纳米颗粒、制备方法以及其在药物引导的癌症治疗和食物相关化合物的领域中作为用于疏水分子和两亲分子的载体的应用

摘要

本发明涉及包括甾醇以及由石碱木衍生得来的选自于皂树酸和皂树皂苷的组分的纳米颗粒，该纳米颗粒不包括磷脂。本发明还涉及包括所述纳米颗粒的组合物，以及其用作佐药的应用，尤其是在疫苗中、作为两亲分子或疏水分子的载体以及作为用于癌症的治疗的药剂的应用。此外，本发明还涉及一种用于生产不含磷脂的纳米颗粒的方法、一种用于癌症的治疗的方法和一种用于评估癌症治疗方法的适用性的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及包括甾醇和由选自于皂树酸和皂树皂苷的石碱木（Quillaja  saponaria Molina）衍生来的组分的纳米颗粒，其中，纳米颗粒不包括磷脂作为必 要组分。本发明还涉及包括纳米颗粒的组合物，以及其作为佐药的应用，尤其是 在疫苗中，以及在尤其是癌症的治疗以及食物相关的化合物的医学领域作为两亲 分子或疏水分子的载体作为癌症的治疗剂的应用。进一步地，本发明涉及一种生 产不含磷脂的纳米颗粒的方法，一种用于癌症的治疗的方法和一种用于评估癌症 治疗方法的可行性和制备在水中可溶以促进其被身体吸收的食物相关的化合物 的方法。

背景技术

免疫刺激复合物（Immune Stimulating Complex，ISCOM）是由源自于石碱木 树的皂苷组成的40nm颗粒，所述皂苷与胆固醇紧密结合以形成直径为6nm的 六角环。第三组分为脂质，例如磷脂酰胆碱，其与环粘连以形成40nm的球状体。 该颗粒和结合入颗粒的特定疫苗抗原一起使用，或者作为不含有抗原的佐药颗粒 来使用，所述佐药颗粒与在另一个颗粒中的疫苗抗原共同施用。所述ISCOM颗 粒可通过&Morein、EP0436620以及WO2004/004762中描述的方法来 生产。

ISCOM和ISCOM Matrix（免疫刺激复合物基质）的一个问题是它们的生产 工艺复杂。这还引发了将其作为载体/运送系统（例如将分子/化合物结合以成为 运送物或者实现对于药物效果和疫苗效果的优良的效果）或者作为靶向装置来使 用的问题。

疫苗主要基于能促进免疫反应的整个微生物或者亚基，包括抗体和对表面结 构的T细胞反应两者。或者，免疫抗原为亚基，即最常用的为表面蛋白质，但也 可为在细胞载体中表达的内部蛋白/细胞内蛋白或者甚至非结构蛋白。表面蛋白和 碳水化合物抗原常常以其激发抗体反应的能力来评价，不排除它们还可以诱导包 括T细胞反应在内的细胞调节反应，然而，大部分并不是细胞毒性的T细胞反应。 使用内部蛋白和非结构蛋白作为疫苗抗原来引发T细胞反应，包括细胞毒性的T 细胞，因为抗体并不与感染剂的内部蛋白相互作用，并且因此可以不在感染的时 间点来调节免疫保护。相反，包括T辅助细胞和细胞毒性T细胞的细胞调节免疫 可以杀死感染的细胞，也就是在感染的时间点之后。ISCOM工艺的制剂和产品被 用于增强易接近的抗原的免疫原性，所述易接近的抗原即表面抗原和通过药剂的 干扰（内部抗原）显露的抗原，通过它可以制备抗它的疫苗，cf Morein等人2007³年和WO2011/005183。任何疫苗也可以通过rDNA技术来制备，在许多情况下， 还可以如&Morein²所述来合成制备。所述ISCOM工艺在许多专利申请 中描述，包括美国专利US2006/0121065、EP1539231A1、WO2004/004762和 WO2005/002620。

一般而言，佐药被用于增强包括在疫苗制剂中的抗原的免疫反应的程度和质 量。然而，有许多感染原，其关于保护性疫苗的未满足的需求很大，（新）免疫 保护通过下列途径被逃避：

·逃避变异株（人类流感病毒、鸡的冠状病毒（传染性支气管炎病毒，infectious  bronchitis virus，IBR）、丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus，HCV））

·不显露抗原决定簇

·难以接近的-隐藏的（金黄色葡萄球菌[SA]、马链球菌）

·在微生物中通过其他抗原决定簇的免疫优势，例如人体中的流感病毒、 貂中导致阿留申病（alution disease）的细小病毒、人体中的丙型肝炎病毒（HCV）。

·恶化疾病的诱导免疫反应（细小病毒[阿留申病]貂）

·打算用于具有许多至几乎无数个变异体的病原体的种类的疫苗，所述 变异体使其困难/过于昂贵，或者使其生产足够覆盖的疫苗（例如在人体中HIV 和丙型肝炎）更加经济。已知存在许多疫苗，其需要来自相同数目的变异体株几 种甚至多达23种的疫苗组分，所述变异体例如为具有多种荚膜抗原的碳水化合 物变异体（联合疫苗，例如流感嗜血杆菌、Meningococus miningitides、肺炎链球 菌、酿脓链球菌、pneumococcus pneumonie，还有金黄色葡萄球菌）。

·在多种革兰氏阳性球菌、例如葡萄球菌在动物中盛行的其他未满足的 需求，尤其是一种需求要求在反刍动物中抗乳腺炎的保护性疫苗，其由在马中（Str. Equi,Str.Zooepidermicus)、在牛中（Str.agalacti，Str.dysgalacti和Str.Uberis）的抗 链球菌金黄色葡萄球菌来引起。

·抗原痕迹（FLU）或者载体诱导的表位抑制（carrier induced epitope  suppression，CIES）抗原。

·快速复制因子，例如人类免疫缺陷病毒（HIV）会通过新的即将来临 的变异体（包括由疫苗诱导的变异体）来恶化逃避宿主的免疫保护机制。

·许多情况下缺乏佐药的DNA和RNA疫苗。

因此，存在通过避免逃避突变的负面影响或者补偿由经突变逃避而损失的免 疫，或者增强对由感染期间的突变导致的即将到来的变异体的免疫保护来提高疫 苗满足即将到来的情况（例如导致流行病、甚至大流行病）的能力或者改善保持 疫苗保护价值的可能性这一未满足的需求。因此原因，新型颗粒状疫苗佐药也可 灵活地需要针对特定病原体的保护所需的免疫学档案的免疫反应来调整方向。

用多种方式治疗癌症，包括手术、放射以及药物，即细胞抑制剂。通过细胞 抑制剂的医疗通常导致严重的副作用，例如放射疗法常常导致严重的副作用。因 此，存在具有能被患者良好地忍受的医疗的未被满足的需求。国际专利公布 WO2008/063129以及Hu等人¹描述了包括胆固醇、磷脂酰胆碱和皂树皂苷部分 ASAP（酰基皂苷，与QS21或QHC相对应）或DSAP（去酰基皂苷，与QS7 或QHA相对应）的纳米颗粒。名为KGI和BBE的这些颗粒被描述为以比它们杀 死相似来源的正常细胞的浓度低30至40倍的浓度来杀死癌细胞，如在专利申请 PCT/SE2007/050878和WO2008/063129和Hu等人¹在发明“Killcan，New Use” 中所描述的。这些颗粒具有与对于ISCOM和ISCOM Matrix所描述的生产复杂性 的相似的生产复杂性。

许多潜在药物不能被研发，因为其不能实现在水中的溶解性，包括其在疫苗/ 佐药和包括抗癌药物在内的药物输送领域的应用。如果这些潜在的药物能从架子 上取下来并使它们可溶于水，其中一些就可以丰富医药市场。

发明内容

发明人发现了一种对于用作抗癌药物、药物的载体/运送颗粒以及用作佐药 的新型的纳米颗粒的需求，所述佐药可以弥补市售佐药-疫苗制剂的不足。

关于ISCOM的一个问题是配制基于皂树组分、胆固醇和第三组分（例如磷 脂酰胆碱）的清洁剂增溶的颗粒的复杂工艺，例如使用超滤、切向流、透析或离 心技术。所用这些技术都如&Morein²所述，导致材料在生产过程中的损 失。

另外，ISCOM工艺不能容易地适合于其他疏水或两亲性分子的整合，因为迄 今研发出的方法使得这些化合物在水中具有很强的自动形成稳定的复合物（自组 装）的趋势，例如如通过疏水相互作用不整合入ISCOM制剂中的胶束。

本发明涉及不含磷脂的纳米颗粒，其包括甾醇和至少一种皂苷。

与本发明相反，用于包括佐药制剂以增强疫苗的效力的药物以及疫苗制剂和 用于治疗癌症的制剂中的制备和应用的包括脂质的颗粒包括像磷脂这样的脂类， 例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、十八烷基胺等，所述包括脂质的颗粒例如脂质 体、ISCOM、ISCOM MATRIX、posintros以及多种脂质体。

根据本发明的纳米颗粒还可用作一个或多个化合物的传输系统，例如包括用 于癌症的治疗的药物和营养相关的化合物，其中额外的物质提供额外的功能和补 充方式的作用。

根据本发明的纳米颗粒的优点使它们能成为现有技术制剂的替代物，包括作 为佐药的更广的应用以覆盖病原体的新的突变体，例如如上所述的即将到来的流 行病。

因为挥发技术，本发明提供了实际上没有损失的简单的生产工艺。这并不排 除使用所述技术来生产ISCOM或ISCOM Matrix（见上文）。

本发明的方面描述在独立权利要求中。优选的实施方式在从属权利要求中阐 明。

附图说明

图1A.电镜（EM）显示了包括摩尔比为1:1:0.5的胆固醇、QHC和双萜类的 纳米颗粒。根据本发明的颗粒的平均直径为约17-20nm。它与如图1B所示的约 为40nm的ISCOM颗粒显著不同。根据本发明的不含双萜类的颗粒具有相同的 形态。

图1B.电镜显示了包括摩尔比为1:1:0.5的胆固醇、QHC和磷脂酰胆碱的类 ISCOM颗粒。如所述地使用与实施例1所述相类似的技术来制备本颗粒，相应的 实施例1中的设计C直径约为40nm，即使用。形态和大小与根据如图1A所示 的本发明的纳米颗粒的形态和大小显著不同。

图2.在U937细胞上测试的，都包含QHC的G3和KGI纳米颗粒之间的癌 细胞杀死能力的比较。对于模式肿瘤细胞，G3和KGI实际上有相同的抗癌细胞 杀死作用（P=0.8422）。

图3.G3和KGI诱导U937肿瘤细胞来产生IL-8的比较，其显示了两种颗粒 都具有相似的诱导肿瘤细胞来产生指示肿瘤细胞分化的细胞因子的能力 （P>0.05）。

图4A.与BBE或KGI相比，甜叶菊（Stevia）是IL-12B、IL-6和IL-1α的最 强的诱导剂。

图4B.当结合入G3时，DT上调正常人类DC的细胞因子IL-12基因表达。

图5.G3颗粒以与KGI颗粒类似的强度来影响U937细胞的细胞内TK产生 （从左到右，在每个制剂-浓度组合中的长条表示24、48、72、96和120小时的 时间点）。

