Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法

摘要

本发明公开了一种Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法。本发明首先将酶切线性化后的携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体，采用原核显微注射法，靶向性地导入小鼠体内，制备得到Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠。该方法在国内外率先建立了一种新型可诱导型非免疫耐受的乙肝疾病模型，即Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠，可针对性的应用于乙肝相关研究领域中，能够真实、全面地反映临床乙肝发生、发展过程，填补了国内外此类动物模型的空白。

说明书

技术领域

本发明涉及动物模型构建领域。更具体地，涉及一种Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法。 

背景技术

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球范围内影响人类健康的重大问题。由HBV感染导致的慢性进行性肝脏炎症病变，常常发展为肝硬化、肝癌并最终导致死亡。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染者，每年因此死亡的人数约为100万～200万。我国一直是HBV感染的高发区，最新的资料表明，我国现有的慢性HBV感染者约为9300万例，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例，占慢性HBV感染者的1/5强。慢性HBV感染者和慢性乙型肝炎患者由于携带有大量HBV，是HBV的最主要传染源。我国每年都投入大量的经费和人力物质资源用于该类人群的治疗和阻止HBV在人群中的进一步传播，给我国带来了非常严重的经济和社会负担，使本已十分有限的医疗资源更加紧张。为此，开展深入和多层次的HBV感染尤其是慢性HBV感染和慢性乙型肝炎的相关研究，对于攻克这一影响我国近1亿人口身体健康的疾病，维护我国人口的身体健康具有重要意义。 

    在乙型肝炎的相关研究中，乙型肝炎动物模型具有举足轻重的地位，乙型肝炎动物模型应用于从HBV感染机制、被感染机体的免疫状态改变、HBV在被感染机体内的免疫逃逸机制、HBV的基因治疗以及HBV治疗药物的疗效评价等的各个层次和各个方面。因而合适的动物模型的建立与选择往往成为HBV研究工作的关键，对研究工作起到事半功倍的作用。为此，许多学者都曾致力于建立各种类型的乙型肝炎动物模型。然而由于人类HBV属于嗜肝DNA病毒科，有较强的种属特异性，自然条件下只感染人和非人灵长类（如黑猩猩等），所以建立起能广泛应用的动物模型并非易事。黑猩猩模型因其体积较大、成本高以及受伦理道德约束等限制了其应用；而树鼩模型则由于其感染效率低，仅能导致短暂的轻度感染，病毒滴度很低，而难以推广应用；鸭乙型肝炎的动物模型，则存在其药代动力学和免疫学遗传背景与人类有很大的不同的缺陷、土拨鼠仅产于北美，运输困难且价格昂贵，从而限制了这些动物模型的广泛应用，进而限制了对乙型肝炎发病机制、免疫病理、治疗药物以及免疫治疗的相关研究。 

近年来，由于遗传和免疫背景清楚、易于饲养等优点，小鼠逐渐受到研究人员的关注，成为构建HBV动物模型的最佳选择。研究人员建立了人-鼠肝嵌合体HBV小鼠模型、基因转染HBV小鼠模型和HBV转基因小鼠模型。 

但是，尽管人-鼠肝嵌合体HBV小鼠模型可以说是目前最好的HBV感染复制模型，但是由于该模型没有免疫机能，因而不能进行免疫介导的病毒清除和肝炎免疫致病机制的研究。基因转染HBV小鼠模型由于是一过性的HBV复制模型，因而只能用于急性HBV感染的研究，不适用于慢性HBV感染和慢性乙型肝炎研究。此外，由于注射剂量太大（相当于小鼠全身体液的总量），对小鼠肝脏和其他器官造成的损伤也不能忽视。目前已有的HBV转基因小鼠也存在着明显的缺陷。首先，目前已有的HBV转基因小鼠由于并非通过被HBV感染的途径建立，因此无法用来进行HBV进入被感染机体和HBV在机体内的散布研究；其次，目前已有的HBV转基因小鼠对HBV病毒抗原处于免疫耐受状态，机体不能产生对HBV的免疫反应，也不产生乙型肝炎病变。以上原因导致了可用于慢性HBV感染和慢性乙型肝炎非免疫耐受的动物模型的缺失，客观上影响了相关研究的深入开展。因此建立可控、支持HBV体内感染并能导致类似于临床乙肝病变的，非免疫耐受的HBV小鼠模型成为深入了解乙肝发病机制，肝脏病变的发展和转归机制，抗乙肝药物的研发及评价新的乙肝免疫疗法的重要关键因素。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有制备乙肝研究用动物模型存在的缺陷，提供一种新型可诱导型的、非免疫耐受的乙肝疾病动物模型的构建方法。 

