在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法

摘要

本发明公开了一种在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法，采用Real-time PCR，在水稻叶片上采用剪叶法侵染白叶枯病菌，侵染46～50小时后，取距离剪口处1cm之内的叶片组织进行检测。表达基因包括Os03g0853200、OsPR1b、OsNPR1等。采用本发明的方法能轻易的对白叶枯病菌侵染的水稻组织进行选取，并能有效地检测其诱导基因的表达。

说明书

技术领域

本发明涉及一种在水稻中检测受白叶枯病菌诱导表达基因的有效方法，属于分子遗传学领域。

背景技术

水稻白叶枯病是由革兰氏阴性黄单孢菌水稻变种(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae，Xoo.)所引起的一种世界性细菌病害，它与稻瘟病、纹枯病一起被称为水稻的“三大病害”。水稻遭遇白叶枯病后，一般减产20～30％，严重时可达50％，甚至绝收。利用水稻的抗病基因是防治白叶枯病最经济、环保的方法，也是水稻育种中提高杂交稻抗病性的有效途径。水稻抗白叶枯病基因往往受白叶枯病菌的诱导表达，所以在白叶枯病菌侵染的水稻中检测被诱导表达的基因，是发现抗性基因的有效方法，为水稻抗性基因的功能研究和育种利用奠定坚实基础。

目前，检测基因表达的方法非常成熟，主要有半定量RT-PCR法、Real-time PCR法、Northern blotting法等。其中，Real-time PCR可以精确定量某个基因的表达水平，是比较公认的检测基因表达的方法。在检测白叶枯病菌诱导表达的基因时，一般是选取一段接种过白叶枯病菌的水稻叶片，提取总RNA后，用Real-time PCR分析基因表达水平。由于不同基因的表达方式可能有所不同，有些可能是在叶片接种病菌的局部受到诱导表达，有些则是在整张叶片上受到诱导表达，因此如何合理地选取叶片组织是检测基因受白叶枯病菌诱导表达一个非常关键的因素。但是，选取哪一段接种过白叶枯病菌的水稻叶片，离接种处多少距离，才能有效地检测出被诱导表达的抗性基因，目前还没有一个明确的标准。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法；采用本发明的方法能轻易的对白叶枯病菌侵染的水稻组织进行选取，并能有效地检测其诱导基因的表达。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法，采用Real-time PCR，在水稻叶片上采用剪叶法侵染白叶枯病菌(白叶枯病菌PXO86)，侵染(接种)46～50小时(较佳为48小时)后，取距离剪口处1cm(包括1cm)之内的叶片组织进行检测。

作为本发明的在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法的改进：在水稻分蘖期，在水稻叶片上采用剪叶法侵染白叶枯病菌。

作为本发明的在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法的进一步改进：

表达基因为Os03g0853200、OsPR1b、OsNPR1等；

当表达基因为Os03g0853200时，引物为：

5’-GAGCAACGACCAACAAAAG-3’和5’-GCAGAAAATGGGAAAGAAG-3’；

当表达基因为OsPR1b时，引物为：

5’-GGCAACTTCGTCGGACAGA-3’和5’-CCGTGGACCTGTTTACATTTTCA-3’；

当表达基因为OsNPR1时，引物为：

5’-CTGATCCGGTTTCCCTCGGA-3’和5’-GACCTGTCATTCTCCTCCTTG-3’。

本发明的方法提供了有效的取样方法，采用本发明的方法能最有效地检测到基因受白叶枯病菌的诱导表达。

本发明的过程如下：

通过Real-time PCR技术，发明人发现了水稻一个基因(GenBank accession:Os03g0853200)受白叶枯病基因的诱导表达，在动物中该基因的同源基因参与机体的免疫应答。为了分析该基因(Os03g0853200)在接种白叶枯病菌的水稻叶片中的表达情况，发明人首先采用剪叶法(Kauffman et al.,1973)对水稻抗病品种IRBB7和感病品种IR24接种白叶枯病菌，用沾了菌液的剪刀在叶片顶端横向剪去一段，在剪过的伤口处白叶枯病菌会沿着维管束向叶片基部方向侵染；然后，根据离剪口的距离，将接种的叶片分成I至V区域(图1)，每个区域的叶片组织独立提取总RNA和反转录成cDNA，用Real-time PCR分析该基因的表达水平。结果表明该基因在感病品种IR24中没有被诱导表达，而在抗病品种IRBB7中被显著性地诱导表达。不过，在叶片I至V区域中该基因表达被诱导的程度不同，在I区的表达量最高，随着距离剪口处越远，基因表达越低，在Ⅱ区的表达量只有Ⅰ区的一半，到Ⅳ区已趋于本底表达，无诱导表达。以上结果表明，在I至III区域内都能非常明显地检测到该基因受白叶枯病菌的诱导表达，但是在I区检测到的表达量最高，即在距离剪口处1cm以内可最有效地检测到基因受白叶枯病菌诱导的表达(图2)。

本发明对在水稻中检测受白叶枯病诱导表达的基因时，如何科学地取样做了明确的说明，为抗白叶枯病基因的表达分析提供了一种有效的方法，也为其它植物抗病基因的研究提供了借鉴。

综上所述，采用本发明的方法能有效的在白叶枯病菌侵染的水稻中检测出被诱导表达的基因，是发现抗性基因的有效方法，为水稻抗性基因的功能研究和育种利用奠定坚实基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1接种白叶枯病菌的水稻叶片分区示意图；