图6.在HL-60AML细胞上读取的G3、结合了DT的G3（G3-DT）和非颗 粒状的QHC的滴定曲线。所述G3和G3-DT制剂比游离的、非颗粒状的QHC更 有效地杀死AML细胞。

图7.G3和阿糖孢苷对HL-60AML细胞的单独的和联合的效果。G3显著增 强了阿糖孢苷

图8.G3增强了道诺霉素对HL-60AML癌细胞的杀死能力。

图9.对于PC-3前列腺癌细胞，G3、结合了DT的G3（G3-DT）和QHC的 滴定曲线。

图10.对于PC-3前列腺癌细胞，G3和多西他赛（docetaxel）的单独的和联 合的效果。G3显著增强了多西他赛的癌细胞杀死效果。

图11.G3增强了卡巴他赛（cabazitaxel）对PC-3前列腺癌细胞的杀死效果。

图12.ACHN肾脏癌细胞的滴定曲线显示了用QHA配制的G3比用QHA配 制的G3在杀死实体癌细胞方面更加有效（P<0.01）。

图13A.免疫程度

实验设计（C56B16小鼠，6只小鼠/组，200μl/剂，皮下地（s.c.）施予两次 免疫，相隔四周）

第一组（Abisco对照组）：流感1μg+ISCOM-5μg

第二组（G3-高剂量组）：流感1μg+G3-5μg

第三组（G3-中剂量组）：流感1μg+G3-2.5μg

第四组（G3-低剂量组）：流感1μg+G3-1μg

第五组（G3加DT）：流感1μg+G3-2.5μg

第六组（非佐药的，抗原对照组）：流感1μg

第七组（不免疫组）

评估

取血液来检测抗体反应。解剖取脾脏细胞用于IL-4、IFN-γ的包括细胞免疫的 增殖测试。

图13B.在第一次免疫三周之后测量的小鼠血清的HI抗体反应。

图13C.在第二次免疫四周之后测量的小鼠血清的HI抗体反应。

图13D.在第二次免疫四周之后测量的小鼠脾脏细胞的细胞因子反应。

图14A.G3/VLX40制剂（右侧柱）具有高的癌细胞（U937）杀死效果。相 比于单独的VLX40（左侧柱）具有较低的癌细胞杀死效果，表明了G3/VLX40 制剂具有高的溶解性，而VLX40-DMSO制剂具有低的癌细胞杀死效果。

图14B.VLX40DMSO制剂（左侧柱）在沉淀物中具有很高的抗癌活性。相 反，具有很少沉淀的G3-VLX40（右侧柱）制剂具有低的抗癌细胞活性，表明了 抗癌细胞活性本质上定位于水相。

定义

本说明书中所用的术语和用词除非另有说明，否则应解释为它们在相关领域 中通常具有的含义。为了清楚，几个术语在下面定义。

疫苗制剂是用于针对/对抗一种或多种特定疾病的预防及改善/增强保护性免 疫的药物制剂。当对与疾病相关的组分具有特异性的抗原包括在本发明的制剂 中，或者如特别对于癌症治疗，抗原存在于癌症/肿瘤中时，根据本发明的治疗疫 苗可用于治疗疾病。疫苗包括在被治疗的主体中引发免疫反应的“抗原”，以及 任选地加入到疫苗中以改善免疫反应的叫做“佐药”的物质。

因此，“抗原”是疫苗中的活性特异性部分，可以是导致疫苗所针对的以提 高免疫的疾病的整个微生物，例如病毒或细菌。它还可以是所述微生物亚基的部 分，例如蛋白质（亚基）、蛋白质的一部分、从病原微生物提取出的或者通过rDNA 技术生成的或合成生成的、然后通常称作肽的蛋白质。肽比蛋白质具有更少的氨 基酸。

“佐药”是提高针对预防或治疗疫苗的抗原部分的免疫反应的水平和质量的 疫苗成分。营养相关化合物是与养分相关的任何化合物，包括维生素、健康活性 物质、味道改良化合物。

具体实施方式

本发明涉及纳米颗粒，所述纳米颗粒包括甾醇和源自选自于皂酸和皂树皂苷 的石碱木的组分，其特征在于，所述纳米颗粒不包括磷脂。

根据本发明得到的颗粒与ISCOM在大小上不同，其中根据本发明的颗粒小 于40nm，约在20nm左右，但ISCOM为约40nm。因此，本发明的纳米颗粒可 具有在10-40纳米之间的直径，优选在12-35纳米之间或在15-25纳米之间。所 述大小将在一定程度上取决于除了胆固醇和皂树分子之外的所整合的其他分子 的载入。

甾醇可选自于胆固醇、胆甾烷醇、乙酸甾烷醇（caprostanol）、植物甾醇、 例如豆甾醇、谷甾醇、酵母甾醇、例如麦角甾醇，优选胆固醇和维生素D3或任 何暴漏在水中以和在水中可溶的（包括以胶束形式悬浮于水中的悬浮液）反应性 基团共价地反应的疏水化合物。

也可以使用皂树皂苷或者其任何具有普通三萜系化合物骨架的部分（又称为 皂树酸（Quillaja acid））。到目前为止已被描述的皂树酸有四种形式。如Hu等 人¹所述，皂树皂苷和许多糖一起形成带有酰基（即酰基皂苷，ASAP）或者不带 酰基（即去酰基皂苷，DSAP）的链。

所述皂苷可为亲水的，并且选自于Quil A的第4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14和15部分，尤其是在EP03632279B2中描述的第7、8、9、10、11、 12、13和14部分，以及Quil A或粗制Quil A的A部分。

所述皂苷可为粗制的或天然的，或者为Quil A的未分离的提取物，其包括皂 苷的混合物或者其半纯化形式，例如Quillaja Powder Extract（美国Berghausen公 司）、Quillaja Ultra Powder QP UF300、Quillaja Ultra Powder QP UF1000或者 Vax-Sap（这三个都购自智利Natural Responses公司，或者购自智利圣地亚哥的 Prodalysa公司）。纯化的皂苷C部分和B部分可单独地或者联合在一起使用。B 部分和C部分描述于WO96/11711中，B3、B4和B4b部分描述于EP0436620 中。QA1-22部分描述于EP03632279B2，Q-VAC（丹麦Nor-Feed公司）、Quillaja  Saponaria Molina Spikoside（瑞典乌普萨拉市Uppsala Science Park，75183的 Isconova AB公司）。

所述皂苷可为疏水性皂苷，并且选自例如在来自于石碱木的皂苷的三萜糖苷 配基的4-位上包括脂肪酸的皂苷，例如Quil A的C部分和B部分或者来自于在 A部分和B部分之间的区域的部分以及在EP03632279B2中描述的第15、16、 17、18、19、10和21部分（尤其是第17和18部分适合于此处）。可优选地使 用皂树皂苷部分QHA、QHB和/或QHC。

胆固醇和皂树皂苷之间的比例可为从1:10至10:1，优选从1:2至2:1。

根据本发明的纳米颗粒可进一步包括至少一种两亲性或疏水分子，其可选自 于抗原、佐药、靶标分子、药物化合物和食物相关化合物。

所述抗原可以是如欧洲专利公约（EPC）专利申请0109942中描述的具有两 亲基团或疏水基团或者通过rDNA表达而变得具有疏水区域并通过细胞或化学合 成来生产的的任何抗原。佐药可为具有两亲基团或疏水基团的任何佐药，例如从 石碱木获取的那些基团。

一个或多个化合物分子可结合入G3以具有补充的功能，例如在EP9600647-3 （PCT/SE97/00289）中描述的在使用用于免疫调节功能的疫苗时作为靶标工具或 作为抗原或补充抗原，或者作为包括抗癌或营养效果的药物。为了结合入G3颗 粒，所述分子需要具有疏水域，或者与G3颗粒通过静电作用连接。如在EP 1800564中对一个相似的颗粒所描述的，不具有疏水部分的化合物可以在结合入 G3分子之前或结合入G3分子之后连到具有这样的分子的分子上去。

例如天然的或合成的包括合成的或半合成的皂树皂苷或来自于石碱木的皂 苷部分或其衍生物、脂质A或其衍生物或合成种类、细胞壁骨架的任何佐药可以 结合，但不仅限于所提到的佐药化合物。由智利圣地亚哥Prodalysa的Javier Saints 公司提供的双萜类化合物（Diterpenoid，DT）可用作佐药和营养物（来自于甜叶 菊的一种甜味剂）。双萜类化合物（DT）被加入根据本发明的纳米颗粒，得到了 17nm的典型的小纳米颗粒。

可使用与细胞结合组分（cell-binding component）结合的包含脂质的受体， 所述受体包括霍乱毒素的受体和海藻糖血型抗原，所述霍乱毒素的受体为神经节 苷脂GM1。所述细胞结合组分还可作为粘液靶标分子来起作用。用于所包括的复 合物的技术在例如WO97/30728中描述，并且可应用于用于抗癌治疗和疫苗用途 两者的G3颗粒。石碱木的任何亚片段可以单独地或者以多种组合方式来使用。 具有疏水尾部/区域的受体是用于将分子捕获至本发明所发明的颗粒以提供所需 的补充特征，例如不同方式的癌细胞杀死，例如，以癌细胞为目标同时还具有细 胞杀死效果的单克隆抗体就是一种载体-传递的选择。

因此，可结合于所述纳米颗粒的其他组分为包括抗癌药的药物，所述抗癌药 包括用于抗体或者单克隆抗体（例如Fc受体或者金黄色葡萄球菌的蛋白质A的 DD（WO2001/005183））的受体。

通过本发明公开的纳米颗粒的制备方法比ISCOM的制备方法更简单，并且 更适合于结合疏水分子和两亲分子。因此，本发明所发明的纳米颗粒是适用于疫 苗抗原、用于抗癌治疗的药物以及任何种类的药物的传递的纳米颗粒。如在此所 述地生产的颗粒还可用所加入的两亲分子（脂质，例如十八胺等）补充以用于与 其他分子（例如药物或疫苗抗原）共价地连接或者用于静电地连接，例如Morein 等³以及在WO2004/004762中描述的外源凝集素（lectin）连接。

所述颗粒可进一步包括癌症靶标分子，例如来自于癌细胞的表面抗原、病毒 表面抗原和流感抗原。

来自于微生物膜的表面分子可通过疏水相互作用来结合，如Morein等人³和 在EP242380中最开始描述的。例如通过rDNA技术来生产的或者合成生产的其 他分子可如WO2002/080981和WO2004/030696中所述地来结合进去。

这些靶标分子包括包膜蛋白，所述包膜蛋白来自于病毒，例如流感病毒和呼 吸道合胞体病毒（respiratory syncytial virus），其与呼吸道亲和，例如与肺癌的靶 向形式或者如Lycke等人⁴所述、是结合入KGI或者BBE制剂的霍乱毒素的A 亚基的A1部分的CTA1DD亲和。CTA1DD由三种主要组分合理地设计而来，每 一种组分都贡献了补充的效果。CTA1是霍乱毒素的酶活性亚基，其通过与A2 亚基和B亚基分开而变成非毒性的。它与来自金黄色葡萄球菌的A蛋白的DD相 连而靶向B细胞。更加广泛地说，如EP0109942B1、EP0242380B1和EP0180564 B1所述，单克隆抗体和多克隆抗体可结合入所述颗粒。

