PFP基因在控制水稻苗期耐热性中的应用

摘要

一种提高水稻苗期耐热性的基因PFP在水稻苗期耐热性遗传改良中的应用，通过对水稻苗期耐热相关基因PFP进行克隆，构建该基因的过表达载体，并通过基因枪法获得转基因阳性植株，转基因植株与对照相比，苗期耐热性得到提高。本发明的编码基因对提高水稻耐热性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义。对数个代表性地方水稻品种的耐热表型和耐热基因PFP基因型的相关性分析表明，该基因的基因型与品种的耐热表型存在显著相关性。进一步研究还表明，耐热基因PFP在盐和低温胁迫下基因表达上调，在PEG干旱胁迫条件下基因表达下调。为深入分析该基因的功能、表达奠定了基础，为阐明水稻耐热的遗传调控网络提供了支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及水稻基因工程技术领域，具体涉及通过克隆及功能验证得到一 种与水稻苗期耐热性相关的基因PFP在水稻苗期耐热性遗传改良中的应用。

背景技术

植物生长过程中经常会遭受高温、干旱等各种逆境的胁迫，在很大程度上 降低其产量并限制其种植区域。随着全球环境的变化加剧和人口的增长，对粮 食的需求的压力越来越大，迫切需要培育在各种逆境下生长的作物。随着分子 生物学技术的发展，对植物适应逆境机制的研究从生理水平步入分子水平，研 究的目的不仅在于从分子水平上解释植物适应逆境的机制，而且希望获得各种 抗逆基因，用于作物的遗传工程抗逆育种。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。日本和国际水稻所较早地开展了耐热 水稻品种选育的研究。日本学者Satake等曾进行过耐热品种的筛选以及耐热性的 数量遗传分析，发现水稻对高温的耐性具有品种特异性；我国学者徐云碧等也报 道不同品种耐热性差异较大。这些研究表明，遗传因素是决定水稻品种间耐热性 差异的主要原因。近年来，随着分子标记技术的发展和广泛应用，出现了一些利 用分子标记对水稻耐热性进行数量性状基因座(Quantitative trait loci，QTL) 定位研究的报道。

随着全球气候的变暖，水稻耐热相关基因的挖掘和耐热水稻品种选育已成为 水稻遗传育种方向的重要课题。但是，目前鲜有关于水稻耐热基因克隆及其在水 稻育种中应用的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高水稻苗期耐热性的基因PFP在水稻苗期耐 热性遗传改良中的应用。申请人利用基因芯片，对热敏感的野生稻渗入系 YIL106和耐热的轮回亲本特青在高温处理后的基因表达谱进行分析，结合QTL 定位结果和生物信息学方法，利用野生稻渗入系群体对QTL定位区域内的差异 表达基因进行分析和验证，筛选出与水稻苗期耐热性相关的基因 LOC_Os01g19020，该基因属于过氧化物酶家族类(Peroxidase family protein) 基因，命名为PFP，该基因的CDS核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，序 列长度为1044bp，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，氨基酸序列 为347个。

本发明对控制水稻苗期耐热基因PFP进行克隆，将其编码区构建过表达载 体，并通过基因枪法导入水稻苗细胞、组织或器官，获得转基因植株。对转基 因植株的表型检测表明，其苗期耐热在一定程度上得到提高，本发明克隆的水稻 苗期耐热基因为水稻耐热品种选育提供了新的基因资源。

以下将对本发明作进一步说明。

附图说明

图1是PFP基因在YIL106与特青中基因编码蛋白比较图，下划线处表示 两者之间的编码蛋白差异。

图2是本发明的PFP基因的过表达载体酶切验证电泳图。

其中：0为Marker；1-2为Kpn和Spe Ⅰ双酶切，为阳性克隆。

图3是利用潮霉素引物序列进行PCR筛选PFP转基因植株的电泳图。

其中：0为Marker；1-9为阳性转化植株；10-12为水，阴性对照。

图4是本发明的转基因植株和对照中花17高温处理后的表型比较图。

其中：A为中花17，B为转基因植株。

图5是PFP基因分别受NaCl、4℃低温、PEG和ABA处理后的表达情况。

其中，A表示NaCl，B表示4℃低温，C表示PEG，D表示ABA。

具体实施方式

1.实验材料

野生稻热敏感渗入系YIL106(PFP基因型同野生稻)、耐热轮回亲本特青、 77个地方水稻品种。实验中所用的各种限制性内切酶、T₄DNA连接酶、Taq Plus 酶等购自TAKARA公司，PCR所使用的PCR Buffer、dNTP、TRIzol RNA提取试剂 盒、大肠杆菌(E.coli)TOP10购自天根生物工程公司，反转录酶购自六合 通公司，基因芯片实验中所用试剂盒购自Qiagen公司，实验中所使用的各种引 物由北京奥科生物技术公司合成，各种序列分析由北京六合华大基因科技公司 进行测序。

