流式细胞术鉴别诊断横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤骨髓转移及白血病的荧光探针及试剂盒

摘要

本发明公开了一种流式细胞术鉴别诊断横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤骨髓转移及白血病的荧光探针及试剂盒，所述荧光探针包括四种荧光标记抗体，所述四种荧光标记抗体为均带有荧光标记的GD2抗体、CD90抗体、CD45抗体和CD56抗体，其中，不同的抗体带有不同的荧光标记。所述试剂盒包括探针溶液；溶血剂；磷酸盐缓冲液和阳性标准品。本发明的荧光探针分别能够与骨髓中的横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤细胞及急性白血病原始细胞特异性结合，能够通过流式细胞术快速准确鉴别诊断横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤骨髓转移及白血病细胞这三类儿童骨髓中常见的肿瘤细胞，指导临床治疗，具有较好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种医疗检测试剂，尤其涉及一种流式细胞术鉴别诊断横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤骨髓转移及白血病的荧光探针及试剂盒。 

背景技术

在临床上，儿童骨髓中出现肿瘤细胞常见的是白血病、横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤，正确鉴别三者对患者的治疗具有重要的指导意义。横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤是儿童常见的恶性实体肿瘤，对儿童生命有严重的威胁和危害。部分患者可以通过手术治疗得到康复。但本病易发生骨髓转移，常危及患儿生命，需及时采取化疗、放疗甚至自体干细胞移植等治疗措施。因此对骨髓转移的早期发现、早期诊断及早期治疗是提高治愈率、降低死亡率的关键。 

目前国内外主要通过骨髓细胞形态学检查来诊断横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤骨髓转移，但细胞形态学对于早期转移的患者的诊断不敏感，容易产生假阴性结果，且两者细胞形态学与原始淋巴细胞和原始粒细胞相似，极易被误诊为白血病，同时横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤在骨髓中的细胞形态学也相似而较难鉴别。 

正是由于目前的对诊断和鉴别诊断横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤骨髓转移的各种检查方法还无法满足临床医生的要求，寻求一种快速简便且准确性和敏感性高的方法来诊断和鉴别诊断横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤骨髓转移及白血病的方法极为重要。流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是近年来发展起来的高科学技术，它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行多参数分析，即在同一细胞上进行2-3种或多种抗原的共同表达的分析，在短时间内检测 分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析，具有敏感性和准确性高的特点，目前临床上多运用于白血病和淋巴瘤的骨髓标本的诊断，而对横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤的诊断和鉴别诊断罕见报道。由于两者细胞目前没有单一的特异性的抗原标志物，流式细胞术对鉴别诊断横纹肌肉瘤与瘤神经母细胞瘤骨髓转移及白血病关键在于多种抗体的组合。 

发明内容

本发明提供了一种流式细胞术鉴别诊断诊断横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤骨髓转移及白血病的荧光探针，利用该荧光探针可以快速、准确的得到诊断结果。 

一种流式细胞术鉴别诊断横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤骨髓转移及白血病的荧光探针，包括四种荧光标记抗体，所述四种荧光标记抗体为均带有荧光标记的GD2抗体、CD90抗体、CD45抗体和CD56抗体，其中，不同的抗体带有不同的荧光标记。 

横纹肌肉瘤是儿童最常见的软组织肿瘤，神经母细胞瘤属于神经内分泌性肿瘤，而CD56是一类免疫球蛋白样区域的膜糖蛋白神经细胞粘附分子，在神经外胚层来源的细胞表面表达。CD90和CD56作为粘附分子表达在横纹肌肉瘤细胞及神经母细胞瘤上，NK细胞主要也表达这种140kDa的CD56异构体，而CD45是血细胞系列限制性的膜蛋白分子，表达在除了红细胞外的包括造血干细胞到成熟血细胞（包括NK细胞）膜表面上，因此CD90+CD56+/CD45-表型可以避免误诊为NK细胞肿瘤和白血病，并可以作为判断神经内分泌肿瘤及横纹肌肉瘤存在的指证。 