本发明还涉及包括一种或多种纳米颗粒的组合物。所述组合物可包括各自结 合入不同的纳米颗粒的不同的皂树皂苷部分。

因此，两种不同的皂苷部分可为结合在一个G3颗粒中的复合物，并且至少 两种不同的皂苷部分中的另一种（或其他种）为在另一种（或其他种）物理上不 同的含脂质的颗粒中结合的复合物。

不同的皂苷可分别为亲水的或疏水皂苷。所述颗粒可至少包括C部分，或者 至少包括B部分，或者至少包括Quil A的C部分和B部分之间的任何部分以及 Quil A的至少一种其他部分。因此，一个颗粒可仅包括C部分；C部分和Quil A 的至少一种其他部分；C部分和Quil A的一种或多种部分；Quil A的C部分和 A部分；粗制Quil A。所述颗粒还可仅包括B部分；B部分和Quil A的至少一种 其他的部分；B部分和Quil A的一种或多种部分；Quil A的B部分和A部分。 部分的上述组合还可在不同的脂质颗粒或相同的脂质颗粒中。

因此，可使用包括含有在物理上不同的颗粒中的亲水和疏水皂苷的颗粒的脂 质的混合物。

根据一个实施方式，Quil A的A部分可与至少一种具有免疫调节活性的其他 佐药一起结合入纳米颗粒中。

根据另一个实施方式，至少一种其他佐药以游离形式或者结合入另一种分开 的纳米颗粒来呈现，以制备佐药组合物。

至少一种其他佐药可为例如Quil A皂苷的皂苷。

A部分可促进另一种佐药的使用，并且可获得包括免疫反应和免疫调节活性 的提高的协同效果，所述佐药当其单独使用的时候，在有效的剂量下可能是毒性 的。

根据本发明的组合物可包括来自Quil A的佐药A部分以及任何重量比例的 至少一种其他的佐药。优选地，基于佐药的总量计，Quil A的A部分是2-99.9重 量%，优选5-90重量%，尤其是50-90重量%。对于例如Al(OH)₃、油类佐药和嵌 段共聚物来说，Quil A的A部分的量可以大大降低。

基于A部分和非A的Quil A部分的总量计，一个优选的ISCOM组合物包括 50-99.9%的Quil A的A部分以及0.1-50%的C部分和/或B部分和/或Quil A的其 他部分或衍生物（在上下文中称为非A的QuilA部分）。尤其是，基于A部分 和非A的Quil A部分的总量计，所述组合物包括70-99.9%的Quil A的A部分和 0.1-30%的非A的Quil A部分，优选75-99.9%的Quil A的A部分和0.1-25%的非 A的Quil A部分，尤其是80-99.9%的Quil A的A部分和0.1-20%的非A的Quil A 部分。基于A部分和非A的Quil A部分的总量计，最优选的组合物包括91-99.1% 的Quil A的A部分和0.1-9%的非A的Quil A部分，尤其是基于A部分和非A 的Quil A部分的总量计，98.0-99.9%的A部分和0.1-2.0%的非A的Quil A部分。

所述纳米颗粒和包括纳米颗粒的组合物可用作任选地在进一步包括药学上 可接受的缓冲液、稀释赋形剂、添加剂、佐药和/或载体的药组合物中的药物。

合适的药学上可接受的载体和/或稀释剂包括任何以及所有的常规的溶剂、分 散介质、填料、固态载体、水溶液、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗延缓剂和吸 收延缓剂等。这些介质和剂用于药学活性物质的应用在本领域中是公知的，并且 其在第18版美国宾夕法尼亚州Mack Publishing Company出版的Remington’s  Pharmaceutical Sciences中以实例的方式被描述。除了在任何常规的介质或剂与活 性成分不相容的情况，它们在本发明的药组合物中的应用是可预期的。补充的活 性成分也可加入到组合物中。

本发明还包括进一步包括至少一种药学活性组合物的药组合物，例如抗癌 药、铂配位化合物、紫杉烷化合物、喜树碱化合物、抗肿瘤长春花生物碱、抗肿 瘤核苷衍生物、氮芥或者亚硝基脲烷化剂、抗肿瘤蒽环霉素衍生物、赫赛汀 （trastzumab）和抗肿瘤足叶草毒素衍生物、石碱木以及其亚片段；抗体的受体或 者单克隆抗体，例如Fc受体或者金黄色葡萄球菌的A蛋白的DD；癌症治疗剂， 例如选自于由阿糖孢苷（Cytarabin）、道诺霉素、紫杉醇、多西他赛（Docetaxel）、 卡巴他赛（Cabazitaxel）、Toricsel和他比特定（Trabectidin）组成的组的药剂， 其活性化合物可整合入纳米颗粒，或者与组合物混合。

进一步的抗癌剂优选地选自于即铂配位化合物、紫杉烷化合物、喜树碱化合 物、抗肿瘤长春花生物碱、抗肿瘤核苷衍生物、氮芥或者亚硝基脲烷化剂、抗肿 瘤蒽环霉素衍生物、赫赛汀（trastzumab）和抗肿瘤足叶草毒素衍生物。

术语“铂配位化合物”在此用来表示任何肿瘤细胞生长抑制的铂配位化合物， 其以离子形式提供铂。优选的铂配位化合物包括顺铂、卡铂、氯代-(二乙烯基三 胺)-氯化铂(II)；二氯代(乙烯基二胺)-铂(II)；二胺(1,1-环丁烷二羧酸)-铂(II)（卡铂）； 螺铂；异丙铂；二胺(2-乙基丙二酸)-铂(II)；(1,2-二氨基环己基)丙二酸铂(II)；（4- 羧基酞）(1,2-二氨基环己基)铂(II)；(1,2-二氨基环己基)-(异柠檬酸)铂(II)；(1,2- 二氨基环己烷)-顺-(丙酮酸)铂(II)；以及(1,2-二氨基环己基)-草酸-铂(II)；奥马铂和 四铂。

顺铂可从如BristolMyers Squibb公司的Platinol的商品名下以用于与水、无 菌盐水和其他适宜的载剂组合的粉末来从市场上购得。其他的铂配位化合物及其 药组合物可从市场上购得和/或可通过常规技术手段来制备。

紫衫烷化合物可为BristolMyers Squibb公司以商品名Taxol来销售的紫衫烷 化合物，多西他赛可从Rhone-Poulenc Rorer公司以商品名Taxotere购得。这两种 化合物和其他紫杉烷化合物可以常规方式来制备，例如以在EP253738、EP253739 和WO92/09589中描述的方式或者其类似的方法来制备。卡巴他赛从Sanofi  Pasteur公司购得。喜树碱化合物包括伊立替康（Irinotecan）与拓扑替康 （topotecan）。伊立替康可从例如Rhone-Poulenc Rorer公司以商品名Campto来 购得，并且可例如如欧洲专利说明书137145中所述的方法或者通过其类似的方 法来制备。拓扑替康可从例如SmithKline Beecham以商品名Hycamtin来购得， 并且可通过例如如欧洲专利说明书321122中所述的方法或者通过其类似的方法 来制备。其他喜树碱化合物可以通过常规方式制备，例如通过与上述对于伊立替 康和拓扑替康所描述的类似的方法来制备。

抗肿瘤长春花生物碱包括上面涉及的长春花碱、长春新碱和长春瑞滨。长春 花碱可例如作为用于注射的硫酸盐从EliLilly and Co公司以商品名Velban购得， 并且可以通过例如如德国专利说明书2124023中所述的方法或者其类似的方法来 制备。长春新碱可例如作为用于注射的硫酸盐从Eli Lilly and Co公司以商品名 Oncovin购得，并且可以通过例如如上述德国专利说明书2124023中所述的方法 或者其类似的方法来制备。长春瑞滨可例如作为用于注射的酒石酸盐从Glaxo  Wellcome公司以商品名Navelbine购得，并且可以通过例如如美国专利说明书 4307100中所述的方法或者其类似的方法来制备。其他抗肿瘤长春花生物碱可通 过常规方式制备，例如通过与上述对于长春花碱、长春新碱和长春瑞滨所描述的 方式类似的方法来制备。

抗肿瘤核苷衍生物包括上面涉及的5-氟尿嘧啶、吉西他滨（gemcitabine）和 卡培他滨（capecitabine）。5-氟尿嘧啶可广泛地从市场上购得，并且可以通过例 如如美国专利2802005中所述的方法来制备。吉西他滨可通过从例如Eli Lilly公 司以商品名Gemzar购得，并且可以通过例如如欧洲专利说明书122707中所述的 方法或者通过其类似的方法来制备。

卡培他滨可从例如Hoffman-La Roche公司以商品名Xeloda购得，并且可以 通过例如如欧洲专利说明书698611中所述的方法或者其类似的方法来制备。其 他抗肿瘤核苷衍生物可通过常规方式制备，例如通过与上述对于卡培他滨和吉西 他滨所描述的方式类似的方法来制备。

氮芥化合物包括环磷酰胺和苯丁酸氮芥（chlorambucil）。环磷酰胺可从例如 Bristol-Myers Squibb公司以商品名Cytoxan购得，并且可以通过例如如英国专利 说明书1235022中所述的方法或者其类似的方法来制备。苯丁酸氮芥可从例如 Glaxo Welcome公司以商品名Leukeran购得，并且可以通过例如如美国专利说明 书3046301中所述的方法或者其类似的方法来制备。与本发明相一致地使用的优 选的亚硝基脲化合物包括上述涉及的卡莫司汀（carmustine）和洛莫司汀 （lomustine）。卡莫司汀可从例如Bristol-Myers Squibb公司以商品名BiCNU购 得，并且可以通过例如如欧洲专利说明书902015中所述的方法或者其类似的方 法来制备。洛莫司汀可从例如Bristol-Myers Squibb公司以商品名CeeNU购得， 并且可以通过例如如美国专利说明书4377687中所述的方法或者其类似的方法来 制备。

抗肿瘤蒽环霉素衍生物包括上面涉及的道诺霉素、阿霉素（doxorubicin）和 伊达比星（idarubicin）。道诺霉素可例如作为盐酸盐从Bedford Laboratories以商 品名Cerubidine购得，并且可以通过例如如美国专利说明书4020270中所述的方 法或者其类似的方法来制备。

阿霉素可例如作为盐酸盐从Astra公司购得，并且可以通过例如如美国专利 说明书3803124中所述的方法或者其类似的方法来制备。伊达比星可例如作为盐 酸盐从Pharmacia&Upjohn公司以商品名Idamycin购得，并且可以通过例如如美 国专利说明书4046878中所述的方法或者其类似的方法来制备。其他的抗肿瘤蒽 环霉素衍生物可通过常规方式制备，例如通过与上述对于道诺霉素、阿霉素和伊 达比星所描述的方式类似的方法来制备。

赫赛汀可从Genentech公司以商品名Herceptin购得，并且可以通过如美国专 利说明书5821337或PCT专利说明书WO94/04679和WO92/22653所述来获得。