2.PFP基因序列及耐热相关性分析

PFP基因序列的扩增和测序分析

为了获得PFP基因序列全长编码序列并验证PFP基因在野生稻热敏感渗入 系YIL106和耐热轮回亲本特青之间的基因组水平上是否存在差异，首先依据已 公布的日本晴和9311的DNA序列设计引物：正向引物为 5′-GGCGGATCCATGAGGCTGTCGGTGGCCATCC-3′(见SEQ ID No.3)，反向引物为 5′-GGCGGTACCTTAGTACAAGTGGTTGATGGCG-3′(见SEQ ID No.4)，以YIL106和 特青两个材料的苗期cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系共20μl：2μl模 板、0.2μl Taq plus(2.5U/μl)、2μl Taq plus buffer(2x)、1μl dNTPs (2.5mM)、2μl primer、12.8μl ddH₂O；扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃ 30s，72℃1min，35cycles；72℃延伸10min。

PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并送北京六合华大基因科技公司 对基因组测序和Blast分析。结果表明，热敏感渗入系YIL106和耐热亲本特青 扩增产物长均为1044bp，但两者存在一个编码蛋白差异(见图1)。

PFP基因与耐热性相关分析

选取77个代表性地方水稻品种进行了苗期耐热性鉴定，种子用3％的次氯酸 钠消毒20min，清洗后，室温浸种2d，30℃催芽2d，将出芽整齐的种子播种于 管底剪去的96孔PCR塑料板，放到装有Yoshida培养液的塑料盒子中培养，置 于光照培养箱中培养，隔天换取营养液，培养条件为12h光照(28℃)/12h黑 暗(26℃)，湿度70％。42℃处理两叶一心幼苗，记录各品种的耐热表型，选取 表型非常确定的17个品种为热敏感品种(S)，16个品种为耐热品种(R)。对 这33个表型非常确定的品种分别提取基因组DNA，对目的基因PFP进行PCR扩 增(引物和PCR程序、条件同上)、测序。结果发现，在耐热品种中这两个基 因的序列大部分同特青相同，而热敏感品种的基因序列大部分与YIL106一致。 通过对这33个水稻品种的耐热表型和基因型的相关性分析发现PFP基因与苗期 耐热性存在显著相关性相关系数R值为0.610。

3.PFP基因目的片段的扩增

从YIL106cDNA模板中扩增出带有酶切位点的目标基因的CDS序列。用 qRT-PCR的方法扩增目标基因，RT-PCR条件为：94℃5min，94℃30s，58℃30s， 72℃45s，35cycles，72℃延伸10min；反应体系为10μl，包括：4μl cDNA模板 (2ng/μl)、5μl SYBR Green I(1000x)及1μl4mM引物。并在PCR引物中引入 合适的限制性内切酶Kpn Ⅰ和Spe Ⅰ酶切位点，引物序列：正向引物为 5′-GGCGGATCCATGAGGCTGTCGGTGGCCATCC-3′(见SEQ ID No.5)、反向引物为 5′-GGCGGTACCTTAGTACAAGTGGTTGATGGCG-3′(见SEQ ID No.6)，从YIL106的cDNA 模板中扩增出带有酶切位点的目标基因的CDS序列。

4.PFP基因过量表达载体的构建和遗传转化

酶切上步骤中PCR产物，酶切反应体系如下：目的片段10μl、 10×Buffer2μl、限制性内切酶Kpn Ⅰ和Spe Ⅰ各1μl，将该体系补水至20μl， 37℃过夜。紫外灯下割取目标长度的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)。 回收后连接到PMD18-T克隆载体上，通用引物M13测序，挑选序列完全正确的 克隆，酶切回收。

为了提高目的基因在中花17中的表达，本研究特选用强启动子——super 35S promotor来调控候选基因在转基因水稻中的表达。目的片段的酶切回收后 (见图2)，进行回收的目标片段与过表达载体pCAMBIA1301连接。目的片段和 载体比例为9:1，首先9ul目的片段和1ul载体混合，55℃放置5min，然后加入10ul 高效连接酶solutionI，16℃反应40min，然后转化，连接产物的转化采用热激 转化法，具体操作如下：从-80℃冰箱中取出所需感受态细胞(TOP10)，置冰上 缓缓解冻；超净工作台上将感受态细胞均匀分到灭菌的离心管中(每管50μl)， 并加入连结产物10μl，轻轻摇匀，冰上静置30min；42℃水浴热激90s，迅速置 冰上2min；于超净工作台上向离心管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp)，混 匀后37℃振荡培养45min(220rpm)；室温下4000g离心2min，弃掉900μl上清 液，将剩余上清液重新悬浮菌体，加入40μl X-gal和16μl IPTG，混匀，用涂 布器将其均匀涂到LB固体培养基平板上(含Amp)，放置30min；倒置平板于37℃ 恒温箱中培养过夜。

