基于8个麻蝇线粒体SNP遗传标记的法医昆虫学检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于8个麻蝇线粒体SNP遗传标记的法医昆虫学检测试剂盒，它包括SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.16所示序列的扩增引物和SEQ ID NO.17—SEQ ID NO.24所示序列的测序引物。本试剂盒基于焦磷酸测序平台进行，所以整个鉴定过程只需要3个小时，可以快速获得鉴别结果；该试剂盒扩增产物长度最短仅77bp，最长不超过278bp，故本试剂盒对于法医现场常见的昆虫降解检材的检测具有优势。

说明书

技术领域

本发明属于法医学技术领域，具体涉及一种用于法医昆虫学嗜尸性麻蝇种类鉴别的8 个线粒体SNP遗传标记的法医昆虫学检测试剂盒。

背景技术

死亡时间(Postmortem Interval,PMI)推断是指尸体被发现时距死亡时刻间隔的推测和 判断，在案件线索提供、侦查范围划定、作案时间分析、案件定性等方面均有重要意 义。PMI推断是刑事案件侦破的关键环节，也是法医学实践难点和研究热点。传统上，法 医根据尸体现象或者尸体内源性物质死后变化规律进行PMI推断，但尸体腐败进展严重阻 碍着这些方法的应用，此外传统方法的客观性、重复性、科学性也存在争议。因此，建 立科学的、客观的、可重复的PMI推断方法，成为法医学研究亟待解决的难题。法医昆虫 学恰恰是利用与尸体腐败关系密切的昆虫进行PMI推断。近年来，法医昆虫学在PMI推 断，特别是腐败尸体PMI推断等方面体现出较好的应用前景。

尸体上最常发现的是双翅目(Diptera)中的蝇类，因此蝇类被研究和实际应用最多，尤 其是蝇类中的麻蝇科(Sarcophagidae)、丽蝇科(Calliphoridae)和家蝇科(Muscidae)。 麻蝇科是双翅目中的一个庞大族群，目前全球已发现的种类有2600多个，超过100个 属。相比其它蝇类，嗜尸性麻蝇在PMI推断方面具有自身独特的优势。首先，麻蝇科很 多种类的幼虫都具有嗜尸性，这也正是麻蝇被称为“flesh-fly”的原因。第二，与其它蝇类 不同，大多数嗜尸性麻蝇不产卵，而是直接产幼虫于尸体上，因此一些表面有覆盖物的 尸体上可以发现麻蝇幼虫。同时，多数学者认为麻蝇“胎生”的繁殖方式缩减了幼虫的发育 环节，因而其PMI推断的准确性要优于其它蝇类。第三，麻蝇属的一些种类可以在阴雨 等特殊天气条件下飞行，阴雨天到达尸体最早的蝇类常常是麻蝇，因此在雨量丰沛的湖 南地区麻蝇的PMI推断价值更为突出。第四，在其它蝇类并不活跃的夏初及秋末，麻蝇 却常常可以在尸体上被发现，填补了特殊时段的空白。第五，麻蝇科部分种类有进入室 内活动的习惯，因此室内尸体上常常可以发现麻蝇的幼虫，这已被国内、外众多案件报 道所证实。第六，多数种类的麻蝇个体较大，更容易引起观察者的注意。

动物实验结果证实我国较为常见的嗜尸性麻蝇种类有棕尾别麻蝇Boerttcherisca  peregrina、肥须亚麻蝇Parasarcophaga crassipalpi、红尾粪麻蝇Sarcophaga africa、黄须 亚麻蝇Parasarcophaga miser、白头亚麻蝇Parasarcophaga albiceps、酱亚麻蝇 Parasarcophaga dux、黑尾黑麻蝇Helicophagella melanura、野亚麻蝇Parasarcophaga  similis、短角亚麻蝇Parasarcophaga brevicornis、红尾拉麻蝇Ravina pernix等十余种^{[2，10，11]}。根据嗜尸性麻蝇进行PMI推断的主要原理是：利用嗜尸性麻蝇生长发育特点结合环 境温度等条件，比较准确地判断其发育阶段和计算发育到该阶段所经历时间，进而推断 PMI。在相同条件下，不同种类的嗜尸性麻蝇的发育速率存在明显差异，例如：26.7℃红 尾粪麻蝇发育至成虫阶段需要10.5天，课题组前期实验发现同样温度下，棕尾别麻蝇发 育至成虫阶段需要16.7天，肥须亚麻蝇需要15.2天，黄须亚麻蝇需要23.8天；而白头亚 麻蝇、酱亚麻蝇、黑尾黑麻蝇、野亚麻蝇、短角亚麻蝇、红尾拉麻蝇因种类鉴定困难尚 缺少系统的发育资料，至今在实践中应用较少。由此可见，快速、准确的种类鉴定是利 用嗜尸性麻蝇进行PMI推断关键环节。