抗肿瘤的抗肿瘤足叶草毒素衍生物包括依托泊苷（etoposide）和替尼泊苷 （teniposide）。依托泊苷可从例如Bristol-Myers Squibb公司以商品名VePesid购 得，并且可以通过例如如欧洲专利说明书111058中所述的方法或者其类似的方 法来制备。替尼泊苷可从例如Bristol-Myers Squibb公司以商品名Vumon购得， 并且可以通过例如如PCT专利说明书WO93/02094中所述的方法或者其类似的 方法来制备。其他抗肿瘤足叶草毒素衍生物可通过常规方式制备，例如通过与上 述对于依托泊苷和替尼泊苷所描述的方式类似的方法来制备。

诸如如上所述的粗制形式或其部分的皂苷还可以游离形式使用，即不合并入 含脂质颗粒中，例如抗癌剂。这些抗癌剂化合物可与含脂质颗粒混合、连上含脂 质颗粒或合并入含脂质颗粒，所述含脂质颗粒例如为脂质体、ISCOM和/或ISCOM  Matrix和posintros。如果当被合并时其为疏水的，则是合适的。否则可将疏水基 团连在它们上面，如EP242380所述。

非疏水化合物，尤其是蛋白质或肽类可通过在其上连加疏水基团来变为疏水 的。

可与所述非疏水化合物连加的疏水基团为直链、支链、饱和或不饱和的脂肪 链（优选具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碳原子），或者疏 水氨基酸或肽或其他疏水结构，例如类固醇。疏水结构的长度与蛋白质的大小和 性质相适应。举例来说，具有10-15个氨基酸的肽（口蹄疫病毒）可合适地在氨 基末端或者羧基末端具有两个酪氨酸。分子量为70000道尔顿的蛋白质要求约20 个疏水氨基酸。凭经验来进行检测。因此，使用尤其是具有1至20个氨基酸、 优选1、2、3、4、5个氨基酸的肽，所述氨基酸尤其选自于Trp、Ile、Phe、Pro、 Tyr、Leu、Val之中，尤其是Tyr；胆固醇衍生物，例如胆碱酸、熊去氧胆碱酸 （ursodesoxycholine acid）。

这些疏水基团必须与可连上疏水蛋白质或疏水化合物的基团连接，所述可连 上疏水蛋白质或疏水化合物的基团例如为羧基、氨基、二硫基、羟基、巯基和羰 基，例如醛基。

可以连结的疏水基团优选地选自于羧基、醛基、氨基、羟基和甲烷、乙烷、 丙烷、丁烷、己烷、庚烷、辛烷的二硫化物衍生物，以及包括Cys、Asp、Glu、 Lys的肽，优选辛醛和Tyr.Tyr.Tyr-Cys、-Asp或-Glu。具有能连结的基团的疏水 基团必须根据将溶解的物质，在例如上述提到的增溶剂和清洁剂或者盐酸、醋酸 （67%体积的醋酸）、碱液、氨的帮助下溶解于水。然后在不导致物质沉淀的情 况下，将pH调节到中性范围；此处应保证得到的pH值不会使疏水基团将连结的 蛋白质变性。脂质可增强溶解性。

疏水分子可以10:1至0.1:1、优选1:1的比例添加到非疏水化合物上。

带有作为连结分子（coupling molecule）的羧基的疏水基团可通过水溶性碳二 酰亚胺或者复合酐连结到蛋白质上。在第一种情况下，羧基通过碳二酰亚胺在pH 5下被激活，并与溶解于pH8、具有高的磷酸盐含量的缓冲液中的蛋白质混合。 在后一种情况下，羧基化合物与氯代甲酸异丁酯在二氧己环或乙腈中的三乙胺的 存在下反应，将得到的酸酐在pH8至pH9的情况下加到蛋白质上。也可能用肼 将羧基转化成酰肼，其与蛋白质中的高碘酸盐氧化的糖单元中的醛和酮一起提供 腙键。

通过亚硝酸，氨基可在低温下转化为重氮盐，其与Tyr、His和Lys提供偶氮 键。通过琥珀酸酐，羟基可转化成可以羧基连结的半琥珠酸酯衍生物。醛基可与 蛋白质中的氨基反应成希夫碱。已描述了几种连结基团和方法^6,7,8。

然后将这样产生的具有接收到的疏水基团的蛋白质、肽或化合物与糖苷复合 成键，如在a）中所述，但是此处用于去除细胞碎片的纯化步骤可以省略。

将疏水基团包进去了的亲水蛋白质可通过经过温和地将蛋白质变性（即，通 过约为2.5的低pH、3M尿素或者在70摄氏度以上的高温下变性）而使疏水基团 露出来而变成疏水的。该蛋白质可为免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、IgD和 IgE。所述免疫球蛋白可用作抗独特型抗体（antidiotypic antibody）。所述蛋白质 作为如（b）中所述的蛋白质来纯化得到，然后如（a）中所述复合连结到糖苷上， 用于去除细胞碎片的纯化步骤可以省略。

疏水或两亲分子还可选自磷脂，例如磷酸甘油的衍生物，例如磷脂酸的衍生 物，即卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂、具有14、15、16、17、18、19和20个碳原 子的鞘氨醇衍生物、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱。

可选自抗原、佐药、靶标分子、药化合物和营养物的上述所有两亲分子和疏 水分子可合并入纳米颗粒，或者在组合物中与之混合。

所述药组合物可用作佐药，例如，用于与开发中的疫苗一起使用、用于与季 节性流感病毒疫苗一起使用、用于与大流行性流感疫苗一起使用或用于与紧急疫 苗、例如对抗生物武器的疫苗一起使用。因此，本发明还涉及包括如上所述的 G3颗粒的药学疫苗配方。

本发明还涉及一种用于治疗或预防由生物体导致或者加重的疾病的方法，其 包括给需要其的主体施用根据本发明的药学疫苗配方。

进一步地，本发明涉及一种用于癌症的治疗的方法，其包括给需要其的病人 施用药学有效剂量的根据本发明的纳米颗粒或者组合物。根据一个实施方式，所 述癌症是白血病。

药学组合物可为可无菌注射的水悬浮液或者油悬浮液的形式。该悬浮液可根 据现有技术使用上面提到的合适的分散剂或者湿润剂以及悬浮剂来配制。无菌可 注射的制剂还可为非毒性的肠道外可接受的稀释液或溶剂中的无菌可注射的溶 液或悬浮液，例如作为1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的载体和溶剂有水、 林格氏溶液（Ringer’s solution）和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油通常被 用作溶剂或悬浮介质。为了此目的，可使用任何温和的固定油，包括合成的单甘 油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸，例如油酸，可用于血管注射剂的制备。

所述溶液或悬浮液还可包括至少一种下列佐药：无菌稀释液，例如用于注射 的水、盐水、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如 苄醇或苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或者亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙 二胺四乙酸；缓冲液，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于渗透压调节的 试剂，例如氯化钠或者右旋糖。所述肠道外制剂可装入安瓿瓶、一次性注射器或 由玻璃或塑料制成的多剂量容器中。

所述通式化合物可肠道外施用。在此所用的术语肠道外包括输液技术的皮下 注射、静脉注射、肌内注射、皮内注射、电穿孔（electroporation，EP）；无针注 射-喷流注射、基因枪、biljector，以及口服、喷雾施用。对于口服使用，例如如 Eliasson等人⁹所述来使用蛋白A衍生的化合物CTA1DD，其具有靶向对于用于 粘膜免疫（尤其在肠道中，但也可潜在地对于癌症尤其是B细胞淋巴瘤）的诱导 的细胞处理十分有用的B细胞的性质。

一般来说，将本发明的包含脂质的颗粒以药学有效量施用。实际施用的颗粒 的量将典型地由医师考虑相关环境因素来决定，所述相关环境因素包括要治疗的 病情、所选的施用方式、实际施用的化合物、年龄、体重、个体病人的反应、病 人症状的严重程度等。

根据本发明的纳米颗粒可在抗任何微生物的任何疫苗中用作佐药。可将其用 于任何动物，例如鸟类、哺乳动物（例如人）、家畜（例如猫、狗、绵羊、山羊、 猪、牛和马）。根据一个实施方式，本发明在抗动物中的链球菌和马中的流感的 疫苗中用作佐药。

人使用的剂量可根据所包括的其他化合物而变化。考虑到治疗的持续时间， 所述剂量的范围可为每天<50μg至1mg或更多。

本发明还涉及用于评估根据本发明的方法用于对个体病人的癌症的治疗的 适用性的方法，其包括

·将来自所述病人的癌细胞与根据权利要求1至7中任意一项所述的纳米颗 粒或者根据权利要求8或9所述的药组合物体外接触；

·测量所述纳米颗粒或药组合物对所述癌细胞的治疗效果的至少一种效果指 标；

其中，如果纳米颗粒或者药组合物对所述癌细胞显示治疗效果的显著的效果 指标，则将根据权利要求10或11所述的方法评估为可适用于所述个体病人。

治疗效果的指标可通过在细胞周期调节中十分重要的基因的下调（随着周期 素依赖性蛋白激酶（cycline dependent kinase，CDK）、细胞周期蛋白（cyclin） 或者其他分子促进在细胞周期和复制中通过检查点（check point）（CDK2、CDK6 和细胞周期蛋白D1））或者胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的下调和促进细胞分化的 分子的上调（随着IL-8、FOXC1和HDAC5也表示离开细胞周期）来读取。所述 调节因子为例子，存在更多调节因子，即所述例子为非限制性的。

本发明还涉及一种用来生产不含磷脂的纳米颗粒的方法，其包括以下步骤：

a）提供疏水表面或脂质体的悬浮物；

b）将疏水表面或脂质体的悬浮物与甾醇溶液接触，优选为作为单体溶解于 有机溶剂或者清洁剂中的胆固醇；

c）去除溶剂或清洁剂，在表面形成甾醇膜；

d）提供皂树皂苷胶束的水溶液；

e)将包括皂苷胶束的水溶液加入到甾醇膜，通过它们在皂苷和甾醇之间形成 复合物，并悬浮于水溶液中。

疏水表面可为在罐、盆、几层表面、珠子（例如乳胶珠）、网或三维网或多 孔材料中的表面。还可为具有整合入脂膜中的组分的脂质体。

如所述（例如在Review Liposomes Preparation Methods Mohammad Riaz  Faculty of Pharmacy，University of the Punjab，Lahore，Pakistan Pakistan Journal of  Pharmaceutical Sciences Vol.19(1)，January1996，pp.65-77中），脂质体可根据多 种技术和用不同组分来构建。脂质体还可作为病毒颗粒来构建，所述病毒颗粒包 括整合在脂质体膜中的病毒蛋白。所述脂质体还可在水溶液中。设备可例如组装 在柱子中。

皂苷和甾醇可为上面对于纳米颗粒提到的皂苷和甾醇。

溶剂可为可在下面网站找到的任何溶剂 http://en.wikipedia.org/wiki/Organic_solvents或清洁剂，优选为氯仿、乙醇或乙腈。 所述溶剂的性质在http://en.wikipedia.org/wiki/Organic_solvents中描述。溶剂的选 择取决于将要溶解的分子的性质。不同种类的溶剂主要根据极性和非极性来分 类。非极性溶剂例如己烷、氯仿和二乙基醚。提到的这些十分有用，因为它们的 沸点在35和65之间而可以挥发，有利于通过挥发来分离。极性非质子溶剂常用 于药物分子的溶解，例如二甲亚砜、乙腈。关注后者因为其沸点低。极性质子溶 剂也有用，尤其在与其他溶剂联合时。乙醇、甲醇的沸点低，乙酸的沸点高。低 沸点对于挥发技术尤为重要。可用两种或多种溶剂实现溶剂。提到的溶剂是例子， 而存在更多具有也许对于用在本发明中以形成G3制剂更想要的性质的溶剂。

