MiR-424-5p在抑制转移性肝癌中的应用

摘要

本发明公开了MiR-424-5p在制备抑制转移性肝癌的药物中的应用，具体应用时，可以将miR-424-5p或其类似物制备成治疗肝癌转移的药物，也可以构建miR-424-5p的真核表达载体，用于基因治疗。本发明通过研究发现miR-424-5p是在转移性肝癌细胞中下调最明显的microRNA之一。进一步地研究结果表明肝癌细胞转染miR-424-5p后细胞侵袭力、转移力和克隆形成能力均减弱。因此，可以认为，miR-424-5p可以抑制肝癌细胞的转移，并降低肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗，具有引起肝癌细胞细胞周期阻滞、抑制肝癌细胞增殖、侵袭、转移和克隆形成能力等作用。因此，miR-424-5p可以用于制备抑制转移性肝癌的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及MiR-424-5p在抑制转移性肝癌中的应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。肝细胞性肝癌(hepatocelluar carcinoma，HCC) 是肝癌最主要的病理类型，占原发性肝癌的80％左右，在我国占到了90％。肝细胞肝癌发病率 死亡率居高不下，具高转移性。肿瘤的转移是一个多步骤、多因素的复杂过程，肝癌的高转 移性是其高致死率的重要原因。而抵抗失巢凋亡，是肝癌细胞进行转移的首要条件。

大多数细胞的增殖取决于两个信号：第一，细胞需要确定它们被适当地定位在组织内, 通过表面受体感知细胞外基质并使之与细胞骨架相连，这一行为激活许多信号级联反应并且 影响细胞对其他刺激的反应；第二，细胞需要生长因子和细胞因子促进增殖。对这两个信号 的精确调节确保所有器官正常发育。正常情况下，当细胞失去正常细胞基质间相互作用，细 胞周期会发生阻滞并且引发caspase介导的细胞程序性死亡，称为失巢凋亡。失巢凋亡使得 发生“错位”的细胞被消除，从而防止异位增生。当细胞发生恶性转化时，能够通过其它渠 道获得迁徙和增殖特性，并发生对失巢凋亡的抵抗，从而导致转化细胞在异位的恶性增生， 即形成转移癌。

失巢凋亡能够作为肝癌转移过程中的一个筛选压力。能够抵抗失巢凋亡的肝癌细胞，其 侵袭力、转移力、抵抗放疗、化疗和凋亡诱导治疗的能力都大大增强。因此，肝癌细胞能够 通过抵抗失巢凋亡，获得在循环系统存在的能力，并通过逃逸肿瘤治疗，获得机会到达异位， 形成转移癌。因此，获得抵抗失巢凋亡能力的肝癌细胞，是一类具有强大侵袭转移力的转移 性肝癌细胞。

miRNA是一类内源性的、不参与蛋白质编码的小RNA分子，其长度大约有18-25个核苷 酸。miRNA前体，经酶切割为成熟miRNA。后者与相关蛋白一起组成RNA-诱导沉默复合体 (RISC)，调控其靶基因的表达。miRNA调控靶基因的方式有两种：与靶基因mRNA的3’UTR 结合导致其降解；与靶基因mRNA3’UTR结合抑制其翻译。在植物中比较普遍的沉默机制中， miRNA和靶基因mRNA几乎完全配对时，诱导其降解。然而大多数哺乳动物是通过不完全的配 对结合，从而在转录后水平抑制基因翻译。除此之外，miRNA还可通过促进靶mRNA polyA尾 的去除，mRNA快速脱腺苷酸化促进了其被3`核酸外切酶水解。人类的microRNA由2％的基因 编码，却能调控人体约30％的基因。多种miRNA已被报道在肿瘤发生中参与调节相关基因的 表达。非编码小RNA在调控EMT的细胞信号通路中具有重要作用。例如miR-200和miR-205 抑制ZEB1和ZEB2，后者调控E-cadherin的表达，由此维持上皮细胞的表型。