麻蝇成虫特点鲜明，一般体躯底色黑，具有灰白色粉被，胸部背面有银白色粉被， 间有黑色纵纹，腹部背面多数具有棋盘状斑，因此在科一级别上极易与丽蝇、家蝇等其 他科蝇类区分。麻蝇种与种间有时极难区分，成虫和幼虫的形态学鉴定有着公认的困难 性，采集到的幼虫通常需要饲养至羽化为成虫，以方便鉴定种类。至今仅棕尾别麻蝇和 肥须亚麻蝇的幼虫、蛹有形态学鉴别方法，其余种类的幼虫仍没有系统的形态学鉴定要 点，甚至雌性成虫的鉴定仍然十分困难。例如：酱亚麻蝇雄性成虫鉴别要点为：中足胫 节无长毛；第九背板黑色、棕色，少数红色；第7、8合腹节无缘鬃；肛尾叶除近端部的 前缘稍波曲外，渐向端部尖削，同时稍向前弯，末端尖；前阳基侧突宽短，略直，末端 爪转状；阳茎膜状突端部断截状，骨化而边缘不整齐；侧阳基体基部腹突略呈长方形， 前腹方有一小角，侧阳体端部中央短小，侧突分叉；而雌性鉴别要点非常少：第六背板 中断，两骨片相隔很近；第8背板存在；第7腹板后缘凹入，两后角具小毛群；三龄幼虫 鉴别甚至要借助于电镜，背板上小棘在电镜下可以看到微小皱折；一对后气门呈“D”型。 虽然麻蝇用于PMI推断的可行性已被理论和案例所证明，但种类鉴定困难大大降低了麻 蝇在PMI推断中的应用价值。因此，寻找快速、准确、经济的常见嗜尸性麻蝇鉴定方法 十分必要。

1994年Sperling等首次将DNA技术用于嗜尸性蝇类种类鉴定，在此后的十多年中， DNA分子鉴定作为形态学鉴定方法的补充手段，被越来越多的法医昆虫学研究者所接 受。国内外大量研究证实，线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)中的细胞色素氧 化辅酶Ⅰ和Ⅱ(cytochrome oxidase subunitsⅠandⅡ,COⅠ+COⅡ)全序列(约2300bp)可 以在基因水平上实现常见嗜尸性麻蝇的种类鉴定，甚至利用短片段的COⅠ、COⅡ、16S ribosomal DNA序列(200-300bp)既可完成部分种类鉴定。然而，目前的麻蝇分子鉴定技 术仍存在着缺陷。首先，全序列分析鉴别准确率虽然能达到99.3％，但费用高、耗时多， 而且一些特殊样本难以实现全序列扩增；其次，国际上常用的600bp的“barcode”区域鉴定 效力虽然较高，但已有研究证实单独应用该区域依然存在较大的风险；再次，目前短片 段序列被认为是分子鉴定的较好选择，这些仅有200bp左右片段非常容易扩增，即便是放 置了长时间样本也可以成功扩增出目的DNA，在特殊样本鉴定中有着明显的优势(蛹壳 等)，然而其鉴定准确率仅有80％左右，即便多片段联合分析依然难以达到满意的准确 率。因此，在现有分子鉴定基础上，寻找更为快速、准确、经济的嗜尸性麻蝇鉴定方法 十分必要。