本发明的目的是提供OVA-HBsAg基因在构建Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠方面的应用。 

本发明的另一个目的是提供一种Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法。 

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现： 

本发明提供了OVA-HBsAg基因在构建Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠方面的应用。

所述的OVA为卵清蛋白（ovalbumin，OVA）基因。 

本发明还提供了一种Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法，具体包括以下步骤： 

S1.携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体pCCALL2-Anton进行酶切线性化；

S2.将酶切线性化后的携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体pCCALL2-Anton，采用原核显微注射法，靶向性地导入小鼠体内，制备得到Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠。

其中，步骤S1所述的携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体pCCALL2-Anton由中科院生物物理所王盛典教授惠赠；表达载体pCCALL2-Anton的全长序列如SEQ ID NO：1所示。表达载体pCCALL2-Anton的结构示意图如附图1所示，表达载体pCCALL2-Anton的质粒图谱如附图2所示。 

步骤S1所述酶切的反应体系酶切反应体系如下： 

酶切反应条件为37℃，酶切3h。

酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定如附图3所示。 

酶切产物纯化回收，回收产物浓度调至5ng/μL，-20℃保存，用于后续显微注射。注射时，一次使用一管。 

    步骤S2所述显微注射法的具体步骤如下： 

S21. 选6～8周龄发育良好的C57BL/6J×DBA母鼠，腹腔注射孕马血清促性腺激素，48h后注射人绒毛膜促性腺激素；

S22. C57BL/6J×DBA母鼠经过步骤S21的激素超排处理后，与C57BL/6J公鼠按1：1合笼，次日清晨挑选阴栓阳性母鼠，从阴栓阳性母鼠得到单细胞受精卵；

S23. 将结扎KM公鼠与正常KM母鼠按1：2合笼，选取有阴栓且阴门肿胀、红润的母鼠，即为假孕KM母鼠；

S24.将酶切回收后的线性化pCCALL2-Anton的溶液利用原核显微注射方法直接注入单细胞受精卵的雄性原核内；

S25.取注射后存活的受精卵移植到假孕KM母鼠的输卵管内，待KM母鼠产仔后，利用PCR方法进行检测，阳性小鼠即为Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠。

本发明还提供按照上述构建方法构建的Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的生物学特性研究，并且研究了所述Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠与Cre鼠杂交后OVA-HBsAg的诱导表达研究。 

本发明构建并鉴定Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠和转基因小鼠应用研究的技术路线如下（如附图4所示）： 