神经母细胞瘤细胞来源于分化差的神经节细胞，其表面有神经黏附分子CD56抗原和神经节苷脂GD2的表达，而不表达白细胞共同抗原CD45，横纹肌肉瘤是起源于横纹肌细胞或向横纹肌细胞分化的间叶细胞的一种恶性肿瘤，不表达神经节苷脂GD2。同样白血病细胞不表达GD2但其表达白细胞共同抗原CD45及原始细胞标志CD90，因此可以通过多色流式细胞术测定这四种抗原的不同表达来识别横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤及白血病原始细胞这三类儿童骨髓标本中常见的肿瘤细胞。三者具有不同的免疫表型，即： 

横纹肌肉瘤细胞：GD2^-CD90⁺CD56⁺CD45^-； 

神经母细胞瘤细胞：GD2⁺CD90⁺CD56⁺CD45^-； 

急性白血病原始细胞：GD2^-CD90⁺CD56^-CD45⁺。 

本发明联合GD2、CD90、CD56和CD45四种荧光标记抗体作为探针，运用目前医院常见的多色流式细胞仪检测细胞的免疫表型（一管法）即可鉴别诊断横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤骨髓转移及白血病，特异性可达100%。 

具体的，所述四种荧光标记抗体为GD2-FITC抗体、CD90-PE抗体、CD45-PerCP抗体和CD56-APC抗体。 

为保证检测的特异性，四种荧光标记抗体为单克隆抗体。 

本发明还提供了一种流式细胞技术鉴别诊断横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤骨髓转移及白血病的试剂盒，包括： 

（1）探针溶液，包含有四种荧光标记抗体，其中，四种荧光标记抗体为均带有荧光标记的GD2抗体、CD90抗体、CD45抗体和CD56抗体，不同的抗体带有不同的荧光标记； 

（2）溶血剂； 

（3）磷酸盐缓冲液； 

（4）阳性标准品。 

所述的探针溶液以磷酸盐缓冲液为溶剂。 

所述的四种荧光标记抗体具体为GD2-FITC抗体、CD90-PE抗体、CD45-PerCP抗体和CD56-APC抗体。其中，CD90-PE可购自美国BD公司，货号：555596、CD45-PerCP可购自美国BD公司，货号：347464、CD56-APC可购自美国BD公司，货号：341025、GD2-FITC制备方法可参照CANCER RESEARCH，1986年46期2988页，Highly selective recognition of human neuroblastoma cells by mouse monoclonal antibody to a cytoplasmic antigen。 

所述四种荧光标记抗体的浓度比为1：1：1：1。 

所述的溶血剂的组成为：8.3%氯化铵和15%多聚甲醛。 

所述探针溶液包含防腐剂，所述防腐剂为叠氮钠。 

所述磷酸盐缓冲液也含有含防腐剂，所述防腐剂为叠氮钠。 

所述叠氮钠的添加量为0.05～0.1%，优选为0.1%。 

试剂盒中所使用的磷酸盐缓冲液的浓度均为0.8～1M，优选为1M，该磷酸盐缓冲液的pH=7.4。 

需要指出的是，由于儿童无慢性淋巴细胞白血病，慢性粒细胞白血病极少，如无特殊说明，本申请中所提及的白血病均指的是急性白血病。 

与现有技术相比，本发明的有益效果为： 

本发明的荧光探针能够与骨髓中的肿瘤细胞特异性结合，无交叉反应，能够准确快速通过流式细胞术检测横纹肌肉瘤与神经母细胞瘤是否骨髓转移，具有很高的特异性（可达100%）和灵敏度，同时可区别急性白血病原始细胞，简单快速准确，具有较好的临床应用前景。 

附图说明

图1为本发明对实施例1患者骨髓标本的瑞氏染色结果图；其中，A为横纹肌肉瘤骨髓转移，B为神经母细胞瘤骨髓转移。 

图2为本发明对实施例1横纹肌肉瘤患者骨髓标本的流式细胞术检测结果图；其中，A：CD45-和CD56+细胞设R1门，B：GD2-和CD90+细胞设R2门；C：FSC和SSC细胞设R3门；R2来源于R1，R3来源于R2。 