发明内容

本发明旨在针对嗜尸性蝇类推断尸体死亡时间时麻蝇种类辨别困难的现状，利用麻蝇 线粒体SNP遗传标记对与死亡时间密切相关的红尾粪麻蝇、棕尾别麻蝇、肥须亚麻蝇和 黄须亚麻蝇进行法医昆虫学检测，从而能确定样本的种类。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述基于8个麻蝇线粒体SNP遗传标记的法医昆虫学检测试剂盒包括SEQ ID  NO.1—SEQ ID NO.16所示序列的扩增引物和SEQ ID NO.17—SEQ ID NO.24所示序列的 测序引物。

其中，SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.4,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.10,SEQ ID  NO.11，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.15所示扩增引物的5’端由生物素标记。

上述扩增引物和测序引物可用于制备法医昆虫学检测试剂。

下面结合原理对本发明作进一步说明：

本发明试剂盒中所述的扩增引物包含了8个麻蝇线粒体SNP遗传标记的共计16条扩 增引物，各条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1至SEQ ID No.16所示(见表1)：

表1焦磷酸测序扩增引物及生物素标记情况

本发明试剂盒中包括8条测序引物用于焦磷酸测序，测序引物的序列如SEQ ID No.17至 SEQ ID No.24所示(见表2)：

表2焦磷酸测序用测序引物

所述的焦磷酸测序引物能以上述8对扩增引物扩增到的产物为模板，在焦磷酸测序仪 内进行8个麻蝇线粒体SNP遗传标记的测序反应。

本发明试剂盒的说明书中还列出了8条焦磷酸测序待检测序列，在测序时输入到焦磷 酸测序软件中，决定焦磷酸测序仪dNTP的加样顺序，各条焦磷酸测序待检测序列的核苷 酸序列如SEQ ID No.25至SEQ ID No.32所示(见表3)：

表3焦磷酸测序待检测序列

本发明试剂盒的说明书中还列出了8个SNP基因座上的单倍型数据，包含了红尾粪麻 蝇、棕尾别麻蝇、肥须亚麻蝇和黄须亚麻蝇在8个SNP上的分型结果，四种麻蝇单倍型数 据见表4：

表4四种蝇类8个SNP基因座上的单倍型数据

本发明基于8个麻蝇线粒体SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒是基于筛选得到的 8麻蝇线粒体SNP遗传标记，利用焦磷酸测序体系构建的。该试剂盒由分离包装的8对扩 增引物、8条测序引物、8条焦磷酸测序待检测序列、四种麻蝇既红尾粪麻蝇、棕尾别麻 蝇、肥须亚麻蝇和黄须亚麻蝇的8个SNP单倍型。

该试剂盒的工作原理是首先通过扩增引物，同时扩增获得所有含有8个麻蝇线粒体 SNP的DNA片段。利用焦磷酸测序仪纯化工作站将上述扩增片段纯化并单链化。然后把 纯化后的单链DNA、测序引物及退火缓冲液，加入到含有dNTP、酶混合液、底物混合液 的试剂舱中进行焦磷酸测序。依据焦磷酸测序仪自动提供的分型结果与四种麻蝇单倍型 数据进行比对，从而判断样本的种类。

在本发明中，8个麻蝇线粒体SNP遗传标记对该检测试剂盒的构建极其关键。目前已 报道的具有法医昆虫学应用价值的麻蝇SNP基因座极其有限，所以要开发基于麻蝇SNP 的检测试剂盒就必须首先通过大量的实验归纳出可用于常见嗜尸性麻蝇种类鉴别的基因 座。根据以往的数据报道以及本单位多年来积累的测序结果，本发明中麻蝇线粒体SNP 遗传标记的筛选标准为：1)SNP组成的单倍型可以区分红尾粪麻蝇、棕尾别麻蝇、肥须 亚麻蝇和黄须亚麻蝇；2)SNP组成的单倍型在红尾粪麻蝇、棕尾别麻蝇、肥须亚麻蝇和 黄须亚麻蝇种内稳定、保守；3)其他常见嗜尸性麻蝇在这些SNP上的单倍型与红尾粪麻 蝇、棕尾别麻蝇、肥须亚麻蝇和黄须亚麻蝇种不同。