本发明将携带目的基因OVA-HBsAg，并带有LoxP位点的表达载体质粒，采用原核显微注射法，靶向性地导入小鼠体内，制备出受Cre重组酶调控表达的、非免疫耐受的OVA-HBsAg转基因小鼠。在国内外率先建立了一种能稳定传代的新型可诱导型的、非免疫耐受的乙肝疾病模型，即Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠。这一模型将具有与传统的转基因小鼠不同的特点，该模型只有在Cre重组酶的作用下，转入小鼠体内的HBsAg才能表达，因此该小鼠对于HBsAg是非耐受的，更接近临床人感染乙肝的状况，从而可以真实、全面地反映临床乙肝发生、发展过程，为进一步研究乙肝发病机制，肝脏病变的发展和转归机制研究，HBsAg感染后机体的病理改变以及机体免疫系统在抗病毒感染和免疫致病过程中的作用机制提供理想的动物模型。这一模型的建立将填补国内外缺乏此类动物模型的空白，使相关的研究手段更加丰富，也为抗乙肝药物的研发提供更加先进的评价体系和技术平台，为建立乙肝的免疫治疗方法并作出评价提供一种全新的思路和研究平台，可以利用此转基因小鼠模型进行乙肝免疫致病机制的研究及乙肝免疫治疗新方法的探索性研究，并为后续实现这种新的乙肝疾病模型的产业化和批量供应奠定坚实的基础，促进我国乙肝治疗、研究水平的提高。

Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠模型的使用方法：因为构建的小鼠模型是受Cre重组酶调控的，所以，在使用小鼠模型用于研究之前，要用Cre重组酶诱导目的基因OVA-HBsAg表达，优选地诱导方法为：将Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠与Cre阳性小鼠进行杂交，杂交的方法优选为将Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因母鼠与Cre阳性公鼠按照2：1的数量比例合笼随机交配，获得子代小鼠。 

所述的Cre阳性小鼠为可表达Cre重组酶的小鼠；本发明实施例所用的是本室饲养的可表达Cre重组酶的C57BL/6J背景Alb-Cre转基因小鼠。 

本发明具有以下有益效果： 

本发明克服了现有乙型肝炎研究用转基因动物模型存在的局限和不足，提供了一种能稳定传代的新型可诱导型的、非免疫耐受的乙肝动物模型的制备方法，即Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法，填补了国内外缺乏此类动物模型的空白。

本发明构建得到的转基因小鼠能够全面、真实地反映临床乙肝发生、发展过程，为乙肝发病机制、肝脏病变的发展和转归机制研究、机体免疫系统在抗病毒感染和免疫致病过程中的作用机制研究及抗乙肝药物的研发和评价提供理想动物模型，为建立乙肝的免疫治疗方法并作出评价提供了一种全新的思路和研究平台，促进我国乙肝治疗研究水平的提高。 

附图说明

图1.携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体pCCALL2-Anton的结构示意图。 

图2.携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体pCCALL2-Anton的质粒图谱。 

图3.质粒pCCALL2-Anton经ApaI单酶切电泳结果图。 

图4.本发明构建并鉴定Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠和转基因小鼠应用研究的技术路线图。 

图5.OVA-HBsAg转基因小鼠HBsAg基因PCR鉴定结果图。 

图6.OVA-HBsAg转基因小鼠与Cre小鼠杂交子代Cre基因PCR鉴定结果图。 

图7为Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的生物学特性研究技术路线图。 

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规试剂、设备和方法。 

除非特别说明，以下实施例使用的试剂和试剂盒均为市购。 

除非特别说明，本发明实施例所用C57BL/6J小鼠、KM小鼠和C57BL/6J×DBA小鼠均为市购。 

实施例1 构建Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠

1、表达载体pCCALL2-Anton的酶切

携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体pCCALL2-Anton由中科院生物物理所王盛典教授惠赠；表达载体的全长序列如SEQ ID NO：1所示。

其中，目的基因OVA-HBsAg载体的结构示意图如附图1所示。 

    携带有OVA-HBsAg基因的表达载体pCCALL2-Anton的质粒图谱如附图2所示。 

首先，将携带有OVA-HBsAg基因的表达载体pCCALL2-Anton，用内切酶ApaI进行单酶切线性化（序列长度为10771bp）。具体酶切的条件如下： 

酶切反应体系如下：

在37℃，酶切3h；酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定如附图3所示。

 酶切产物纯化回收；用无菌水将回收产物的浓度调至5ng/μL，分装5μL/管，-20℃保存，用于后续显微注射。注射时，一次使用一管。 

2、采用原核显微注射法制备Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠。 

原核显微注射法制备转基因小鼠的具体方法如下： 

S21.选6～8周龄发育良好的C57BL/6JxDBA母鼠，腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG（10U），48h后注射人绒毛膜促性腺激素HCG（10U）；

