永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子在制备组织缺血损伤修复生物制剂中的应用

摘要

本发明提供了永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子在制备修复组织皮肤全层缺损生物制剂和制备治疗缺血缺氧性组织损伤生物制剂中的应用，所述的复合细胞因子为低氧培养永生化人肺微血管内皮细胞所分泌的细胞因子，所述的复合细胞因子不含有遗传物质（DNA或RNA）。用低氧培养的永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子局部应用，促进局部血管的形成，具有明显的效果。并且对于皮肤组织缺损等损伤疾病具有明显的组织再生作用。复合细胞因子具有多种促进血管生成的有效成分，能够促进血管再生，并对损伤组织进行修复，促进损伤组织的生长愈合，调节免疫反应等等。

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子的生物制剂，用于治疗皮肤全层损伤的治疗制剂，以及组织缺氧损伤修复的生物制剂。

背景技术

永生化人肺微血管内皮细胞是一种来自于人体肺组织微血管内皮的细胞，具有永生化特性、并且可以分泌大量与血管生长相关的细胞因子。该细胞同时转入了含有端粒酶催化组分和类人猿病毒40大T抗原的质粒。这种细胞可以在体外培养超过24个月，具有非常强的生存能力。另外，这种细胞在裸鼠移植试验中不会产生致瘤性。（Generation of Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cell Lines）

人肺微血管内皮细胞来源于血管内皮组织，表达有内皮细胞表面标志物，如血小板内皮细胞粘附分子（PECAM-1，CD31）、血管性血友病因子（vWF）、细胞内粘附分子（ICAM-1）、血管粘附因子（VCAM-1）、E选择素等等。另外，其细胞外基质具有非常强的形成血管能力。正是具有这种特点，这种细胞分泌物可以用于外伤、缺血性疾病等等的临床应用。

体外应用物理的方法对人肺微血管内皮细胞进行干预可以进一步增强该细胞所分泌细胞因子的血管形成能力。通过低氧1%的方法培养细胞24-48小时可以使细胞大量表达Gremlin-1和分泌血管内皮生长因子（VEGF）。Gremlin-1的高表达与缺血缺氧器官组织的血管生成以及抑制凋亡作用有着密切的关系。（Generation of Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cell Lines）

局部缺血性疾病包括心肌缺血、梗塞性脑中风、股骨头缺血性坏死、缺血性肠坏死、难治性皮肤溃疡、糖尿病足等等。

目前尚未有将永生化人肺微血管内皮细胞应用于组织缺血损伤的报道。

发明内容

    本发明的目的是弥补现有技术的空白，提供一种永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子在制备修复组织皮肤全层缺损生物制剂和制备治疗缺血缺氧性组织损伤生物制剂中的应用，所述的复合细胞因子为低氧培养永生化人肺微血管内皮细胞所分泌的细胞因子，所述的复合细胞因子不含有遗传物质（DNA或RNA），所述的永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子通过以下步骤制备而得：1）将永生化人肺微血管内皮细胞在体外进行扩增培养；2）永生化人肺微血管内皮细胞用无血清的条件培养基进行培养，并且将培养基进行收集；3）将条件培养基进行离心纯化，截留分子量3.5kDa的物质；4）将离心后培养基（含>3.5kDa分子）进行透析浓缩，得到浓缩液；5）将浓缩液进行冻干处理，得到人脐带间充质干细胞复合细胞因子冻干粉。

优选地，

所述的低氧培养的氧气浓度为1%、5%或10%。

所述的永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子通过以下方法制备而成：

1）永生化人肺微血管内皮细胞的扩增培养：永生化人肺微血管内皮细胞为

贴壁培养细胞，待细胞生长至80-90%融合时进行传代培养；

2）永生化人肺微血管内皮细胞条件培养基的收集：在低氧下培养细胞至第

三代，融合率达到80-90%进行细胞因子的收集，应用无血清内皮细胞培养基进行细胞培养后，将无血清培养基进行收集，检测培养基中是否含有遗传物质，如有则应用电泳方法去除；