提取过表达载体pCAMBIA1301-Ubi质粒，采用基因枪转化法转化到粳稻受 体材料品种“中花17”，其中基因枪转化采用Bio-Rad公司生产的PDS-1000/He 基因枪，打枪后先将愈伤组织在不含筛选剂的培养基中恢复生长一周，再转入 含50mg/L潮霉素的继代培养基中筛选30d左右，挑取抗性突起，再在含50mg/L 潮霉素的继代培养基中筛选30d左右，在预分化培养基(50mg/L潮霉素)光照 培养20d左右，在分化培养基中(50mg/L潮霉素)中分化，最后在含50mg/L潮 霉素的壮苗培养基中(三角瓶)继续筛选30d左右，再转到含壮苗培养基的试管 中培养30-40d，然后移栽到土壤。

5.转PFP基因植株检测和表型分析

采用PCR扩增潮霉素抗性基因(HYG)片段，检测阳性转基因植株。抗性 基因(HYG)检测引物为：HYG-F5′-TACTTCTACACAGCCATC-3′(见SEQ ID No.7) 和HYG-R5′-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3′(见SEQ ID No.8)，得到9株阳性转基因 植株(见图3)，并获得T₁代植株。

转PFP基因植株和对照中花17植株长至两叶一心时进行42℃高温处理，观 察耐热表型。由图4可以看出，高温处理后中花17第二和第三片叶一半以上叶 片枯黄，而转基因植株第二和第三片叶只有叶尖枯黄，大部分叶片仍持绿色。 可以看出，PFP基因超表达植株与对照中花17相比耐热性增强。但转基因植株 的每个系的耐热表型均存在一定程度的分离。

6.PFP基因受NaCl、低温、PEG和ABA胁迫处理表达情况分析

为了研究PFP基因是否受盐胁迫(NaCl)、低温、干旱(PEG)、和ABA胁迫 的诱导，本研究分别用200mM NaCl、4℃低温、30％PEG和100μM ABA处理YIL106 和特青两叶一心期的幼苗，处理0h、1h、8h和24h时取样，提取RNA反转录后 进行了RT-PCR分析(引物序列：HYG-F5′-AGTCCTGCTGGACAAGTCGT-3′(见SEQ  ID No.9)和HYG-R5′-TAGATGAGGATGTCGGAGCA-3′(见SEQ ID No.10))。叶 片总RNA提取方法参考Sambrook等的方法，选用水稻的18S基因作为内标基 因(引物序列为18S-F5′-GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3′(见SEQ ID No.11)和 18S-R5′-GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3′(见SEQ ID No.12))进行PCR扩增。 反应体系为10μl，包括：4μl cDNA模板(2ng/μl)、5μl SYBR Green I(1000x) 及1μl4mM引物。扩增程序如下(利用MJ检测系统)：94℃5min；94℃15s， 58℃15s，72℃20s，read plate85℃1s，40cycles；72℃5min；65℃-95℃ 每隔0.3℃作熔解曲线。手工设定荧光阈值，确定特定荧光阈值下各样品的Ct 值，采用2^-ΔΔCt计算方法分析不同样品间相对表达量的高低。

根据定量PCR结果，由图5可以看出，经NaCl处理后，PFP基因在特青中 的表达量与未处理时相比，在处理1h时显著上升，随后下降，基因在YIL106 中的表达量相对较低；低温处理后，该基因在YIL106的表达量变化不大，在特 青中的表达量略有上升；4℃处理后的表达量下降；ABA处理24h后上调明显。 可见，PFP基因受盐和低温处理上调表达，受PEG处理下调表达。

本发明克隆了水稻苗期耐热相关基因PFP，构建了该基因的过表达载体，获 得了转基因的后代，对转基因植株的表型检测表明其苗期耐热在一定程度上得到 提高。进一步研究还表明，耐热基因PFP在盐和低温胁迫下基因表达上调，在 PEG干旱胁迫条件基因表达下调。这为深入分析该基因的功能、表达奠定了基础， 为阐明水稻耐热的遗传调控网络提供了支撑。