S22.所述C57BL/6J×DBA母鼠经过步骤S21的激素超排处理后，与C57BL/6J公鼠按1：1合笼，次日清晨挑选阴栓阳性母鼠，从阴栓阳性母鼠得到单细胞受精卵；

S23.将结扎KM公鼠与正常KM母鼠按1：2合笼，选取有阴栓且阴门肿胀、红润的母鼠，即为假孕KM母鼠；

S24.将酶切回收后的线性化pCCALL2-Anton的溶液利用原核显微注射方法直接注入单细胞受精卵的雄性原核内，注射量约为1～2pL/受精卵；其中，所述pCCALL2-Anton的溶液中线性化pCCALL2-Anton载体的含量为5ng/μL。

S25.取注射后存活的受精卵移植到假孕KM母鼠的输卵管内，待KM母鼠产仔后，经PCR鉴定阳性的小鼠即为Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠。 

3、转基因小鼠的阳性检测可利用PCR的方法进行。 

（1）模板：提取转基因小鼠鼠尾DNA作为模板。提取方法按照试剂盒说明书进行操作（组织DNA提取试剂盒，sigma公司，产品号D3396-02）。 

（2）引物：上游引物：TAGACTCGTGGTGGACTT（如SEQ ID NO：2所示），下游引物：GATACATAGAGGTTCCTTGAGCAGT（如SEQ ID NO：3所示） 

（3）PCR体系和循环条件

（4）PCR扩增程序：94℃，5min；35×（94℃，30s；52℃，30s，72℃，40s）；72℃，5min；4℃保存。

（5）将上述PCR产物进行1.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳，结果如附图5所示，阳性为一条318bp的特异条带，表明OVA-HBsAg基因成功转入小鼠体内，得到OVA-HBsAg转基因小鼠首建鼠。 

4、统计结果显示，构建得到F0代小鼠29只，其中有4只为阳性，阳性率为13.8%。 

实施例2 Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的鉴定、繁育和传代扩群

OVA-HBsAg转基因小鼠首建鼠（即F0代小鼠）建成后，与C57BL/6J小鼠杂交进行传代，培育。同时对所得的子代小鼠进行PCR鉴定及HBsAg检测（Elisa法）。结果见表1。 

1、将制备成功的阳性转基因小鼠进行繁育、传代扩群。 

OVA-HBsAg转基因小鼠首建鼠建成后，与C57BL/6 J小鼠杂交进行传代，培育。同时对所得的子代小鼠进行PCR鉴定及Elisa法检测HBsAg表达。PCR条件同步骤1所述。Elisa完全按照（乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒，购于上海科华生物技术有限公司）试剂盒说明书操作。 

培养方法按照常规小鼠饲养模式进行。 

2、利用PCR的方法检测阳性转基因小鼠，方法同实施例1。 

3、利用Elisa法检测小鼠血清中HBsAg的表达，方法按照Elisa试剂盒（购自上海科华生物技术有限公司，生产许可证号：沪20110148，批准文号：国药准字S10910113，生产批号：20130312）的说明书进行。 

4、结果如表1所示，实施例1构建的Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠能够稳定传代，且小鼠血清中HBsAg均为阴性。 

表1 OVA-HBsAg转基因小鼠的鉴定（传代） 

实施例3 Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的生物学特性研究

1、本实施例将Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因母鼠与Cre公鼠杂交，鉴定和研究OVA-HBsAg转基因小鼠模型目的基因OVA及HBsAg的诱导表达，对培育的OVA-HBsAg转基因小鼠进行生物学特性研究，如HBsAg表达，肝脏病理变化，血清转氨酶变化等，了解该模型自身生物学规律，进一步认识机体免疫系统在抗乙肝病毒感染和免疫致病过程中作用机制。