图3为本发明对实施例1神经母细胞瘤患者骨髓标本的流式细胞术检测结果图；其中，A：CD45-和CD56+细胞设R1门，B：GD2+和CD90+细胞设R2门；C：FSC和SSC细胞设R3门；R2来源于R1，R3来源于R2。 

图4为实施例1急性白血病原始细胞的瑞氏染色结果图。 

图5为本发明对实施例1急性白血病患者骨髓标本的流式细胞术检测结果图；其中，A：CD45+和CD90+细胞设R1门，B：来源于R1的细胞显示GD2-和CD45+；C：来源于R1的细胞显示GD56-和CD45+。 

图6a为本发明对实施例1横纹肌肉瘤患者骨髓标本（稀释比例为1:100）的流式细胞术敏感性检测结果图。 

图6b为本发明对实施例1横纹肌肉瘤患者骨髓标本（稀释比例为1:1000）的流式细胞术敏感性检测结果图。 

图6c为本发明对实施例1横纹肌肉瘤患者骨髓标本（稀释比例为1:10000）的流式细胞术敏感性检测结果图。 

图7为本发明对实施例2横纹肌肉瘤患者脑脊液标本的瑞氏染色结果 图。 

图8为本发明对实施例2横纹肌肉瘤患者脑脊液标本的流式细胞术检测结果图，其中，A：CD45-和CD56+细胞设R1门，B：GD2-和CD90+细胞设R2门；C：FSC和SSC细胞设R3门；R2来源于R1，R3来源于R2。 

具体实施方式

下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。 

实施例1 

GD2-FITC（自备，以神经母细胞瘤细胞株LAN-1免疫BALB/c小鼠，取小鼠B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞株NS1融合成杂交瘤细胞制备单克隆抗体GD2并标记FITC荧光素，具体技术步骤参考杂志CANCER RESEARCH，1986年46期2988页；Highly selective recognition of human neuroblastoma cells by mouse monoclonal antibody to a cytoplasmic antigen）、CD90-PE（美国BD公司，货号：555596）、CD45-PerCP（美国BD公司，货号：347464）、CD56-APC（美国BD公司，货号：341025）。 

一、试剂盒组成： 

1)探针溶液（2mL×1瓶）： 

GD2-FITC：2mL PBS（含0.1%叠氮钠）含异硫氰酸荧光素标记的100μg抗体蛋白（50μg/mL）； 

CD90-PE：2mL PBS（含0.1%叠氮钠）含藻红蛋白标记的100μg抗体蛋白（50μg/mL）； 

CD45-PerCP：2mL PBS（含0.1%叠氮钠）含草履虫叶绿素蛋白标记的100μg抗体蛋白（50μg/mL）； 

CD56-APC：2mL PBS（含0.1%叠氮钠）含异藻蓝蛋白标记的100μg抗体蛋白（50μg/mL）； 

组合物抗体浓度比例GD2-FITC：CD90-PE：CD45-PerCP：CD56-APC为1:1:1:1。 

2)10×溶血剂（100mL×1瓶）：8.3%氯化铵，含15%多聚甲醛； 

3)10×磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4，1M，含1%叠氮钠）（100mL×1瓶）； 

4)阳性标准品（2mL×1瓶）：固定和保存液处理的细胞株（5×10⁷个细胞/mL）。 

二、试剂盒的应用 

研究对象：15例非白血病及肿瘤儿童、21例横纹肌肉瘤、25例神经母细胞瘤及22例急性粒细胞白血病患者的骨髓标本，骨髓标本均来自浙江大学医学院附属儿童医院门诊及住院患者。 

操作步骤：100μL骨髓液，分别加入单克隆荧光标记抗体（GD2-FITC、CD90-PE，CD45-PerCP和CD56-APC）各20μL，4℃避光反应30分钟，加入溶血剂1mL，静置5分钟，加PBS5mL，500G离心沉淀5分钟，弃上清，沉淀物加PBS300μL，混匀，上流式细胞仪检测50000个细胞。 