鉴于miRNA在癌症发生发展的重要作用，我们在前期建立的肝癌失巢模型中，进行了 microRNA差异表达谱的分析，miR-424-5p是在转移性肝癌细胞中下调最明显的microRNA之 一。已有研究证明miR-424-5p可以调控众多生物学行为，包括细胞分化增殖，细胞周期。有 相关报道证明miR-424-5p在一些癌症中表达异常。这些资料证明miR-424-5p在癌症恶性行 为中的重要作用，但是对于miR-424-5p在肝癌中的作用机制还未有报道，对其靶基因的研究 也仅限于少数基因。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了miR-424-5p的新用途——在制备抑制转移性肝癌的药 物中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明建立了肝癌失巢模型，并获得了能够抵抗失巢凋亡和具备强侵袭转移力的转移性 肝癌细胞。通过进行microRNA差异表达谱的分析，发现miR-424-5p是在转移性肝癌细胞中 下调最明显的microRNA之一。进一步地，本发明构建了miR-424-5p的表达载体，转染肝癌 细胞，结果表明肝癌细胞转染miR-424-5p后细胞增殖能力减弱。因此，可以认为，miR-424-5p 可以抑制肝癌细胞的转移，并降低肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗，具有引起肝癌细胞细胞周期 阻滞、抑制肝癌细胞增殖、克隆形成能力等作用。因此，miR-424-5p可以用于制备抑制转移 性肝癌的药物。

所述miR-424-5p的序列为CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA，如SEQ ID NO.1所示；其特异性 扩增引物序列如下：特异性的上游引物序列为：GGCAGCAGCAATTCATG，如SEQ ID NO.2所示； 通用下游引物序列为：CAGTGCGTGTCGTGGAG，如SEQ ID NO.3所示。

所述miR-424-5p可以作为药物进行应用，也可以用于制备药物。具体应用时，可以将 miR-424-5p或其类似物制备成治疗肝癌转移的药物，也可以构建miR-424-5p的真核表达载 体，用于基因治疗。

附图说明

图1：Real-time PCR检测肝癌细胞系BEL7402、SMMC7721、HepG2在失巢前后miR-424-5p 表达差异，以U6为内参。*为P＜0.05，**为P＜0.01。其中，图1A：BEL7402；图1B：SMMC7721； 图1C：HepG2。

图2：miR-3126-5p在肝癌细胞成功过表达。其中图A-C：BEL7402(图A)、SMMC7721(图 B)、HepG2(图C)分别转染miR-424-5 pmimic，24h后收集细胞总RNA，逆转录后Real-time  PCR检测miR-424-5p表达。*为P＜0.05，**为P＜0.01。

图3：miR-424-5p转染后24h后，置于poly-HEMA铺被的培养板中继续培养，检测caspase3 诱导的转移性肝癌细胞的凋亡状况。图A：Western blot检测肝癌细胞系HepG2，SMMC7721 转染miR-424-5p前后caspase3活化情况。图B：caspase3检测试剂盒检测到miR-424-5p促 进caspase3的活化。**为P＜0.01。

图4：Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测miR-424-5p诱导的转移性肝癌细胞凋亡。 BEL7402，HepG2分别转染miR-424-5p24h后置poly-HEMA板中继续培养24h。收集细胞， Annexin V-FITC/PI双染，上机检测。图4A、B分别为转染了miR-NC和miR-424-5p的转移 性BEL7402细胞的流式细胞术检测结果，图4C、D分别为转染了miR-NC和miR-424-5p的转 移性HepG2细胞的流式细胞术检测结果，图4E为BEL7402细胞凋亡率比较的柱形图，图4F 为HepG2细胞凋亡率比较的柱形图。*为P＜0.05，**为P＜0.01。

图5：肝癌细胞株BEL7402，SMMC7721，HepG2，分别转染miR-424-5p mimic以及阴性对 照miR-c，其中，A：BEL7402；B：SMMC7721；C：HepG2。24h后置poly-HEMA培养板中继续 培养24h。收集细胞胰酶消化计数，以1000/小室密度种到铺有Matrigel基质胶的transwell 小室中，过夜(16h)。计数穿过小室基底膜的细胞数。结果以柱状图给出。*为P＜0.05，** 为P＜0.01，***P＜0.001。