具体的研究技术路线如图7所示。 

2、将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与Cre阳性公鼠(本室饲养，可表达Cre重组酶的C57BL/6J背景Alb-Cre转基因小鼠)进行杂交，杂交的方法为：将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与Cre阳性公鼠按照2：1的数量比例合笼随机交配。获得16只子代小鼠。 

3、对16只子代小鼠HBsAg基因进行PCR检测，方法同实施例2。结果有8只子代小鼠为HBsAg基因阳性，阳性率为50%。 

    将8只阳性子代小鼠进行PCR检测Cre基因的表达，PCR引物为引物F：agcgatggatttccgtctctgg（如SEQ ID NO：4所示）和引物R：agcttgcatgatctccggtattgaa（如SEQ ID NO：5所示）。 

PCR反应体系： 

PCR扩增程序：95℃，5min；30×（94℃，30s；56℃，30s，72℃，30s）；72℃，5min；4℃保存。 

将上述PCR产物进行1.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳，结果如附图6所示，阳性为一条272bp的特异条带，结果显示，8只小鼠全部为Cre阳性。 

4、用Elisa方法对上述8只阳性子代小鼠进行HBsAg及HBsAb表达的检测，Elisa方法同实施例2。 

    结果显示，有两只子代小鼠血清HBsAg检测为阳性，OD值分别为1.203和0.192。 

5、检测上述8只阳性子代小鼠的血清转氨酶变化情况。在全自动生化仪cobas c 501（购自Roche公司）上检测小鼠的血清转氨酶的变化情况，所用试剂均为与全自动生化仪cobas c 501配套使用的血清转氨酶检测试剂（购自Roche公司，试剂批号：670387-01）。 

结果显示，8只阳性子代小鼠的血清转氨酶均为正常水平。 

综上所述，根据本发明构建方法制备得到的Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠能够稳定传代，是一种新型可诱导型的、非免疫耐受的乙肝疾病模型，该模型只有在Cre重组酶的作用下，转入小鼠体内的HBsAg才能表达，因此该小鼠对于HBsAg是非耐受的，更接近临床人感染乙肝的状况，从而可以真实、全面地反映临床乙肝发生、发展过程，为进一步研究乙肝发病机制，肝脏病变的发展和转归机制研究，HBsAg感染后机体的病理改变以及机体免疫系统在抗病毒感染和免疫致病过程中的作用机制提供理想的动物模型。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国人民解放军第458医院

 

<120>  Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法

 

<130> 

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  10771

<212>  DNA

<213>  表达载体pCCALL2-Anton的全长序列

 

<400>  1

gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata     60

 

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gctggctacc ggcgatgagc gaacgcgtaa cgcgaatggt gcagcgcgat cgtaatcacc   3180

 

cgagtgtgat catctggtcg ctggggaatg aatcaggcca cggcgctaat cacgacgcgc   3240

 

tgtatcgctg gatcaaatct gtcgatcctt cccgcccggt gcagtatgaa ggcggcggag   3300

 

ccgacaccac ggccaccgat attatttgcc cgatgtacgc gcgcgtggat gaagaccagc   3360

 

ccttcccggc tgtgccgaaa tggtccatca aaaaatggct ttcgctacct ggagagacgc   3420

 

gcccgctgat cctttgcgaa tacgcccacg cgatgggtaa cagtcttggc ggtttcgcta   3480

 

aatactggca ggcgtttcgt cagtatcccc gtttacaggg cggcttcgtc tgggactggg   3540

 

tggatcagtc gctgattaaa tatgatgaaa acggcaaccc gtggtcggct tacggcggtg   3600

 

attttggcga tacgccgaac gatcgccagt tctgtatgaa cggtctggtc tttgccgacc   3660

 