3）永生化人肺微血管内皮细胞条件培养基的离心纯化

将所收集的条件培养基进行过滤离心，所用离心滤膜为截留分子量为3.5kDa

的分子滤膜,

    4）浓缩

    将离心后的条件培养基（含>3.5kDa分子）通过超滤的方式进行进一步的浓缩，通过Slide-A-Lyzer透析膜浓缩2-20倍，得到浓缩液，

    5）冻干

将浓缩液放置于容器中进行最终冻干，得到冻干粉。

含有永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子的修复材料，所述的修复材料包括永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子和透明质酸或生理盐水，每10ml修复材料中含有0.1ng-100mg人脐带间充质干细胞复合细胞因子。

所述的修复材料的制备方法包括以下步骤：将复合细胞因子浓缩液或冻干粉按照一定比例加入透明质酸或生理盐水中，配置成每10ml修复材料中含有0.1ng-100mg复合细胞因子的修复材料。

所述的修复材料为胶状修复材料、面膜修复材料或膏状修复材料。

含有永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子的皮肤护理产品。

本发明具有如下技术效果：

1）用低氧培养的永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子局部应用，促进局部血管的形成，具有明显的效果。并且对于皮肤组织缺损等损伤疾病具有明显的组织再生作用。复合细胞因子具有多种促进血管生成的有效成分，能够促进血管再生，并对损伤组织进行修复，促进损伤组织的生长愈合，调节免疫反应等等。

2）透明质酸材料为一种酸性粘多糖，溶解后比例为0.1-10%，理想浓度为1%，是人体的一种成分，富含水分，具有特殊的保水作用，并且在人体内可以自然分解吸收，对皮肤创面以及其他理化损伤创面保持湿润环境。

3）所述缺氧损伤为一种因缺血缺氧造成的组织坏死，本复合细胞因子可以，但不限于皮肤难治性溃疡创面治疗，其还可用于心肌缺血、梗塞性脑中风、股骨头缺血性坏死、缺血性肠坏死、难治性皮肤溃疡、糖尿病足的治疗。

附图说明

图1为永生化人肺微血管内皮细胞的形态图

图2为缺氧培养与正常培养24小时对VEGF分泌量的影响对照

图3为永生化人肺微血管内皮细胞 Gremlin-1在不同氧浓度条件下的表达变化对照

图4为永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子在皮肤全层缺损模型中的治疗结果图

图5A为永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子在中风模型中的治疗作用，大鼠脑部切片。

图5B为永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子在中风模型中的治疗作用，大鼠脑部切片红色荧光图片。

图5C为5A和5B的重叠图片。

具体实施方式

实施例1 制备含有永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子

永生化人肺微血管内皮细胞分离于人正常肺部组织的血管内皮组织，并共转染含端粒酶催化成分（hTERT）及SV40LTag的质粒制备成为永生化人肺微血管内皮细胞系（HPMEC，PromoCell,Germany）。将细胞复苏后接种于内皮细胞生长培养基(Lonza,Swiss)中培养，细胞密度达到80-90%时传代，待细胞养至第3代时开始收集细胞因子。图1为第三代永生化人肺微血管内皮细胞收集细胞因子时形态，细胞密度达到100%。

永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子的制备方法如下：

1）永生化人肺微血管内皮细胞的扩增培养

永生化人肺微血管内皮细胞为贴壁培养细胞，待细胞生长至80-90%融合时进行传代培养；

2）永生化人肺微血管内皮细胞条件培养基的收集

在低氧（1%氧浓度）下培养细胞至第三代，融合率达到80-90%进行细胞因子的收集，应用无血清内皮细胞培养基进行细胞培养后，将无血清培养基进行收集，检测培养基中是否含有遗传物质，如有则应用电泳方法去除；

3）永生化人肺微血管内皮细胞条件培养基的离心过滤，浓缩及冻干

将所收集的条件培养基进行过滤离心，所用离心滤膜为截留分子量为3.5kDa的分子滤膜,将离心后的条件培养基通过超滤的方式进行进一步的浓缩，通过Slide-A-Lyzer透析膜浓缩2-20倍，得到浓缩液，将最终的浓缩液放置于容器中进行最终冻干，制备成冻干粉。

实施例2  检测常氧及低氧环境对人肺微血管内皮细胞细胞因子表达的影响

在培养过程中，将细胞分为三份。一份按照正常氧浓度进行细胞培养；一份应用厌氧培养罐（三菱，日本）进行细胞培养24小时；一份应用厌氧培养罐（三菱，日本）进行细胞培养48小时。厌氧培养罐中氧气浓度为1%。

