联合治疗下调AKT的磷酸化，从而诱导肝癌细胞死亡。此项研究发现了可能的索拉非尼的敏感性生物标志物和肝癌患者索拉非尼联合治疗的新方法（22）。另一项研究发现组蛋白甲基转移酶 SETD4 和乳腺癌的发生相关。在几种乳腺癌细胞系中定量PCR检测SETD4的表达升高。Western证实SETD4的高表达。在乳腺癌细胞系阻断SETD4显著抑制其增殖和推迟了G1 / S期细胞周期过渡而不影响细胞凋亡。此外，Western数据显示阻断 SETD4降低cyclin D1的表达，提示SETD4参与细胞周期的调控。因此，SETD4在乳腺癌的发生起着至关重要的作用，并可能成为新的乳腺癌的诊断和治疗的方法（23）。

    目前尚未有SETD4 应用在胰腺肿瘤中的报道。

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发明内容

本发明的目的是弥补现有技术的空白，提供了SETD4在制备胰腺癌诊断和/或预后试剂盒中的用途。还提供了SETD4阻断剂在制备治疗胰腺癌药物中的用途。

首先证实SETD4 在胰腺肿瘤细胞，胰腺肝转移瘤细胞和肿瘤干细胞中高表达。进一步证实SETD4 在胰腺肿瘤细胞阳性水平和预后的关系。发现SETD4定量PCR和免疫组化检查可用来诊断胰腺癌，并作为预测治疗效果的指标预测预后。

目前癌症的常规治疗，如放疗、化疗的确能杀死大部分生长迅速的恶性肿瘤细胞，但是对存在于肿瘤中的数量稀少的肿瘤干细胞却作用甚微，治疗后残存肿瘤干细胞的增殖，足以促使癌症复发和转移。有效的肿瘤治疗应该包括针对肿瘤干细胞群的治疗方案。肿瘤干细胞能够无限地自我更新，并且具有相对静止的特征，这些特性和上皮间质转化EMT结合在一起，就能够使它们避免常规化疗方法诱导细胞死亡。导致肿瘤的转移，为导致肿瘤病人死亡的主要原因。

为寻找新的胰腺癌肿瘤方法和靶点，进行了一系列的实验研究和明确了SETD4在胰腺癌治疗中的作用。首先实验发现阻断SETD4 可抑制胰腺肿瘤细胞的生长。体外实验利用Panc-1细胞株进行MTT分析，显示ShRNA阻断SETD4可有效的抑制胰腺肿瘤的生长。同时接种Panc-1细胞到免疫缺陷小鼠建立人源胰腺癌动物模型进行研究，实验证明阻断SETD4 可抑制体内胰腺肿瘤生长。和普通Panc-1细胞相比，Panc-1 细胞转染SETD4 ShRNA后皮下注射裸鼠形成的肿瘤生长受到抑制。并且阻断SETD4联合胰腺癌首选药物吉西他滨（Gemcitabine）治疗效果更佳。利用原代人源胰腺癌动物模型（Patient-Derived Xenograft-PDX）的实验结果和利用Panc-1的结果吻合。

为进一步研究阻断SETD4 可抑制胰腺肿瘤细胞的生长的机理，动物实验获取的肿瘤组织经胶原蛋白酶消化产生单细胞，首先利用CD44和c-Met抗体流式分离获得胰腺癌干细胞，研究阻断SETD4对肿瘤干细胞的影响。同时进行定量PCR分析研究阻断SETD4 对EMT通路的影响。上述实验发现SETD4 ShRNA可明显地抑制胰腺肿瘤干细胞；定量PCR检测发现阻断SETD4可抑制Snail介导的EMT， 从而达到治疗效果。

SETD4可作为胰腺癌治疗新药和生物免疫治疗的新靶点。

本发明通过研究证实SETD4 在胰腺肿瘤细胞和肿瘤干细胞中高表达，SETD4可应用于诊断胰腺癌，并作为预测治疗效果的指标预测预后；阻断SETD4表达可抑制胰腺肿瘤生长，抑制胰腺肿瘤干细胞， 可作为胰腺癌治疗新药和生物免疫治疗的新靶点。 