流式图像分析策略： 

横纹肌肉瘤：1、CD45-和CD56+设R1门；2、GD2-和CD90+细胞设R2门；3、FSC和SSC细胞设R3门分析；4、计算R3门内的阳性细胞数。（R2来源于R1；R3来源于R2）。 

神经母细胞瘤：1、CD45-和CD56+设R1门；2、GD2+和CD90+细胞设R2门；3、FSC和SSC细胞设R3门分析；4、计算R3门内的阳性细胞数。（R2来源于R1；R3来源于R2）。 

急性白血病原始细胞：1、CD45+和CD90+设R1门；2、分析CD45+和GD2-细胞；3、分析CD45+和CD56-细胞。 

同时设立阴性对照。 

阳性结果以免疫表型判断细胞类型如下： 

表型呈GD2^-CD90⁺CD56⁺CD45^-为横纹肌肉瘤细胞； 

表型呈GD2⁺CD90⁺CD56⁺CD45^-为神经母细胞瘤细胞； 

表型呈GD2^-CD90⁺CD56^-CD45⁺为急性白血病原始细胞。 

检测敏感性测定：分别将横纹肌肉瘤细胞用正常骨髓细胞稀释成1:100，1:1000，1:10000的比例，同样用以上方法检测。 

统计方法：利用软件SPSS11.5(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)，分析评价诊断方法的敏感性和特异性。 

各类型标本的检测结果如图1、图2、图3、图4、图5、图6a、图6b、图6c所示。 

结果表明：15例非白血病及肿瘤儿童均未检测到以上三类免疫表型细 胞；21例横纹肌肉瘤细胞患者中5例检测到GD2^-CD90⁺CD56⁺CD45^-免疫表型细胞，临床最终确诊该5例为横纹肌肉瘤骨髓转移；25例神经母细胞瘤患者中11例检测到GD2⁺CD90⁺CD56⁺CD45^-免疫表型细胞，临床最终确诊该11例为神经母细胞瘤骨髓转移；22例急性白血病细胞均为GD2^-CD90⁺CD56^-CD45⁺细胞免疫表型；流式细胞术对骨髓中三类肿瘤细胞诊断的特异性均为100%，敏感性为1/10^-4(即在10000个正常细胞中可检测到1个肿瘤细胞)。 

实施例2 

一、试剂盒组成： 

1)探针溶液（2mL×1瓶）： 

GD2-FITC：2mL PBS（含0.1%叠氮钠）含异硫氰酸荧光素标记的100μg抗体蛋白（50μg/mL）； 

CD90-PE：2mL PBS（含0.1%叠氮钠）含藻红蛋白标记的100μg抗体蛋白（50μg/mL）； 

CD45-PerCP：2mL PBS（含0.1%叠氮钠）含草履虫叶绿素蛋白标记的100μg抗体蛋白（50μg/mL）； 

CD56-APC：2mL PBS（含0.1%叠氮钠）含异藻蓝蛋白标记的100μg抗体蛋白（50μg/mL）； 

组合物抗体浓度比例GD2-FITC：CD90-PE：CD45-PerCP：CD56-APC为1:1:1:1。 

2)10×溶血剂（100mL×1瓶）：8.3%氯化铵，含15%多聚甲醛； 

3)10×磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4，1M，含1%叠氮钠）（100mL×1瓶）； 

4)阳性标准品（2mL×1瓶）：固定和保存液处理的细胞株（5×10⁷个细胞/mL）。 

二、试剂盒的应用 

研究对象：2例疑是横纹肌肉瘤脑脊液转移患者穿刺脑脊液标本。 

操作步骤、分析策略和统计方法同实施例1。 

结果表明：2例横纹肌肉瘤临床怀疑为脑脊液转移患者进行穿刺脑脊液经本抗体组合流式细胞仪检测，发现GD2^-CD90⁺CD56⁺CD45^-免疫表型 细胞（图7、图8），最终临床诊断该两例为横纹肌肉瘤脑脊液转移，并进行鞘内化疗及颅脊柱的放射治疗。表明本发明的荧光探针能够监测横纹肌肉瘤脑脊液转移，指导临床合理用药。