根据建立的上述标准，本发明共筛选出8个麻蝇线粒体SNP遗传标记用于建立法医昆 虫学的麻蝇种类鉴别体系。经过群体调查实验证明，本发明的8个麻蝇线粒体SNP遗传标 记在同种内高度保守，每种蝇类采用10个样本进行重复检测，同时与Genebank中已存在 的数据进行比对，未发现种内变异现象。试剂盒中所涉及的8个麻蝇线粒体SNP遗传标 记位点信息如表5。

表5

本发明试剂盒在对上述筛选到的8个麻蝇线粒体SNP遗传标记的检测中运用了焦磷酸 测序技术。焦磷酸测序技术可以同时纯化多个DNA扩增片段、同时进行测序，具有方 便、快捷、操作简单等优点适应法医学鉴定的实际需要。焦磷酸测序技术的关键和难 点，在于设计扩增和测序引物时，考虑了以下因素：1)引物自身、引物之间、引物与模 板之间无明显的发卡结构、错配和二聚体结构；2)测序引物原则上紧邻待检测SNP，避 免SNP相邻序列干扰检测结果的现象；3)扩增片段长度控制在280bp以下。

本试剂盒利用上述扩增引物，获得了包含10个SNP遗传标记的扩增产物，继而通过 焦磷酸测序纯化工作站纯化到单链DNA片段，以此为模板，利用焦磷酸测序引物，进行 焦磷酸测序反应。根据机器显示的分型结果，确定样本的单倍型，结合试剂盒提供的四 种麻蝇单倍型判断样本的麻蝇种类。

更具体的，本发明试剂盒具体包括的组分可为：

a)扩增引物对：如表1所示的8个麻蝇线粒体SNP遗传标记的扩增引物对；8个麻蝇 线粒体SNP遗传标记的扩增引物对用于获得含有8个SNP遗传标记的DNA片段。

b)扩增反应混合液：含有PCR缓冲溶液、MgCl₂、dNTPs、DNA聚合酶等常用成分。

c)扩增产物纯化试剂：含有磁珠、70％乙醇溶液、变性液、结合缓冲液、蒸馏水和洗 脱液；用于将扩增的产物进行单链化，以便于进行下一步操作。

d)焦磷酸测序引物：表2所示的8条焦磷酸测序引物；用于进行焦磷酸测序对应 SNP。

e)焦磷酸测序待检测序列：表3所示的8条焦磷酸测序待检测序列；用于控制焦磷酸 测序加样舱加样顺序。

f)焦磷酸测序反应试剂：包括酶混合物、底物混合物、dNTP、退火缓冲液。

g)麻蝇单倍型分析表：由表4所示的红尾粪麻蝇、棕尾别麻蝇、肥须亚麻蝇和黄须 亚麻蝇的8个线粒体SNP的单倍型；用于与焦磷酸测序结果比对，判断麻蝇种类。

扩增反应混合液和扩增产物纯化试剂(除磁珠意外)可按本领域常用的配方或按分子 生物学手册进行配制，也可直接使用商业化的产品。焦磷酸测序反应试剂和扩增产物纯 化试剂中的磁珠则一般需使用商业化的产品。

至于提取待检测样本中的DNA的模板，可使用本领域目前的各种常规试剂，提取 DNA模板可以参照现有的常规方法即可进行。

利用本发明所述试剂盒，可以对嗜尸性麻蝇DNA样本进行分析。分析方法包括以下 步骤；

1)提取待检测样本的DNA，作为扩增模板；

2)利用上述扩增引物和扩增反应混合液对步骤1提取的DNA进行扩增；所述扩增反应的 循环参数为：94℃，5分钟；94℃,30秒，48℃～58℃(具体见表1)，30秒，72℃， 30秒，35个循环；然后72℃，10分钟，获得PCR产物；