可用溶剂的例子有非离子、离子（即阳离子或阴离子或两性离子）清洁剂， 例如基于五倍子酸的两性洗涤剂或清洁剂，其过量使用。合适的非离子清洁剂的 典型例子有N-酰基-N-烷基-葡糖胺、聚乙二醇酯和含有脂肪族或芳香脂肪族酸和 醇的聚乙二醇醚。其例子为具有通式C_nH_2n+1(OCH₂CH₂)xOH，简写为CnEx的烷 基聚氧乙烯醚；在烷基和聚氧乙烯链之间包括苯环的烷基苯基聚氧乙烯醚，缩写 为Cn phi.Ex,Triton X-100=叔C₈E₉6（聚氧乙烯的辛基酚酯），酰基聚氧乙烯酯： 酰基聚氧乙烯山梨醇酯，缩写为Cn山梨醇Ex，例如吐温20（Tween-20）、吐温 80（Tween-80）、β-D-烷基糖苷，例如β-D-辛基糖苷。合适的离子型清洁剂的例 子有五倍子酸清洁剂，例如盐酸、脱氧胆酸盐、胆酸盐和溴化十六烷基三甲铵 （CTAB）。甚至可使用共轭的清洁剂，例如牛脱氧胆酸盐、甘氨脱氧胆酸盐和 甘氨胆酸盐。其他可能的增溶剂有溶血卵磷脂和合成的溶血磷脂。甚至可使用上 述清洁剂的混合物。当使用透析法时，清洁剂应该在不太长时间里能够透析。

一些表面活性物质大大促进基质（matrix）形成。其包括带有极性头基团和 非极性脂肪链的内在的生物膜脂质（例如磷脂酰胆碱（带负电）和磷脂酰乙醇胺 （带正点））。

根据一个实施方式，清洁剂可为Triton-X-100、吐温20、诺乃清洁剂、NP-40、 脱氧胆酸盐、MEGA-10和辛基糖苷。通过透析可去除MEGA-10和辛基糖苷。对 于其他的，可使用如所提的的其他技术，例如离心法和柱色谱法。

可溶的试剂可使用低沸点的有机溶剂通过挥发来除去，或者通过透析或者通 过如EPC专利0109942所述的透析、色谱、过滤或切向流来除去。

皂苷胶束的水溶液通过加入如从生产者获得的冻干或喷雾干燥的粉末来获 得。所述皂苷或者皂苷部分通常保藏在储备溶液中，例如10mg/ml水，但不限于 此浓度，并加入脂膜周围的水中到终浓度在CMC浓度以上，即临界胶束浓度， 例如30mg/升，具体的数字取决于皂树产品。皂苷作为Quillaja Powder Extract获 得，并可作为粗制的皂树提取物（美国Berghausen公司）、Quillaja Ultra Powder  QP UF300、Quillaja Ultra Powder QP UF1000或者Vax-Sap（一种未分离的皂树皂 苷产品）、QHA和QHC部分（所有三种购自智利Natural Responses公司）或购 自智利圣地亚哥的Prodalysa公司。

本发明使用新的生产方法，其中连接于疏水表面的甾醇的人造膜从步骤a-c） 制备。皂树皂苷产品的水溶性胶束和在皂树胶束和人造膜中的组分之间的化学 （共价）连接将人造膜组分提取到可溶于水的复合物中，作为创新的水溶性纳米 颗粒型复合物，即G3。本复合物通过化学（共价）连接来聚在一起，其使亲水 部分保持在水相中并连接在一起，并且组分之间的疏水相互作用保留在复合物的 中间。所述膜由带有可溶性试剂的有机溶剂形成，所述可溶性试剂可为清洁剂或 有机溶剂。

将要结合入人造膜中疏水分子和两性分子用有机溶剂或清洁剂与步骤b）中 的甾醇一起溶解，并通过有机溶剂的挥发转移到水相。根据有机溶剂，如果沸点 低于水的沸点则通过挥发来去除，或者通过透析或对ISCOM形成所描述的类似 的技术来去除。因此，溶剂的去除不是颗粒的形成的一部分，但是不是颗粒的形 成的一部分的人造膜的形成的一部分。在人造膜的形成完成之后，在人造膜周围 存在水。在该水相中，加入悬浮（溶解）于水的皂树胶束，取出水相中的人造膜， 并将皂树胶束改组到新的G3-制剂中。所述组合物可轻易调节为使人造膜完全溶 解成水中的颗粒状悬浮物。从涉及到共价连接的构建的角度来看，所述组合物与 胶束不同，因此，形成了一种创新的颗粒。

在步骤f）和g）中，皂树产品的水溶性胶束形式允许相互作用，以得到成为 水相的终产物。该步骤的第一相互作用是皂树胶束和人造膜中的甾醇之间的共价 连接，第二相互作用是在皂树三萜系化合物骨架和所述甾醇之间的相互作用。在 合适的比例下，人造膜中的所有组分被结合到水溶性皂树胶束中而形成新的纳米 颗粒，所述新的纳米颗粒的尺寸将从17nm直到40nm的范围内变化。如果脂质 （例如磷脂）存在于人造膜中，会得到更大的尺寸。实施例2、4、9、14、15和 16显示了根据本发明，多种亲脂分子已被结合，包括DT、白消安、细胞周期依 赖性蛋白激酶(CDK)抑制剂（roscovitine）、vivolux40和维生素D3。

ISCOM Matrix可用新方法通过向包括步骤b）中的甾醇的悬浮液中加入至少 一种磷脂来生产。

所述磷脂可选自磷酸甘油的衍生物，例如磷脂酸的衍生物，即卵磷脂、脑磷 脂、肌醇磷脂、带有14、15、16、17、18、19和20个碳原子的鞘氨醇衍生物、 磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱。

疏水组分可结合在步骤b）中，即还包括结合在脂质、甾醇的人造膜中。

在步骤b）中，将水溶性形式的皂苷（即胶束形式）加入覆盖人造膜的水相。

用所发明的纳米颗粒来取代ISCOM Matrix，因为所述纳米颗粒生产起来更加 简单、经济，这是由于根据本发明的纳米颗粒基于2种组分，即皂树皂苷、胆固 醇，相比之下，ISCOM颗粒形成包括3种组分，即皂树皂苷、胆固醇和第三组分 ——磷脂，例如磷脂酰胆碱。所述皂树组分不需要用清洁剂或有机溶剂来溶解。 根据本发明的新的生产技术是强有力的，并将克服敏感的平衡。因此，本新型方 法比ISCOM Matrix工艺对于整合第四、第五或更多组分（即，其他疏水分子或 两亲分子）来说更加适合，因为迄今研发的方法使得这些化合物在水中具有自动 形成稳定的复合物（例如胶束）的强的趋势（自组装），因此不整合到ISCOM Matrix 制剂中，例如通过疏水相互作用。因此，将ISCOM Matrix工艺研发成一般输送 体系是具有缺陷的，但本发明不具有这类缺陷。

这里所提到的所有文献通过引用全部结合在本文中。现在，本发明将通过下 列非限制性实施例来阐述。

实施例

材料和方法

化学品和化合物

胆固醇（C8667）、卵磷脂（PC，P-5763）和氯仿（288306）都购自Sigma-Aldrich  Sweden AB公司（瑞典斯德哥尔摩）。皂树皂苷的A部分（QHA）和C部分（QHC） 都购自ISCONOVAAB公司（瑞典乌普萨拉）。双萜类化合物（DT），即甜叶 菊从智利ProdalysaLtda获得。维生素D3从Miva Nutri-molecular Research有限 公司（中国上海）购得。

细胞系

人类巨噬细胞（Mφ）细胞系U937（其常在生物和癌症研究中用作模式细胞 系）和人类急性髓性白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）细胞系HL-60在 培养基RPMI-1640中生长。人类前列腺腺癌PC-3在50/50的HAM’sF-12K和 RPMI-1640的混合物中培养。所有细胞都由乌普萨拉大学的临床药理学系善意地 提供。所有培养基都添加10%的热失活的胎牛血清（fetal calf serum,FCS）、2mM 谷氨酸盐、100μg/ml链霉素和100IE/ml青霉素（都购自Sigma Aldrich公司（美 国密苏里州圣路易斯市）。所有细胞系都在37℃下在包括5%CO₂的加湿气体下 培养。

人类树状细胞（Dendritic cells，DCs）

不成熟的人类树状细胞购自3HBiomedical公司（瑞典乌普萨拉）。

体外实验步骤

在37℃下在包括5%CO2的加湿气氛下，将在96孔微滴定板中的、细胞密度 为5000-20000细胞/孔的细胞暴露在包括同样浓度的QHC的连续稀释的G3、KGI 和皂树皂苷产品中72小时。对于U937细胞，一组细胞直接用于微培养细胞毒荧 光分析（fluorometric microculture cytotoxicity assay，FMCA）来测量所述制剂的 细胞杀死效果。对于其他组细胞，收集150μl/孔的上清液用于细胞因子IL-8测定。

癌细胞杀死效果的测量

FMCA方法基于测量通过具有完整细胞膜的细胞将荧光素双乙酸盐（FDA） 水解成荧光素所产生的荧光。在上述孵育3天之后，吸除培养基。用PBS洗涤一 次之后，加入溶解于生理缓冲液（10μg/ml）的100μl/孔的FDA。孵育板45分钟， 在96孔扫描荧光仪中测量从每个板产生的荧光。荧光与孔中完整的细胞的数量 成比例。对于成功的分析的质量标准包括在对照孔中的荧光信号超过五次为空白 平均值、在对照孔中平均变异系数（co-efficient of variation，CV）为少于30%。

对于受G3制剂刺激的U937细胞的细胞因子IL-8测定

根据生产商指南（人类IL-8ELISA，目录编号S8000C，研究与开发系统， 美国明尼苏达州Minneapolis，邮编55413）进行对于人类IL-8的检测的ELISA 实验。简而言之，将50μl重建的标准的人类IL-8和上清液加入到一式三份的孔 的每个孔中，并且通过轻拍板几次来充分混合。然后将板用粘贴板盖盖上，并在 室温（RT，20-25℃）下孵育一小时。孵育后，用洗涤缓冲液将板洗涤3次，并 且加入50μl/孔的生物素化的抗体试剂（抗人类IL-8）。将板用粘贴板盖重新盖 上，并在室温下孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤3此之后，使用100μl/孔的链亲 和素-HRP溶液。将板用粘贴板盖重新盖上，在室温下孵育30分钟。弃去板中的 内容物，将板用洗涤缓冲液洗涤3次。将100μl的TMB底物溶液用到每个孔中。 在室温中、在黑暗条件下使酶变色反应进行30分钟。通过加入100μl/孔的终止 液来停止反应。在ELISA读板仪上在450nm和550nm处读取吸光度。用450nm 的值减去550nm的值来校正微板中的光学误差。然后生成标准曲线，并用来计 算未知样品中的人类IL-8的含量。通过将从在垂直轴（Y轴）上的每个标准浓度 得到的平均吸光度对比水平轴（X轴）上的相应的浓度（pg/ml）画图来产生标准 曲线。