附图说明

图1为qRT-PCR对比正常胰腺组织，胰腺炎，胰腺肿瘤组织和胰腺肿瘤干细胞中SETD4的表达水平变化对比图。

图2 为21例胰腺癌病人的SETD4表达水平及预后关系图。

图3为体外实验检验阻断SETD4对胰腺癌细胞存活率的影响。

图4为动物实验检验抑制SETD4对胰腺癌生长的影响。

图5为体外实验检验阻断SETD4对胰腺癌细胞EMT的影响。

具体实施方式

本发明中涉及的免疫组化实验、qRT-PCR、MTT、胰腺癌移植瘤动物模型的建立和疗效测试方法、胰腺癌干细胞分选方法和统计学分析方法的操作步骤分别如下。

一、免疫组化操作步骤

1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 

a）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟 

b）无水乙醇中浸泡五分钟 

c）95%乙醇中浸泡五分钟 

d）75%乙醇中浸泡五分钟

2、抗原热修复： 

微波炉加热 在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟， 反复1-2次。用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片

3、免疫组化染色SP法具体操作步骤：

（1）脱蜡、水化   

（2）PBS洗2-3次各5分钟   

（3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟  

（4）PBS洗2-3次各5分钟  

（5）抗原修复   

（6）PBS洗2-3次各5分钟   

（7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体 

（8）滴加Ι 抗50μl,室温静置1-2小时（抗体：SETD4 抗体(N-20)Santa Cruz Biotech） 

（9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟

（10）PBS洗3次每次2分钟 

（11）滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时 

（12）Ⅱ抗中可加入0.05%的 tween-20. 

（13）PBS洗3次各5分钟 

（14）DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度  

（15）PBS或自来水冲洗10分钟  

（16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化 

（17）自来水冲洗10-15分钟  

（18）脱水、透明、封片、镜检。  

4、结果评判

对组织标本的癌组织和正常组织分别进行评价，以细胞出现棕黄色颗粒作为阳性表达的标志。依据参考文献制订以下表达评判标准:染色面积<10%-0分; >11% <25%-1分; >26% < 50%-2分; >51%-3分。染色强度阴性-0分;弱-1分;中-2分;强-3分。

 

二、qRT-PCR操作步骤

一）总RNA抽提

1)细胞培养皿中细胞样品用PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol (invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；

2)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致)

3) 4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管;

4)沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)，室温静置10min;

5)4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清;

6)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min，超净台风干;

7)视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。

二）去基因组步骤操作：

1) 加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，离心15min，取上清。

2) 加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。

3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)，-20℃静置15min;

4)4℃下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清;

5)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)，超净台风干;

6)加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。

三）总RNA纯度和完整性检测

1)纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。

2)总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min，EB染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照总RNA的5s rRNA， 18s rRNA和28s rRNA条带。 

四）mRNA逆转录操作步骤：

1) 在RNase free的PCR管中，加入Total RNA 1.0μg和H2O配置总体积12μl溶液.

2) 将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷， 以防止RNA复性;

3) 在该PCR管中加入Promega试剂

4) 将上述20μl反应溶液30℃保温10min;

5) 42℃保温50min;

6) 85℃保温10min;

7) -20℃保存。

五）定量PCR检测

1、引物测试：

根据mRNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。。

2、体系配制：

H2O                          4ul

SYBR Green PCR Master Mix     10ul (TOYOBO)(使用前需振荡均匀)

上游引物                      0.5ul (10uM)

下游引物                      0.5ul (10uM)

总体积                        15ul

总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中。

3、cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为1:20稀释， cDNA按一定顺序排好后，即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序。