图2叶片不同部位中Os03g0853200基因的Real time-PCR表达分析图；

图3水稻抗病相关基因OsPR1b的Real time-PCR表达分析图。

图4水稻抗病相关基因OsNPR1的Real time-PCR表达分析图。

具体实施方式

实施例1、

1、接种体制备方法：

将白叶枯病菌PXO86接种在PDA培养基(马铃薯300g/L，葡萄糖30g/L，琼脂15g/L)上，于28温培养箱中培养3-4d，用蒸馏水从培养基上洗下菌落，并稀释成浓度为9×10⁸cfu/mL的细菌悬浮液。在水稻分蘖期，采用剪叶法(Kauffman>存。

备注说明：

距离剪口处0至1cm为区域I，距离剪口处＜1至2cm为区域Ⅱ，距离剪口处＜2至3cm为区域Ⅲ，距离剪口处＜3至5cm为区域Ⅳ，距离剪口处＜5至7cm为区域Ⅴ。

备注说明：上述每个区域取样时是选取该区域中距离剪口最远之处，即，区域I选取距离剪口1cm之处，区域Ⅱ选取距离剪口2cm之处，其余以此类推。

2、用RNeasy Plant mini Kit(QIAGEN公司)分别从每一叶片组织的区域I～区域Ⅴ中每个区域提取总RNA(即为下文中所用的RNA)，参照该试剂盒说明书方法操作。

将提取的总RNA逆转录成cDNA：取5ug总RNA、4uL Oligo(dT)₁₈引物(浓度为5uM)，加Rnase>

3、采用ABI公司StepOne Real-Time PCR System，用Fast SYBR Green Master Mix(TOYOBO公司)试剂盒，反应体系为：10uL2×Fast SYBR Green Master Mix，0.4uL50×Rox,0.8uL基因(Os03g0853200)特异性引物(序列为5’-GAGCAACGACCAACAAAAG-3’和5’-GCAGAAAATGGGAAAGAAG-3’，浓度均为5uM，各加0.4uL)，1uL cDNA模板(浓度为10ng/uL)，加ddH₂O至20uL。

PCR反应程序为：95变性5min；95个循环；从而获得相应的CT值。

备注说明：经常规方法验证，所得确为基因Os03g0853200。

以水稻管家基因β-actin作为内参，即将上述反应体系中的“基因(Os03g0853200)特异性引物”改成水稻管家基因β-actin的引物(序列为：5’-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3’和5’-CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3’)；其余等同。每个样品重复3次，使用2^-△△CT法处理数据，分析基因的表达水平和差异，具体公式为：

表达差异倍数＝2^{-[(样品目的基因CT值﹣样品管家基因CT值)]﹣[(对照目的基因CT值﹣对照管家基因CT值)]}

备注说明，上式中：

样品目的基因CT值是指：水稻抗病品种IRBB7于目的基因(Os03g0853200)下所得的CT值；

样品管家基因CT值是指：水稻抗病品种IRBB7于水稻管家基因β-actin下所得的CT值；

对照目的基因CT值是指：感病品种IR24于目的基因(Os03g0853200)下所得的CT值；

对照管家基因CT值是指：感病品种IR24于水稻管家基因β-actin下所得的CT值。

最终所得的结果如图2所示。

根据图2可知：在接种了白叶枯病菌的IRBB7叶片中，在I至III区域内都能非常明显地检测到该基因受白叶枯病菌的诱导表达，但是在I区检测到的表达量最高，即在距离剪口处1cm以内可最有效地检测到基因受白叶枯病菌诱导的表达。

实施例2、将实施例1中的基因(Os03g0853200)改成OsPR1b(GenBank accession:EF061247.1)，将相应的引物序列改为5’-GGCAACTTCGTCGGACAGA-3’和5’-CCGTGGACCTGTTTACATTTTCA-3’，其余同实施例1。

备注说明：经常规方法验证，所得确为基因OsPR1b。

实验结果如图3所示，在感病品种IR24中，该基因没有受白叶枯病菌的诱导表达；而在接菌的抗病品种IRBB7叶片的I区域(即距离剪口处1cm以内)，最显著地检测到该基因受诱导表达。

备注说明：受病原菌诱导表达的水稻抗病相关基因OsPR1b是一个公认的抗病标记基因，用以表明植物抗病系统的激活。

实施例3、将实施例1中的基因(Os03g0853200)改成OsNPR1(GenBank accession:DQ450948.1)，将相应的引物序列改为5’-CTGATCCGGTTTCCCTCGGA-3’和5’-GACCTGTCATTCTCCTCCTTG-3’，其余同实施例1。

备注说明：经常规方法验证，所得确为基因OsNPR1。

实验结果如图4所示，在感病品种IR24中，该基因没有受白叶枯病菌的诱导表达；而在接菌的抗病品种IRBB7叶片的I区域(即距离剪口处1cm以内)，最显著地检测到该基因受诱导表达。

备注说明：受病原菌诱导表达的水稻抗病相关基因OsNPR1也是一个公认的抗病标记基因，用以表明植物抗病系统的激活。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江师范大学

<120> 在水稻中检测受白叶枯病诱导表达基因的有效方法

<160> 6

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Os03g0853200的前引物

<400> 1

gagcaacgac caacaaaag 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Os03g0853200的后引物

<400> 2

gcagaaaatg ggaaagaag19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>OsPR1b的前引物

<400> 3

ggcaacttcg tcggacaga 19

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>OsPR1b的后引物

<400> 4

ccgtggacct gtttacattt tca23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>OsNPR1的前引物

<400> 5

ctgatccggt ttccctcgga20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>OsNPR1的后引物

<400> 6

gacctgtcat tctcctcctt g 21