3)将步骤2中的PCR产物放到焦磷酸纯化工作站中，单链化PCR产物，具体如下： 200μL EP管中加入50μL PCR产物、47μL结合缓冲液、3μL磁珠，振荡10分钟；使 用焦磷酸制样工作站内的泵吸住结合DNA片段的磁珠，在70％乙醇溶液中驻留5秒， 变性液中驻留5秒钟，漂洗液中驻留5秒钟，最终把结合磁珠的泵放入含有45μL退火 缓冲液和3μL测序引物(SEQ ID No.17至SEQ ID No.24)的溶液中，关掉泵的开关使 结合PCR产物的磁珠进入液体中；把液体放到80℃恒温箱，静置2min；权利要求4 中提到的焦磷酸测序待检测序列(SEQ ID No.25至SEQ ID No.32)输入到焦磷酸测序仪 中；把纯化后的液体放入焦磷酸测序仪中进行检测。

4)准备好焦磷酸测序反应用的酶混合物、底物混合物及dNTP，加入到试剂舱，将步骤3 的扩增产物加至含有测序引物的退火缓冲液中进行焦磷酸测序反应。

5)从焦磷酸测序仪自动读取的10个SNP的单倍型与本试剂盒提供的红尾粪麻蝇、棕尾别 麻蝇、肥须亚麻蝇和黄须亚麻蝇的10个线粒体SNP的单倍型进行比对从而确定麻蝇种 类。

项目组前期初步构建了嗜尸性麻蝇基因库，在寻找湖南地区嗜尸性麻蝇最佳分子标 记过程中发现，湖南地区常见嗜尸性麻蝇mtDNA序列中存在信息性单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism,SNP)，Mega5软件分析发现通过这些SNP基因座建立 的单倍型类群具有较好的麻蝇种类鉴定价值。昆虫学领域的研究中也发现了一些信息性 的SNP基因座，但尚未应用于种类鉴定。本发明有望解决目前湖南地区嗜尸性麻蝇分子 鉴定中存在的诸多问题。第一，该方法基于焦磷酸测序技术，速度上明显优于常规测序 方法；第二，该方法通过收集不同序列上的信息性SNP位点，整合了不同片段的优点， 其准确性明显优于常规分子鉴定方法；第三，该方法扩增片段长度仅80-100bp左右，因 此对样本的保存、性状、部位等要求非常宽松，能够实现在最大范围的案件中推广应 用。第四，该方法对检材需求量较低，有着标准化的程序和方法，重复性好；第五，该 方法成本较低，经济适用。应用焦磷酸测序技术检测mtDNA单倍型类群，将第三代遗传 标记引入麻蝇分子鉴定，可以实现快速、准确、经济的湖南地区常见嗜尸性麻蝇种类鉴 定。

与现有技术相比，本发明麻蝇线粒体SNP检测试剂盒的有益效果为：

本发明试剂盒包含8个麻蝇线粒体SNP遗传标记，通过8个SNP组成的单倍型可以 有效区分对法医死亡时间推断具有重要意义的红尾粪麻蝇、棕尾别麻蝇、肥须亚麻蝇和 黄须亚麻蝇；且该试剂盒灵敏度、准确性、可重复性、扩增特异性等方面满足法医DNA 检测工作的要求，是现有法医昆虫形态学鉴定的有效补充；本试剂盒基于焦磷酸测序平 台进行，所以整个鉴定过程只需要3个小时，可以快速获得鉴别结果；该试剂盒扩增产物 长度最短仅77bp，最长不超过278bp，故本试剂盒对于法医现场常见的昆虫降解检材的检 测具有优势。

附图说明

图1至8为本发明对棕尾别麻蝇生物检材8个位点的焦磷酸测序和Sanger法测序结果 图；图1至8中每幅图的图A为焦磷酸测序结果，图B为Sanger法测序结果；图A中的 横坐标为依据焦磷酸测序待检测序列加样舱加入的酶、底物和dNTP，纵坐标数值表示荧 光强度；图B中的横坐标为检测到的DNA序列，纵坐标数值表示荧光强度。