gcacgccgca tccagcgctg acggaagcaa aacaccagca gcagtttttc cagttccgtt   3720

 

tatccgggca aaccatcgaa gtgaccagcg aatacctgtt ccgtcatagc gataacgagc   3780

 

tcctgcactg gatggtggcg ctggatggta agccgctggc aagcggtgaa gtgcctctgg   3840

 

atgtcgctcc acaaggtaaa cagttgattg aactgcctga actaccgcag ccggagagcg   3900

 

ccgggcaact ctggctcaca gtacgcgtag tgcaaccgaa cgcgaccgca tggtcagaag   3960

 

ccgggcacat cagcgcctgg cagcagtggc gtctggcgga aaacctcagt gtgacgctcc   4020

 

ccgccgcgtc ccacgccatc ccgcatctga ccaccagcga aatggatttt tgcatcgagc   4080

 

tgggtaataa gcgttggcaa tttaaccgcc agtcaggctt tctttcacag atgtggattg   4140

 

gcgataaaaa acaactgctg acgccgctgc gcgatcagtt cacccgtgca ccgctggata   4200

 

acgacattgg cgtaagtgaa gcgacccgca ttgaccctaa cgcctgggtc gaacgctgga   4260

 

aggcggcggg ccattaccag gccgaagcag cgttgttgca gtgcacggca gatacacttg   4320

 

ctgatgcggt gctgattacg accgctcacg cgtggcagca tcaggggaaa accttattta   4380

 

tcagccggaa aacctaccgg attgatggta gtggtcaaat ggcgattacc gttgatgttg   4440

 

aagtggcgag cgatacaccg catccggcgc ggattggcct gaactgccag ctggcgcagg   4500

 

tagcagagcg ggtaaactgg ctcggattag ggccgcaaga aaactatccc gaccgcctta   4560

 

ctgccgcctg ttttgaccgc tgggatctgc cattgtcaga catgtatacc ccgtacgtct   4620

 

tcccgagcga aaacggtctg cgctgcggga cgcgcgaatt gaattatggc ccacaccagt   4680

 

ggcgcggcga cttccagttc aacatcagcc gctacagtca acagcaactg atggaaacca   4740

 

gccatcgcca tctgctgcac gcggaagaag gcacatggct gaatatcgac ggtttccata   4800

 

tggggattgg tggcgacgac tcctggagcc cgtcagtatc ggcggaattc cagctgagcg   4860

 

ccggtcgcta ccattaccag ttggtctggt gtcaggggat cccccgggct gcagccaata   4920

 

tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg   4980

 

gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag   5040

 

cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc   5100

 

aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc   5160

 

tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg   5220

 

atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc   5280

 

ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca   5340

 

tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag   5400

 

agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg   5460

 

gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg   5520

 

gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca   5580

 

tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc   5640

 

tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg   5700

 

acgagttctt ctgaggggat caattctcta ggcttgggat ctttgtgaag gaaccttact   5760

 

tctgtggtgt gacataattg gacaaactac ctacagagat ttaaagctct aaggtaaata   5820

 

taaaattttt aagtgtataa tgtgttaaac tactgattct aattgtttgt gtattttaga   5880

 

ttcacagtcc caaggctcat ttcaggcccc tcagtcctca cagtctgttc atgatcataa   5940

 

tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc   6000

 

tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata   6060

 

atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc   6120

 

attctagttg tgtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tcataatcag   6180

 

ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac cttccccaca cctccccctg   6240

 

aactgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg   6300

 

gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt   6360

 

ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc ataatcagcc   6420

 

ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc   6480

 

tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt   6540

 

acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta   6600

 

gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggatccac tagttctagc   6660

 

tagtctaggt cgatgcagga taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatagatctt   6720