上述三份细胞分别收集细胞因子后进行双抗体夹心法酶联免疫吸附测定（ELISA）检测样本中血管内皮生长因子（VEGF）的浓度，并采用亲和素-生物素-辣根过氧化物酶系统进行显色，最后通过酶标仪检测不同样本间VEGF含量。多次重复测量后低氧48小时VEGF浓度明显高于24小时及常氧培养，低氧24小时也明显高于常氧培养（图2）。ELISA详细步骤见《精编分子生物学实验指南》。

Gremlin1是骨形态形成蛋白拮抗剂家族成员之一，具有促进血管形成的作用。上述三份细胞分别收集细胞因子后测量Gremlin1的表达。采用免疫印迹（Western-blot）法进行检测，将蛋白样品加入凝胶泳道后进行电泳分离。随后将含有蛋白样品的凝胶进行转膜，并加入抗人Germlin1抗体（LifeSpan Bioscience）进行结合后显色。如图3所示，Germlin1在缺氧48小时培养状态下分泌数量最多，缺氧培养24小时分泌量要多余常氧状态下培养（图3）

结论：缺氧培养条件会影响人肺微血管内皮细胞所分泌的细胞因子，主要影响为增加了促血管形成细胞因子的分泌，如VEGF、Gremlin1等。

实施例3  检测永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子在皮肤全层缺损模型中的治疗作用

应用Sprague Dawley大鼠制备皮肤全程缺损模型，即（图4）中a1，应用制备好的永生化人肺微血管内皮细胞细胞因子和透明质酸混合后敷于创口表面，并用敷贴防止胶状液流失。对照组仅用透明质酸敷于创面。术后14天照相观察，从图4可以看出，实验组明显优于对照组。

结论：对照研究显示永生化人肺微血管内皮细胞细胞因子具有促进伤口愈合恢复的作用。

实施例4  检测永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子对缺氧性中风模型的治疗作用

应用Sprague Dawley大鼠制备中风（MCAO）模型，大鼠麻醉后将钝头尼龙线延颈内动脉深入18mm，1小时后撤出尼龙线。模型制备成功后，大鼠脑缺血对侧前肢蜷缩，行走偏向对侧。术后8小时，将100mg细胞因子稀释至10ml生理盐水中，进行大鼠尾静脉注射。48小时后，尾静脉注射Brdu（5-溴脱氧尿嘧啶核苷），并取大鼠脑组织做抗Brdu免疫组织荧光染色。如图5A、5B、5C所示，注射细胞因子后，大鼠脑内Brdu阳性细胞数量众多，说明细胞因子的注射可以促进脑内细胞的增殖分裂，图5C为5A和5B的重叠图片，红色荧光显示增殖细胞位置。

结论：细胞因子可以促进脑内受损细胞的增殖。

实施例5  制备含有永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子的细胞因子注射液

将细胞因子混合入生理盐水等液体中，浓度为100mg/10ml，通过介入、静脉输注等方法将细胞因子液注射到损伤区域。可以抑制半损伤细胞的凋亡和新生细胞的增殖。

 

实施例6  制备含有永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子的细胞因子皮肤损伤修复液

将细胞因子混入透明质酸中，浓度为100μg/10ml，将胶状液直接敷于清洁创面，可以促进表皮的细胞的生长，缩短恢复时间。随着皮肤损伤逐渐的修复，可以降低细胞因子浓度，在创面未完全愈合前最低可用0.1ng/10ml混合细胞因子的透明质酸液进行创面的修复。

实施例7  将永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子与皮肤护理产品联合使用

可以将永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子加入皮肤日常应用的润肤霜、面膜中。可以促进面部损伤细胞的修复，如紫外线细胞损伤，也可以起到增加皮肤活性的作用。具体成分如下：

润肤霜：  三乙醇胺          0.2%

甘油             3.5%

丙二醇           2.5%

永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子  0.002% 

防腐剂、香精     适量

加纯水至100%。

其中每50ml润肤霜含有细胞因子约1ng。

剥离型面膜：  聚乙烯比咯烷酮           1.5%

聚醋酸乙烯酯             4.0%

橄榄油                   2.0%

羊毛脂                   1.5%

山梨醇                   5.0%

十二烷基硫酸酯钠盐       0.2%

吐温-20                  0.8%

永生化人肺微血管内皮细胞复合细胞因子          0.002%

香精、防腐剂 适量

加纯化水至100%.

其中每20ml含细胞因子约0.1ng。