图6：肝癌细胞株BEL7402，SMMC7721，HepG2，分别转染miR-424-5p mimic以及阴性对 照miR-c。其中，A：BEL7402；B：SMMC7721；C：HepG2。24h后置poly-HEMA培养板中继续 培养24h。收集细胞胰酶消化计数，以1000/孔密度种到六孔板中，培养7-10天。计数大于 50个细胞的克隆数。结果以柱状图给出。***P＜0.001。

图7：HepG2细胞分别转染miR-424-5p mimic及inhibitor，收集细胞总RNA，real-time  PCR检测ICAT的表达。**为P＜0.01，***为P＜0.001。

图8：向BEL7402、SMMC7721、HepG2中分别转染miR-424-5p mimic以及阴性对照(miR-c) 24h后收集细胞蛋白，western blot检测ICAT表达(图8A)。以β-actin为内参基因，用柱 形图表示相对阴性对照组ICAT的表达量，图8B：BEL7402,8C:SMMC7721,8D：HepG2。*为P ＜0.05，**为P＜0.01。

图9：构建pmiR-GL0-ICAT-3’UTR的野生型和突变型报告基因载体。图9A：示意图中标 出miR-424-5p与ICAT3’UTR的结合位点以及突变位点。图9B：MiR-424-5p与野生型及突 变体共转染，24h后洗涤并裂解细胞20min，测定荧光素酶的活性。内参照质粒pRL-TK携带 的海肾荧光素酶激发底物所释放荧光的数值为Ml,pGL3-p50-3'UTR携带的萤火虫荧光素酶激 发底物所释放荧光为M2。计算每一样品的数值M2/M1,即为该组细胞所得的焚光素酶的相对活 性。***为P＜0.001。

图10：向HepG2细胞中转染ICAT小干扰，western blot检测ICAT蛋白表达，以β-actin 为内参基因。

图11：向肝癌细胞株HepG2中转入ICAT小干扰，收集总RNA，real-time PCR检测EMT 相关基因的mRNA水平。图A：β-catenin,图B：N-cadherin,图C：Snail，图D:Vimentin. 以β-actin为内参基因。*为P＜0.05。

图12：向细胞中转染ICAT表达载体,剂量依次为0μg，1μg，2μg，4μg。细胞蛋白用 IP buffer裂解后与β-catenin一抗4℃结合一个小时后，加琼脂糖珠子4℃结合过夜，第二 天离心珠子收集蛋白，western blot检测洗脱下的蛋白。

图13：将肝癌细胞株HepG2分为四组，分别①转染miR-424-5p，②转染ICAT表达载体， ③先转染miR-424-5p,24h后转染ICAT表达载体以及④空白对照。收集蛋白，western blot 检测蛋白表达(图A)。柱形图表示相对表达，β-actin为内参基因(图B)。*为P＜0.05， **为P＜0.01，***为P＜0.001。

图14：肝癌细胞株BEL7402，SMMC7721，HepG2，分别转染miR-424-5p mimic阴性对照 miR-NC，抑制子inhibitor，si-ICAT。收集细胞胰酶消化计数，以1000/小室密度种到铺有 Matrigel基质胶的transwell小室中，过夜(16h)(图A)。计数穿过小室基底膜的细胞数。 结果以柱状图给出(图B)。*为P＜0.05，**为P＜0.01。

图15：miR-424-5p在临床肝癌组织中的表达状况。A.Trizol提取肝癌患者癌组织和癌 旁组织的总RNA，逆转录后Real-time PCR检测miR-424-5p的表达。B.根据临床样本资料， 将肝癌病人分为转移(M)和原位(H)两组。C.HC为健康对照，T为癌组织，NT为癌旁组 织。统计分析方法采用Mann-Whitney U检验，由prism软件完成。*为P＜0.05，**为P＜0.01， ***为P＜0.001。