被G3制剂刺激的人类单核细胞的细胞因子IL-12基因表达

通过基因芯片，将用G3、DT、加上DT的G3处理的树状细胞的细胞因子IL-12 的基因表达与对照细胞进行比较。简而言之，将正常人类单核细胞暴露在10μg/ml 的G3、100μg/ml的DT和同样浓度下同样颗粒中的两者的结合之下6小时，然 后根据生产商手册（QIAGENRNEASY小试剂盒）来提取RNA。在“瑞典乌普 萨拉的乌普萨拉大学医院临床化学和药理学部门的乌普萨拉芯片平台”，通过经 逆转录将RNA样品转化成带标记的cDNA并将来自多种样品的定量数据与未处 理的细胞进行比较（AmbionWT表达试剂盒）来进行RNA表达分析。

胸苷激酶（Thymidinekinase，TK）活性

用购自Biovica公司（瑞典乌普萨拉）的试剂盒来测定TK活性。简而言之， 在不同时间点暴露于KGI或G3制剂之后，将浓度为0.1-1×10⁶细胞/ml的100μl 细胞悬浮液转移到微量离心管中，在200g离心10分钟。将细胞团块重悬于100 μl的冷PBS中，冰冻/解冻2-3次。以最大速度离心5分钟，然后收集细胞。根据 生产商的说明书来测量细胞间的TK活性。

维生素D3的测量

将维生素D3（维他命D3）结合到G3颗粒上的样品在大学医院实验室中在 Liaison自动仪上进行分析。尽管所述试验（DiaSorin Liaison）被设计用来测量 25-HO-D3，它与未羟化的维生素D3还是有约1%的交联反应性。

流感病毒株以及疫苗

人类流感病毒A/California/07/2009（H1N1）、APerth/16/2009（H3N2）和 B/Brisbane/60/2008（B）作为非佐药疫苗在疫苗的制备、血清学测试和淋巴细胞 的再刺激中用作抗原。将病毒在VERO细胞中培养，用脱氧胆酸盐分裂。它是由 生产商善意地提供的。收集后，将病毒纯化，失活，分裂并以30μg蛋白/ml的浓 度重悬。如图1所示，该剂量包括1μg病毒抗原和多种含量的佐药。

接种疫苗

对斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院（Karolinska Institute）的大学医院（University  Hospital）的动物房喂养的C56B16小鼠在颈部进行皮下接种疫苗两次。具体细节 请参见实施例12。

血细胞凝集（Haemagglutination，HA）测验

将在柠檬酸盐溶液中收集的鸡红细胞（RBCs）用0.01M磷酸盐缓冲盐水 （PBS）pH7.2洗涤三次，并在包括0.05%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中以0.5% 的浓度重悬。在4℃下在U型微板中进行1小时的HA测验。

血细胞凝集抑制（Haemagglutination inhibition，HI）测验

在室温（RT）下将血清样品和30%的鸡RBC悬浮液一起孵育1小时。吸收 后，将混合物以500×g的转速离心10分钟，并收集上清。最终的血清稀释为1:5。 使用V型微板、以16HA-单位/50μl来进行HI测验。血清样品25μl被用等量的 PBS-BSA两倍稀释。将稀释过的血清在室温下与25μl的病毒悬浮液一起孵育1 小时，然后将混合物在4℃下孵育1小时。认为100%抑制血细胞凝集的最高血清 稀释度是样品的抗体滴度。

淋巴细胞的制备

尽可能无菌地得到脾-淋巴细胞（脾细胞）。在再次接种疫苗之后3周时，使 接种疫苗的和未接种疫苗的小鼠通过颈部脱臼而出血并死亡。取出脾脏，随后仔 细处理，将其通过无菌的不锈钢网，并使用移液管来用含有两性离子缓冲剂的 EMEM将其冲洗。用含有两性离子缓冲剂的EMEM将细胞洗涤2次，以500×g 的转速离心。然后，将团块在添加有1%胎牛血清（FCS）、10μg/ml庆大霉素、 2mM的L-谷氨酸盐、3.81g羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）/L和5×10^-5Mβ-巯 基乙醇（培养基）的F-DMEM培养基中重悬。通过台盼蓝染料排斥实验来分析 细胞生存能力。

酶联免疫斑点试验（Enzyme-linked immunespot assay，ELISPOT）

使用市售针对INF-γ、IL-2或IL-4的ELISPOT试剂盒来进行分泌细胞因子的 脾细胞的计数。试剂盒购自瑞典斯德哥尔摩Mabtech公司。根据Mabtech公司推 荐的指南来使用ELISPOT板。

对于每种细胞因子，将浓度为2×10⁵每100μl培养基的脾细胞用移液管吸取 到8个不同的孔中。四个重复收到包括4.5μg流感病毒抗原的血细胞凝集素的50 μl培养基。测试的四个孔仅仅收到100μl培养基。将板在37℃下在加湿过的盒中 孵育18小时，随后去掉细胞并洗涤孔。根据Mabtech公司描述的步骤来发展孔 点。简而言之，将板在室温下与100μl生物素化的单克隆抗体（MoAb）抗IFN-γ、 IL-2或IL-4一起孵育2小时。然后，将板仔细清洗，然后在室温下与HRPO结 合的链霉亲和素一起孵育1小时。在另一轮洗涤之后，将板与底物一起在室温下 孵育约15分钟或者直到不同的孔点出现。用自来水洗涤板来停止反应。最后， 使板干燥，随后用ELISPOT计数器来对孔点的数目进行计数。

数据分析和统计

用计算的SI值和软件程序GraphPadPrism4（美国加利福尼亚州圣地亚哥的 GraphPad Software公司）来分析剂量-反应数据。以平均值±标准误差来表示数据。 通过单因子方差分析（one-way ANOVA）来进行几组平均值之间的统计学推断， 所述单因子方差分析用组平均值的Tukey多重比较后测试，并用来在 GraphPadPrism中通过Studentt-测试来比较2组平均值。

第一部分制剂和表征

实施例1

在本实施例中，描述了G3纳米颗粒的制剂。在实验设计的步骤2A和B中， （见下文）探索了皂树皂苷的胆固醇比QHC的比例的影响（来自于瑞典Uppsala 的ISCONOVA AB公司，见WO2008/063129）。在步骤C中，探索了加入磷脂 对于颗粒形成的效果。

实验设计

在步骤1中，形成了人工胆固醇膜，其要求在清洁剂或有机溶剂中有溶解性。 在该实验中，我们使用氯仿（288306，瑞典斯德哥尔摩的Sigma Aldrich Sweden AB 公司）作为胆固醇（C8667，瑞典斯德哥尔摩的Sigma Aldrich Sweden AB公司） 的溶剂，以产生100mg/ml的储备溶液。在微量离心管中，加入稀释于50μl氯仿 中的来自储备溶液的2μl胆固醇，随后在胆固醇溶液的上部加一层0.5ml的水。 通过用带针头的吸管来产生的气流来使氯仿挥发。在管壁上看到一层可见的胆固 醇层。

在步骤2中，

将0.5ml的水用1ml新鲜水替代，并将10μl的QHC储备溶液（水中100 mg/ml）加入水中，随后在37℃下过夜孵育。所述膜从管壁上消失，看见清楚的 水溶液。

·A.使用如步骤1所述处理的2μl的胆固醇储备溶液和步骤2中的10μl的 QHC来产生该G3制剂，所述胆固醇储备溶液和所述QHC的摩尔比为1：1

·B.使用另一摩尔比，即2摩尔的胆固醇比1摩尔的QHC。实验的其他部 分均与A中相同。

·C.使用1摩尔胆固醇比1摩尔卵磷脂（P-5763购自瑞典斯德哥尔摩的 Sigma Aldrich Sweden AB公司）的摩尔比来形成步骤1中的膜。在步骤2中，使 用2摩尔的QHC。

结果

A.挥发后，实现了通过电子显微镜（EM）和梯度离心表征的具有均一尺寸 的17nm颗粒，见图1A。G3悬浮液呈清液状。

B.挥发后，用电子显微镜观察到具有稍宽的尺寸范围的颗粒，直径中位数为 约17nm（未显示），即在2mol的胆固醇和1mol的皂树皂苷的范围内也产生了 17nm颗粒。

C.所述产物具有类似于ISCOM颗粒的形态，其直径约为40nm（图1B）。 因此，同时加入磷脂酰胆碱的形态与根据G3发明而没有磷脂酰胆碱的纳米颗粒 的形态完全不同。还可以推定，根据本发明的纳米颗粒对于包括磷脂酰胆碱（如 &Morein（1）所主张的，其对于ISCOM制剂是必需的）的磷脂的并入 来说是极佳的基底。

结论和讨论

以1胆固醇比1皂树的摩尔比，形成了小（17nm）纳米颗粒。胆固醇的比 例越高（即2胆固醇比1皂树或更高的摩尔比），则出现越大的颗粒。应注意， 通过在步骤1中其他亲脂组分的加入，颗粒的尺寸将有所变化，即颗粒的加载影 响尺寸。在此情况下，尺寸的范围被记录为在17和40nm之间，但不仅限于此 范围。尤其重要的是，电子显微镜下并没有看到颗粒的聚集，反而颗粒互相之间 很好地分散开。

将亲脂物质变得可溶于水的一个重要且新颖的概念是该两步步骤。有多种形 成脂膜（例如没有固体疏水支持物但在水相中呈游离悬浮态的脂质体）的方式。 第二步通过先进入水溶性G3颗粒来将膜萃取到水相中。

应注意，用来形成根据本发明的纳米颗粒的步骤很强大，又比现在使用的方 法（如用来制备ISCOM制剂的方法（&Morein，见上文））简单得多。 最重要的是，随着所用的挥发，几乎没有用于颗粒制备的物料（即皂树皂苷在所 提情况下QHC或胆固醇）的任何损失，并且不需要磷脂，进一步减少了生产成 本。有意思的是，根据本发明的纳米颗粒可用作形成ISCOM的基底。

如果将清洁剂用来增溶，则必须除去清洁剂，如&Morein²所述如通 过透析、柱色谱法、超速离心或者切向流来去除清洁剂，使用带有疏水表面的珠 子（如乳胶珠子）可能更加实际。因此，该两步步骤是制备纳米颗粒的创新且有 效的方法，所述纳米颗粒根据加载内容可在形态上有所变化。

此外，在第一步制备膜的此方法是将亲脂分子加入到第2步中的水溶性G3 颗粒上的一种通用方法。

实施例2

本实施例显示了具有两亲性的分子可加入根据如实施例1所述的技术的G3 颗粒上。应注意，G3天然就作为胶束可溶于水，在施用后由于在注射位点的稀 释而分解，随后在从所述位点输送之后。因此，它具有低的、差的生物利用度 （bioavailability）。因此，在G3中稳定的复合物十分重要。

实验设计

实验设计与实施例1实质上相同，除了疏水分子双萜类化合物（DT）也与如 实施例1所述的胆固醇同时溶解。使用与实施例1（即1μl DT（作为储备溶液的 在99%乙醇中的100μg/ml）以在实施例1中对步骤1描述的1胆固醇：0.5DT 的摩尔比例溶解）相同的两步步骤来将DT分子与Quil A的C部分（QHC）和胆 固醇一起加入到G3颗粒中。在步骤2中，将QHC以与实施例1中的胆固醇为1:1 的摩尔比加入。