4、把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。

5、打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位，剔除无反应管的孔位。

6、在7500软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称，分类保存好结果文件。

反应完成后，八连管应装到封口袋中，袋子上标记好文件名，客户的名字。(同一个客户的三次重复实验，则只需保存其中一次重复的反应管即可，其余可丢弃) 

三、MTT法实验步骤

1、接种细胞：用含10％胎小牛血清（Thermo）的DMEM 培养液（Hyclone）5%CO2，37℃传代培养，Panc-1来源于ATCC，SETD4 ShRNA（TL301750）为OriGene产品，配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.；

2、培养细胞：同一般培养条件，5%CO2，37℃，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）。

3、呈色：培养3-5天后，每孔加MTT（噻唑蓝）溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。

4、比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

四、胰腺癌移植瘤动物模型的建立和疗效测试方法

1.确定人体结癌组织并通过手术获取癌症组织，或收集培养的细胞株，如Panc-1，SETD4 ShRNA （TL301750）为OriGene产品。

2.尽量缩短肿瘤组织或细胞在体外的停留时间以最大限度的保持肿瘤组织的新鲜程度。

3.用70%酒精进行皮肤消毒后，向两侧每侧移植3块肿瘤组织并进行消毒，或直接注射胰腺肿瘤细胞。免疫缺陷小鼠可以为BALB/C 或NOD/SCID小鼠。

4.每一组取6只。当每只免疫缺陷鼠的移植肿瘤长至平均150mm3 时开始给药。给药方案包括阴性对照和不同的治疗方案及浓度。

5. 给药后，每只免疫缺陷鼠的肿瘤大小变化需要每3-5天测量一次。

6. 药物效果计算公式：T/C（治疗/对照）X100%， 用以评估所有方案的疗效。

五、胰腺癌干细胞分选方法

1.取人胰腺癌标本，或从裸鼠移植瘤模型获取肿瘤标本，利用胶原蛋白酶切消化方法制备细胞悬液，肿瘤组织37℃消化2~3 h，消化后用40uM滤网过滤制得单细胞悬液。

2.用2％FCS RPMI1640/HBSS调整细胞浓度为1百万～5百万／ml。细胞用抗体CD44和c-Met（BD）标记（4℃ 20分钟结合时间。）用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液4ml左右，离心1000rpm×5分钟。

3.H2-Kd去除非胰腺癌细胞(裸鼠细胞)，4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)去除死细胞

4．流式细胞仪（BD Aria）分选人原代胰腺癌CD44+c-Met+细胞，细胞分选2次，保证分选细胞纯度>90%。

 

六、统计学分析方法

数据显示为平均值±SE。统计学显著差异在不同情况下使用Student t检验和X2分析确定，并定义为P<0.05。

实施例1  检测SETD4 在胰腺肿瘤细胞，胰腺肝转移瘤细胞和肿瘤干细胞中表达水平

临床标本入选标准: 接受外科手术切除病例，术后病理诊断为胰腺导管腺癌; 穿刺活检术获得完整组织学标本，病理诊断为胰腺导管腺癌。参与本研究的患者手术或活检前均未接受化、放疗以及免疫治疗。

方法：获取术后和活检正常胰腺组织，胰腺炎，胰腺肿瘤组织，并通过流式分选分离胰腺肿瘤干细胞。抽提RNA后进行qRT-PCR, qRT-PCR操作步骤如上。qRT-PCR对比正常胰腺组织、胰腺炎、胰腺肿瘤组织和胰腺肿瘤干细胞中SETD4的表达水平变化。

结果：如图1所示，定量PCR数据发现SETD4 的表达水平在正常胰腺组织中较低，相对正常组织，胰腺炎SETD4只有轻度上升，而在肿瘤组织升高中6倍， 在胰腺肿瘤干细胞升高近10倍。定量PCR每组分析10例标本。免疫组化检查发现正常胰腺患者只有3.7%为SETD4阳性，胰腺炎为6.5%，胰腺肿瘤组织为72%，胰腺肿瘤肝转移组织为85%（表1）。免疫组化检查每组为16例标本。