 

gggtacctca ggccatgcag tggaattccg agagcctgaa gatatctcaa gctgtccatg   6780

 

cagcacatgc agaaatcaat gaagcaggca gagagcagct ggagagtata atcaactttg   6840

 

aaaaactgac tgaatggacc cagtggaatt ccacaacctt ccaccaaact ctgcaagatc   6900

 

ccagagtgag aggcctgtat ttccctgctg gtggctccag ttcaggaaca gtaaaccctg   6960

 

ttctgactac tgcctctccc ttatcgtcaa tcttctcgag gattggggac cctgcgctga   7020

 

acatggagaa catcacatca ggattcctag gaccccttct cgtgttacag gcggggtttt   7080

 

tcttgttgac aagaatcctc acaataccgc agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca   7140

 

attttctagg gggaactacc gtgtgtcttg gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc   7200

 

actcaccaac ctcttgtcct ccaacttgtc ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt   7260

 

ttatcatctt cctcttcatc ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggact   7320

 

atcaaggtat gttgcccgtt tgtcctctaa ttccaggatc ctcaacaacc agcacgggac   7380

 

catgccggac ctgcatgact actgctcaag gaacctctat gtatccctcc tgttgctgta   7440

 

ccaaaccttc ggacggaaat tgcacctgta ttcccatccc atcatcctgg gctttcggaa   7500

 

aattcctatg ggagtgggcc tcagcccgtt tctcctggct cagtttacta gtgccatttg   7560

 

ttcagtggtt cgtagggctt tcccccactg tttggctttc agttatatgg atgatgtggt   7620

 

attgggggcc aagtctgtac agcatcttga gtcccttttt accgctgtta ccaattttct   7680

 

tttgtctttg ggtatacatt taaaccctaa caaaacaaag agatggggtt actctctaaa   7740

 

ttttatgggt tatgtcattg gatgttatgg gtccttgcca caaggcggcc gcgatctttt   7800

 

tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta   7860

 

ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg   7920

 

aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat gagtatttgg tttagagttt   7980

 

ggcaacatat gccatatgct ggctgccatg aacaaaggtg gctataaaga ggtcatcagt   8040

 

atatgaaaca gccccctgct gtccattcct tattccatag aaaagccttg acttgaggtt   8100

 

agattttttt tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt aacatcccta aaattttcct   8160

 

tacatgtttt actagccaga tttttcctcc tctcctgact actcccagtc atagctgtcc   8220

 

ctcttctctt atgaagatcc ctcgacctgc agcccaagct tggcgtaatc atggtcatag   8280

 

ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc   8340

 

ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc   8400

 

tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc ggatccgcat ctcaattagt   8460

 

cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg   8520

 

cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct   8580

 

cggcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca   8640

 

aaaagctaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa   8700

 

tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa   8760

 

tgtatcttat catgtctgga tccgctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc   8820

 

ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt   8880

 

cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca   8940

 

ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa   9000

 

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat   9060

 

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc   9120

 

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc   9180

 

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt   9240

 

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac   9300

 

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg   9360

 

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca   9420

 

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc   9480

 

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accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa   9600

 

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac   9660

 

tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta   9720

 

aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt   9780

 

taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata   9840

 

gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc   9900

 

agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac   9960

 

cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag  10020

 

tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac  10080

 

gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc  10140

 

agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg  10200

 

gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc  10260

 

atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct  10320

 

gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc  10380

 

tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc  10440

 

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agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc  10560

 

gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca  10620

 

cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt  10680

 

tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt  10740

 

ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct g                                 10771

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  上游引物

 

<400>  2

tagactcgtg gtggactt                                                   18

 

 

<210>  3

<211>  25

<212>  DNA

<213>  下游引物

 

<400>  3

gatacataga ggttccttga gcagt                                           25

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  引物F

 

<400>  4

agcgatggat ttccgtctct gg                                              22

 

 

<210>  5

<211>  25

<212>  DNA

<213>  引物R

 

<400>  5

agcttgcatg atctccggta ttgaa                                           25