结果

结合了DT的G3颗粒具有与图1A所示的不含DT的G3颗粒相同的形态。 在步骤1中，能在管壁上看到一层膜，其在步骤2中消失。来自步骤2的水溶液 是澄清的至稍稍乳白色的，并且没有发现沉淀物。

结论

在胶束形式中的两亲分子双萜类化合物（DT）成功地通过所用溶剂所分解， 并在步骤2中合并到根据本发明的纳米颗粒上，得到典型的17nm的G3纳米颗 粒。因此，显示了使用根据本发明的G3纳米颗粒作为两亲分子的载体/传送体系 的能力。具有所需的结构的两亲分子形成在施用给个体之后大多不稳定的胶束， 其常常导致低的生物利用度。在实施例4中显示了该G3-DT颗粒具有生物活性。 在巴黎公约优先权期间将进行进一步的研究以进一步证明免疫增强能力和根据 本发明的纳米颗粒作为传送颗粒，以及对于通过与细胞（例如，在细胞膜中通过 受体）的相互作用来增强生物效果的有用性。更多信息请参见Hu等人³的文献， 其通过引用合并到本文中。通过结合具有补充性质的其他分子，包括免疫增强效 果和癌细胞杀死效果将潜在地被实质上拓宽。

实施例3

在代表淋巴肿瘤细胞的U937模式细胞系中体外测试G3杀死癌细胞的能力。

实验设计

如在《材料和方法》（Materials and Methods）中所述，G3颗粒使用胆固醇和 QHC之间的多种重量或者摩尔比来制备。孵育多种制剂，并且如《材料和方法》 中所述，在通过FMCA方法染色和读取之后测量癌细胞杀死效果。

结果

如实施例1所述，以1胆固醇比5QHC（根据重量），即1胆固醇比1QHC （根据摩尔浓度）形成了G3颗粒，并由根据EM结果（见实施例1和图1A）的 形态推断。G3颗粒的U937癌细胞杀死效果与KGI颗粒的强度相同（图2），表 明当活性组分QHC结合到G3制剂时，活性组分QHC得到保持。之前已知KGI 能杀死U937癌细胞（PCT/SE2007/050878）。

实施例4

本实施例显示了根据如实施例1和实施例2所述的技术，两亲分子DT可结 合入G3颗粒。

DT是一种双萜，由甜叶菊（Stevia rebaudiana bertoni）¹⁰产生的甜菊苷。我们 使用了DT，因为它具有一些如所公开的¹¹有趣的医学（包括免疫的）性质。该 化合物的一个问题是它的体内生物利用度低，因为我们经历了需要传送体系，例 如在纳米颗粒中。

实现DC诱导癌细胞U937产生IL-8的能力以探索免疫效果，但更重要的是， 以用此细胞因子证明DC可能导致癌症分化，其对停止不受控的癌细胞增殖十分 重要。此外，检测了DT诱导包括IL-12的人类DC细胞因子的能力。进行这些 测验以强调DT对于Quil A具有重要的补充性免疫效果，因此，将它合并到G3 颗粒上十分重要。DT由智利圣地亚哥的Prodalysa LTDA公司来供应。这里我们 使用如《材料和方法》中所述来制备的人类树状细胞（DC）。

实验设计

所述U937细胞与KGI或者G3制剂一起在37℃下孵育48小时，从100μg/ml 开始，然后5倍稀释6次。然后，收集上清液，并用于IL-8的检测，如《材料和 方法》所述。

为了测量基因表达，人类DC与下列各项一起孵育6小时：BBE、KGI、甜叶 菊以及甜叶菊与BBE或KGI一起（图4A），以及加上或未加甜叶菊的G3（图 4B）。来自处理过的DC的多种细胞因子基因的表达通过如《材料和方法》所述 的mRNA芯片分析来实现。

结果

G3颗粒诱导U937癌细胞产生类似水平的IL-8，其是癌细胞的分化标记，通 过KGI诱导（图3）来产生。

图4A显示了DT诱导高水平的IL-12、IL1β和IL-6，比由ISCOM（如KGI 和BBE制剂）诱导的更高。

合并有DT的G3颗粒诱导高水平的IL-12，但没有合并DT的G3颗粒并不诱 导可检测水平的IL-12（图4B）。

讨论和结论

DT具有与G3互补的性质。诱导U937癌细胞来产生IL-8的能力可表明免疫 增强。更重要的是，G3可单独地分化并导致癌细胞停止增殖，就像KGI，正如 我们已经表明的（原稿准备加上）。对单独的G3的补充效果，已显示了DT强 烈地诱导IL-12，这对于诱导Th1型反应，尤其是对IFN-的产生来说十分重要， 所述IFN-的产生对于某些肿瘤具有抗癌效果。以免疫角度来看，如果存在被免疫 系统识别的肿瘤抗原，则IL-12对于肿瘤的排斥十分重要。IL-12还对于抗病毒感 染的免疫防御很重要。尤其重要的是记载DT作为运载/运送颗粒来合并入G3， 这增加了在施用之后它在颗粒形式下的稳定性，从而增强了G3的生物利用度。 应注意，单独的DT在水中是胶束形式。施用给个体的身体的胶束形式将解体， 因为在施用位点受到稀释并随后随着它从所述位点运走而减少。G3颗粒由其他 作用力来聚在一起，并例如在注射之后不解体，这被EM研究所记录（未发表）。 本实施例强调了G3发明作为两亲分子的载体。

实施例5

胸苷激酶（TK）活性被G3颗粒抑制是防止癌细胞的不受控的复制和在后续 步骤中引导细胞进行程序化细胞死亡（即细胞凋亡）的重要性质。

为了探索G3颗粒抑制癌细胞复制的一种机理，通过测量TK对于U937细胞 的酶抑制来进行检测。除了使用TK酶活性的抑制来显示癌细胞复制的抑制，这 种行为模式将被用来检测用于抗癌治疗的G3颗粒或者任何其他皂树制剂是否在 单独或者与其他抗癌制剂一起来治疗肿瘤病人中有用。这种检测可在试剂盒中使 用，以测量使用作用于定义为个人化医疗的领域中的临床样品的TK模式的抑制 的抗癌药的敏感性。

实验设计

将U937细胞暴露在同样浓度的G3或KGI下。如在《材料和方法》中所述， 在不同的时间点，收集被处理过的细胞，并且测量细胞间的TK活性。

结果

G3颗粒基本上抑制了与被KGI抑制的同样强度的细胞间的TK活性（图5）。

结论

TK活性的抑制显示癌细胞停止复制。因此，TK活性在细胞水平的抑制可用 于测量来自于病人样品的癌细胞对于药品（即G3颗粒）的敏感性，这会对个人 化医疗铺路。据我们所知，TK活性已经被用作从癌症病人检测血清TK或者从病 人检测其他疾病指标的非特异性检测：通过在来自病人的癌细胞上直接使用TK 活性是我们的创新（具有100%特异性，即仅仅使用了癌细胞）。这和癌细胞杀 死性质一起使得G3颗粒通过避免其用于非应答的病人而对于临床应用来说更为 可行。

第二部分G3作为抗癌药物

实施例6

本实施例显示了G3以及含DT的G3（G3-DT）比G3中作为非颗粒形式的活 性组分QHC（QHC）更加有效地杀死非实体瘤人类急性髓细胞性白血病（AML）。

实验设计

将如实施例1和2所述地制备的纳米颗粒G3和G3-DT与活性组分QHC形 式在癌细胞杀死效果方面进行比较。将样品从100μg/ml开始，5倍连续稀释6 次，与HL-60AML细胞一起孵育3天。然后，对细胞染色，并通过FMCA法读 取。

结果

G3（IC₅₀=3.144μg/ml）和G3-DT（IC₅₀=3.12μg/ml）比QHC（IC₅₀=8.473μg/ml） 更有效地抑制了AML细胞的生长（图6）。

结论和讨论

实质上，与非颗粒形式的QHC相比，G3具有更强的癌细胞杀死效果。与没 有DT的QHC或G3相比，将DT合并到G3颗粒上形成G3-DT增强了癌细胞杀 死效果。单独的DT没有癌细胞杀死效果（未显示）。所述非颗粒形式的QHC 导致了局部反应，所述局部反应通过颗粒形式而被消除了。G3-DT在杀死AML 癌细胞方面的添加的效果也涉及有益的剂量减少。

实施例7

阿糖孢苷（Cytarabine）是市售的用于治疗急性髓细胞性白血病（AML）的细 胞生长抑制药物。设立本实施例来探索G3增强阿糖孢苷的癌细胞杀死效果的能 力。

实验设计

如图7所示，将HL-60AML细胞分别暴露在预先决定的浓度的G3和阿糖胞 苷中3天，以及将HL-60AML细胞暴露在G3和阿糖胞苷两者的组合中3天。然 后，对细胞染色，并通过FMCA法对于癌细胞杀死效果进行读取。

结果

孵育3天后，单独的G3或者阿糖胞苷分别杀死少于5%和少于55%的细胞。 当它们结合起来，则杀死率显著提高（P<0.01）至约75%（图7）。

结论和讨论

G3颗粒显著增强阿糖胞苷对于HL-60AML细胞的杀死效果。用细胞生长抑 制药物阿糖胞苷来治疗会导致病人不舒服的副作用。由于G3颗粒实质上是无毒 的，G3和阿糖胞苷的联合治疗还有增加效力和通过降低阿糖胞苷的剂量来降低 副作用的前景。

实施例8

本实施例证明了G3对于市售的细胞生长抑制癌症药物道诺霉素在非实体瘤 人类急性髓细胞性白血病（AML）细胞方面具有增加的癌细胞杀死效果。

实验设计

将HL-60AML细胞暴露于固定浓度（1μM）的G3和从1000nM开始的增加 浓度的道诺霉素中，并孵育3天。然后将细胞染色，并通过FMCA法读取。

结果

与单独的道诺霉素相比，G3显著增强（P<0.0001）了道诺霉素的癌细胞杀 死效果（图8）。

结论和讨论

G3颗粒协同增强了道诺霉素对于HL-60AML细胞的杀死效果。由于G3颗 粒实质上是无毒的，可能细胞生长抑制药物道诺霉素的剂量在与G3的联合治疗 中显著降低会暗示更好的治疗效果，并且由于副作用降低，治疗对于对道诺霉素 敏感的病人的治疗可以持续更长的时间。

实施例9

本实施例设计用来比较G3和加上DT的G3（G3DT）对于实体瘤的效果，所 述实体瘤由人类前列腺癌细胞PC-3举例说明。

实验设计

将G3和G3DT与非颗粒形式的QHC比较。将样品从100μg/ml的浓度开始 进行5倍连续稀释6次，并与PC-3前列腺癌细胞一起孵育3天。然后，将细胞 染色，并通过FMCA法读取。

结果

G3颗粒（IC₅₀=2.75μg/ml）和合并的G3-DT（IC₅₀=1.662μg/ml）比单独的活 性组分QHC（IC₅₀=3.388μg/ml）更强烈地抑制了前列腺癌细胞的生长（图9）。