具体实施方式

实施例中所用试剂无特殊说明均使用以下试剂和仪器；

实施例1

试剂盒的制备

用于检测的麻蝇线粒体SNP复合检测试剂盒可包括分别包装的以下试剂：

a)扩增引物对。由表1所示的扩增引物对，由TaKaRa Biotechnology公司合成，将合 成好的8对扩增引物用超纯水配置为10pM/μL。

b)焦磷酸测序引物。表2所示的扩增引物对，由TaKaRa Biotechnology公司合成，合 成好的8条测序引物用超纯水配置为10pM/μL。

c)扩增反应混合液。本实施例中使用Promaga公司的PCR反应混合液2×Green Master Mix(Promerga,Madison,WI,U.S.A.)。

c)焦磷酸测序纯化试剂。本实施例中使用QIAGEN公司的焦磷酸测序纯化试剂盒。

d)焦磷酸测序试剂。本实施例中使用QIAGEN公司的PyroMark substrate Mixture焦 磷酸测序试剂盒。

e)纸质说明书。包含红尾粪麻蝇、棕尾别麻蝇、肥须亚麻蝇和黄须亚麻蝇单倍型数据 以及待测引物序列在本发明说明书中附送。

将上述试剂分别按各自常规要求包装后即制得基于麻蝇线粒体SNP遗传标记的法医 昆虫学麻蝇检测试剂盒，用于后继的实验。

使用本发明试剂盒检测13种麻蝇

使用上述基于麻蝇线粒体SNP遗传标记的法医昆虫学检测试剂盒，我们进行了13种 常见嗜尸性麻蝇生物学检材的检测。具体的检测过程按如下进行：

a、用试剂盒从13种麻蝇肌肉样本中提取基因组DNA，作为扩增模板；

b、以步骤a中的DNA模板，利用8对扩增引物SEQ ID No.1至SEQ ID No.16和扩增反应 混合液将样本在下述扩增体系中进行分别PCR扩增；

扩增的热循环参数

c、200μL EP管中加入50μL PCR产物、47μL结合缓冲液、3μL磁珠，振荡10分钟；使 用焦磷酸制样工作站内的泵吸住结合DNA片段的磁珠，在70％乙醇溶液中驻留5秒， 变性液中驻留5秒钟，漂洗液中驻留5秒钟，最终把结合磁珠的泵放入含有45μL退火 缓冲液和分别加入3μL权利要求3中提到的测序引物SEQ ID No.17至SEQ ID No.24的 溶液中，关掉泵的开关使结合PCR产物的磁珠进入液体中；把液体放到80℃恒温箱， 静置2min；得到分离纯化后的单链DNA模板；

d、焦磷酸待检测序列SEQ ID No.25至SEQ ID No.32输入到焦磷酸测序仪中；

e、将上一步纯化得到的产物放入焦磷酸测序仪内，准备好焦磷酸测序反应用的酶混合 物、底物混合物及dNTP，加入到试剂舱，进行焦磷酸测序；

f、焦磷酸测序仪自动对测序结果进行判读，根据与说明书中的四种麻蝇单倍型进行比 对，确认麻蝇的种类(见表6)；

表6

由于检测了13种麻蝇16个样本(另有2种丽蝇，一种家蝇)，以棕尾别麻蝇为例， 图1至8中的A图表示第1至8号棕尾别麻蝇样本的分型结果，可以清晰地分辨该样本具 有的所有等位基因，从而可以判断该棕尾别麻蝇的单倍型。而以上结果还使用sanger测序 法进行测序验证，其中1至8号样本的测序结果分别见图1至8中的B图，阴影框内的碱 基为SNP位点，与焦磷酸测序结果完全一致。

根据16个样本的sanger测序结果，我们可以将这些样本分为13种麻蝇，2种丽蝇，1 种家蝇。所有16种蝇类的焦磷酸测序结果见表6，从表中可以看到红尾粪麻蝇、棕尾别麻 蝇、肥须亚麻蝇和黄须亚麻蝇的单倍型与我们说明书上提供的单倍型一致，而且样本间 的重复性较好，不同属或麻蝇属的其他种类的单倍型与该四种麻蝇单倍型不同。说明本 发明采用的扩增引物和延伸引物可以区分四种麻蝇。