结论：SETD4定量PCR和免疫组化检查可用来诊断胰腺癌。

 

实施例2  检测SETD4 在胰腺肿瘤细胞阳性水平和预后的关系

方法：选择具有完整随访记录21例胰腺癌病人，获取病理切片进行SETD4免疫组化检查，免疫组化操作步骤如上。所选患者均术后只进行常规吉西他滨化疗， 无其他治疗记录。

    21例胰腺癌病人的SETD4免疫组化检查分为三组（强阳性为3， 阳性为2， 弱阳性为1），每组7例，进行预后跟踪，跟踪病人的生存时间。

结果：如图2所示，预后跟踪数据表明胰腺肿瘤细胞阳性水平和预后生存期呈反比关系， 强阳性患者预后差，生存期短， 而弱阳性患者预后较好， 生存期较长。

结论，SETD4免疫组化检查水平可用来预测预后，并可作为预测治疗效果的指标。

 

实施例3  检测阻断SETD4表达与胰腺肿瘤细胞的生长关系

1）           阻断SETD4 可抑制胰腺肿瘤细胞存活

方法：体外实验利用Panc-1细胞株进行MTT实验，分析阻断SETD4对胰腺癌细胞存活率的影响。吉西他滨作为对照。

结果：如图3所示，吉西他滨在体外实验对胰腺癌细胞存活率影响不大，而体外实验阻断抑制SETD4可明显降低胰腺癌细胞存活率。

结论：体外实验中阻断SETD4可有效的抑制胰腺肿瘤细胞的存活率。

2）动物实验证明阻断SETD4 可抑制胰腺肿瘤生长。

方法：转染SETD4 ShRNA的胰腺癌细胞和对照组胰腺癌细胞接种到免疫缺陷

小鼠建立人源胰腺癌动物模型进行研究， 检验阻断SETD4对动物模型体内胰腺癌生长的影响。吉西他滨（100 mg/kg 每周两次）连续给药4周后停药，肿瘤体积测量8周。

结果：如图4所示，阻断SETD4 可抑制动物模型体内胰腺肿瘤生长。和普

通Panc-1细胞相比，Panc-1 细胞转染SETD4 ShRNA后皮下注射裸鼠形成的肿瘤生长受到抑制。并且阻断SETD4联合胰腺癌首选药物吉西他滨（Gemcitabine，Gem）治疗效果更佳。利用原代人源胰腺癌动物模型（Patient-Derived Xenograft-PDX）的实验结果和利用Panc-1的实验结果一致。

结论：阻断SETD4可明显抑制裸鼠体内的胰腺癌细胞生长。

3）阻断SETD4 可抑制胰腺肿瘤干细胞和肿瘤的EMT。

方法：将上述动物实验获取的肿瘤组织经胶原蛋白酶消化产生单细胞，利用CD44和c-Met抗体流式分离获得CD44+c-Met+胰腺癌干细胞，研究阻断SETD4对肿瘤干细胞的影响。从细胞内抽提RNA进行定量PCR分析研究阻断SETD4对EMT通路的影响。

结果：利用SETD4 ShRNA阻断SETD4可显著的减少胰腺肿瘤干细胞的数量，并且阻断SETD4联合吉西他滨（Gemcitabine，Gem）治疗效果更佳（表二）。如图5所示，利用消化的肿瘤细胞进行定量PCR检测，发现阻断SETD4可抑制Snail介导的EMT。

   结论：阻断 SETD4可明显地减少胰腺肿瘤干细胞数量，并抑制Snail介导的EMT。

 

综上所述，研究证实SETD4 在胰腺肿瘤细胞和肿瘤干细胞中高表达，SETD4可应用于诊断胰腺癌，并作为预测治疗效果的指标预测预后；靶向SETD4 可抑制胰腺肿瘤生长，抑制胰腺肿瘤干细胞， 可作为胰腺癌治疗新药和生物免疫治疗的新靶点。