结论和讨论

本质上，本实施例的G3与QHC具有相似的对PC-3前列腺癌细胞的杀死效 果。通过将DT合并到颗粒上，即G3-DT，G3的癌细胞杀死效果与对AML细胞 的癌细胞杀死效果一样被增强了。已知单独的DT并没有癌细胞杀死效果。其在 此增加的杀死PC-3癌细胞的效果暗示了G3效果的增强，还有副作用（如果有） 的减少。应注意，非颗粒形式的QHC在体外相对有效，但在体内QHC保留在注 射位点，导致低的生物利用度和局部的副作用。

实施例10

本实施例证明了G3和市售药物多西他赛针对实体瘤的联合效果，所述实体 瘤由PC-3前列腺癌细胞来举例说明。

实验设计

如图所示，将PC-3细胞暴露于预定浓度的单独的G3和多西他赛以及这两者 的结合中3天。然后，将细胞染色，并通过FMCA法读取。

结果

单独的G3或多西他赛的癌细胞杀死效果分别为稍多于35%的细胞和稍多于 2%的细胞。当这两种药物合起来使用时，杀死率显著提高（P<0.01）至约75% （图10）。

结论与讨论

G3颗粒显著增强细胞生长抑制剂多西他赛对于前列腺PC-3癌细胞的癌细胞 杀死效果，考虑到G3颗粒实质上是无毒的，这就暗示了增加了效力，并且降低 了细胞生长抑制药的剂量（伴随着降低的副作用）。

实施例11

本实施例设计用来探索G3和一种新近的和被专利覆盖的细胞生长抑制市售 药物卡巴他赛对于实体瘤人类前列腺癌PC-3细胞的联合效果。

实验设计

将PC-3前列腺癌细胞暴露于结合有从100μM开始的增加浓度的卡巴他赛的 固定浓度（1μM）的G3，孵育3天。然后将细胞染色并通过FMCA法读取。

结果

单独的卡巴他赛杀死PC-3癌细胞，G3以IC₅₀=25.54μM杀死PC-3癌细胞。 合并有G3的卡巴他赛的癌细胞杀死效果（IC₅₀=0.00023μM）显著（P<0001） 增强（图11）。

结论和讨论

G3颗粒显著地且协同地增强卡巴他赛对于PC-3前列腺癌细胞的杀死效果， 考虑到G3颗粒实质上是无毒的这一事实，这暗示着效力更好、副作用减少以及 延长的治疗的前景。

实施例12

本实施例设计用来探索配以另一种重要的皂树皂苷部分QHA的G3颗粒的杀 死实体瘤的能力，在此所述实体瘤用ACHN肾癌细胞系来举例说明，因为其在之 前已观察到，配以该部分的Duecom颗粒比配以部分C（QHC）的Duecom颗粒 的杀死能力更强。

实验设计

将用QHA和QHC制备的G3从100μg/ml开始5倍稀释6次，直到0.032μg/ml， 并与ACHN肾癌细胞一起在37℃下孵育3天。通过FMCA法测定细胞存活率。

结果

用QHA制备的G3比用QHC制备的G3杀死显著（P<0.01）更多的ACHN 肾癌细胞（图12）。

结论和讨论

该结果实质上与对QHA和QHC制备的Duecom颗粒的之前的观察结果相同， 即有QHC的制剂选择性杀死更多非实体瘤细胞，但有QHA的制剂优选比杀死非 实体瘤杀死更多实体瘤。G3制剂的该肿瘤类型特异性杀死性质可利用于Duecom 颗粒，以避免杀死另一种类的正常细胞。

第三部分G3作为佐药

实施例13

G3颗粒作为佐药来抗整个病毒的动物实验

G3相比于ISCOM的佐药效果在C57BL/6小鼠上的动物实验中检测。在本实 验中，使用分解且失活的流感病毒作为模式抗原。

实验设计

每组6只小鼠，隔4周免疫接种2次，在第一次免疫接种3周后以及第二次 免疫接种4周后取血样（见上下页的附图说明）。解剖时（即第二次免疫4周后）， 如《材料和方法》中所述地分析脾脏细胞的细胞因子产生。为了便于理解，动物 的分组在图13A中显示。

结果

·在第一次免疫接种之后，G3和ISCOM以依赖剂量的方式，诱导了可检测 水平的HI抗体。在第二次免疫接种之后，对于含G3佐药的制剂，HI抗体水平 也以依赖剂量的方式显著增多（清楚的增加效应）。ISCOM、G3和带有DT的 G3佐药的制剂比不含佐药的市售疫苗显著地诱导更高水平的HI抗体，即在用 G3和ISCOM制剂在两个时间点（在第一次免疫接种之后（图13A）和第二次免 疫接种之后（图13B））免疫接种过的动物之间记载了相似或更高水平的HI反 应。

·在用G3和ISCOM制剂免疫接种的动物之间用裂解病毒体外重新刺激之后， 在解剖时（第二次免疫接种4周之后）在脾脏细胞中检测到相似或更高水平的 IFN-γ和IL-4反应（图13C）。

结论

由G3和ISCOM制剂诱导的抗体介导的免疫和细胞介导的免疫两者从质量上 和质量上是相同的，即G3制剂、G3和G3DT可以取代ISCOM作为佐药。

第四部分G3作为药物传送系统

实施例14

认为VLX40是一种有良好的癌症治疗前景的药物。因为VLX40不能制备成 适于施用给临床前试验的动物而由此不能用于后续病人中的试验，所以停止了市 场研究。这是因为VLX40不能变得可溶于水，而可溶于水对于被身体吸收是必 要的。本实验设计用来探究G3技术是否可以解决这个问题并使得VLX40可溶于 水。

实验设计

·首先将VLX40溶解于有机溶剂DMSO中，以产生浓度为20mM（5.8664 mg/ml，所推荐的最高浓度）的溶液，并命名为储备溶液。

·使用浓度为100μg/ml的VLX40作为水中VLX40的对照，即作为实质上 不溶于水的制剂。

·将8.5μl的VLX40储备溶液与50μl氯仿在包括500μl水的微量离心管中 混合，以形成人造脂膜（见实施例1）。在第二步中，加入10μl的Quil A（水中 100mg/ml作为储备溶液），在37℃下过夜孵育。这是G3-VLX40制剂，本质上 以与如实施例1所述相同的方式形成。

收集VLX40-DMSO对照（2）和G3-VLX40悬浮液/溶液（3），并在与上述 相同的浓度进行连续稀释之后在U937-GTB细胞上测试，从回归曲线计算IC50。

结果

加入水中的储备溶液（1）导致可见的沉积物或沉淀物，即如从之前的实验所 预测的。因此，VLX40不溶于来自对照管（2）的水。G3-VLX40颗粒（3）的制 剂通过澄清溶液/悬浮液的电子显微镜观测结果得到确认。从包括G3-VLX40制剂 的管中不存在沉淀或仅有非常少的沉淀。

将多种制剂测量功能，即用于U937细胞的癌细胞杀死效果的生物实验（见 《材料和方法》）。VLX40/DMSO（2）的水相具有低的抗癌效果（以IC50表达）， 意味着仅仅很少部分的VLX40/DMSO混合物溶解于水（图14A）。

相反，G3VLX-40颗粒制剂（3）的水相具有高的抗癌活性，如图14A所示。

也在体外检测沉淀的不溶解部分的杀死癌细胞效果。用在水不溶性沉淀中的 VLX40/DMSO（2）记载了高的癌细胞杀死效果，G3-VLX40制剂的少量的水不 溶性沉淀具有低的癌细胞杀死效果（图14B）。

这些实验重复了3次。

结论和讨论

将约50-100微克的VLX40与作为皂树组分的2mg的G3溶解于1ml体积水。 应注意，G3颗粒的浓度可通过G3颗粒的浓度的增加而增加，例如10mg/ml的 G3制剂可为澄清溶液。我们还可以改变G3颗粒的组成来促进更大量VLX40的 并入。本实施例清楚地证明了G3颗粒满足了促进用于临床应用的药物的制备的 未解决的需求，所述用于临床应用的药物制剂没有G3技术就不能抵达病人，因 为所述药物用现有技术无法变得可溶于水。

实施例15

本实施例证明了G3颗粒作为药物运送体系，可以轻易地结合另外两种不溶 于水的抗癌药物白消安（busulfan）和roscovitine，使得其变得可溶于水。

实验设计

使用于实施例1中步骤1所述的方法，将2μl白消安（50mg/ml在DMSO中） 或者1μl roscovitine（100mg/ml在氯仿中）与2μl胆固醇（100mg/ml在氯仿中） 一起用于形成分别带有白消安或者roscovitine的脂膜。然后，如实施例1中步骤 2地加入10μlQHC（100mg/ml在水中），以得到QHC：胆固醇：白消安/roscovitine 的摩尔比为1:1:0.5。

结果

对于两种化合物，即白消安和roscovitine，看到澄清的溶液，即通过将它们加 入水溶性G3颗粒来消除了由不溶性药物导致的水相中的沉淀或者雾状。

讨论

与实施例13类似，本实施例再一次显示了G3作为一般平台通过将其加入G3 颗粒来使水不溶性亲脂药物/分子变成水溶性的能力。考虑到约40%的抗癌药物候 选者是不溶于水的，因此，不能进一步研发成市售产品，我们的发明能够极大地 改善这种情况。

实施例16

在本实施例中，我们探究了亲脂维生素（即维生素D3）能否整合入G3纳米 颗粒中，以使得它变成水溶性的。如实施例1所述，将它溶于氯仿，并加到G3 颗粒上，更多细节请参见《材料和方法》。

实验设计

使用50%的胆固醇和50%的维生素D3来形成G3颗粒，以形成所述脂膜。将 QuilA加入水相以形成G3颗粒（更多细节请参考实施例1）。将水中100%的胆 固醇和100%的维生素D3用作对照。在乌普萨拉大学医院实验室在DiaSorin  Liaison automatic instrument仪器上分析在G3颗粒中结合有维生素D3的样品。

结果

在步骤2回收的水相是澄清的溶液，不能检测到沉淀。基于未分离的皂树（950 nmol/L）在G3-维生素D3制剂中检测到比在皂树QHC部分制剂（即55nmol/L） 更多的维生素D3。在稀释实验中，维生素D3的浓度在读取中是线性的，显示了 存在颗粒的均质悬浮液，即没有与如图1所示的其他G3颗粒一致的聚集。作为 对比，在维生素D3对照中仅检测到痕量的维生素D3，在胆固醇对照中不存在维 生素D3。

结论和讨论

维生素D3是必需维生素，其以脂质形式通过口服或肠胃外途径很难被身体 吸收。因此，水溶性形式将促进它通过这些方式吸收。我们在本实验中显示了维 生素结合到含皂树皂苷的未分离的以及QHC部分的纳米颗粒。重要的是，稀释 实验的线性读数显示了颗粒的均质分散，其通过对G3颗粒的一般电子显微镜观 察所揭示（见图1）。未分离的皂树皂苷在食物中被广泛接受并使用，例如，在 包括啤酒的饮料还有其他形式的食品中。因此，用来输送该维生素的G3的制剂 的更加便宜的替代物是用未分离的皂树作为G3制剂的基底。在本实验中，比含 QHC皂苷部分的G3颗粒更多的D3被结合到含未分离的皂树皂苷的G3中去。

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