图16：ICAT与miR-424-5p相关性分析，以上四个图分别为在癌组织(图A)、癌旁组织 (图B)、转移性肝癌组织(图C)、原位癌组织(图D)中的表达分析。采用spearman分析 方法，R为相关系数，负数为负相关，P小于0.05有统计意义。

图17：miR-424-5p在临床转移性肝癌、肝癌患者及健康对照的血清中的表达状况。A. 血清中miR-424-5p在原位癌患者外周血清(H)，转移性肝癌患者外周血清(M)，健康对照外 周血血清(N)。*为P＜0.05，***为P＜0.001。B.miR-424-5p在肝癌患者组织和外周血清中 表达相关性分析，spearman R为相关系数，为正相关，P＝0.0433有统计意义。

表1：临床肝癌病人中miR-424-5p的表达与病人临床检测指标之间的相关性。

表2：临床肝癌病人血清miR-424-5p的表达与病人临床指标之间的相关性。

具体实施方式

本发明发现miR-424-5p在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中显著下调。将对数期的肝癌细胞 BEL7402，SMMC7721，HepG2分别经贴壁和脱离基质附着培养24h，得到贴壁生长和脱离附着 的失巢状态的肝癌细胞。通过real-time PCR检测两种状态下肝癌细胞中miR-424-5p的表 达。检测结果证实了芯片结果，即miR-424-5p在脱离附着的肝癌细胞中的表达显著性下调(图 1)。

本发明为获得高效表达，分别合成了miR-424-5p mimics和miR-424-5p inhibitor。其 中，miR-424-5p mimic,inhibitor以及阴性对照序列如下：

MiR-424-5p mimics：CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA，如SEQ ID NO.4所示；

CAAAACAUGAAUUGCUGCUGUU，如SEQ ID NO.5所示；

MiR-424-5p inhibitor：UUCAAAACAUGAAUUGCUGCUG，如SEQ ID NO.6所示；

microRNA negative control：UUCUCCGAACGUGUCACGU，如SEQ ID NO.7所示；

ACGUGACACGUUCGGAGAA，如SEQ ID NO.8所示；

MicroRNA inhibitorN.C：CAGUACUUUUGUGUAGUACAA，如SEQ ID NO.9所示。

选择三个肝癌细胞株BEL7402，SMMC-7721和HepG2细胞，贴壁培养24h后分别转染 miR-424-5p mimics和表达载体，转染4-6h后换液,继续培养24h，收集总RNA，microRNA检 测试剂盒检测miR-424-5p的表达。转染miR-424-5p mimic组，miR-424-5p表达效率较高， 在肝癌细胞中平均上调30倍以上(图2)，因此采用该miR-424-5p mimic进行后续的过表达 实验。

选择肝癌细胞株HepG2，BEL7402，转染miR-424-5p mimics。转染24h后消化细胞，置 poly-HEMA培养板中继续培养24h。收集失巢后的转移性肝癌细胞，用移液器轻轻吹开细胞团 成单个细胞，1000rpm4℃离心5min，预冷PBS冲洗3遍，进行AnnexinV-FITC染色，上机 后检测凋亡细胞，结果如图4所示，转染miR-424-5p的细胞凋亡率显著增加。

前期研究表明，抵抗失巢凋亡的肝癌细胞获得了更高的侵袭能力，本发明进一步研究这 种高侵袭力的获得是否与miR-424-5p下调有关。为此选择SMMC7721，BEL7402，HepG2细胞 株，并转染miR-424-5p mimics，转染24h后置poly-HEMA培养板中24h，胰酶消化离心后计 数加入铺有matrigel胶的transwell小室，16h后结晶紫染色，观察穿过小室膜的细胞数。 结果表明转染miR-424-5p后穿过小室的细胞减少，细胞侵袭力下降(图5)。

克隆形成能力是体外检测肿瘤细胞增殖能力和致瘤性的常规方法。选择肝癌细胞株 BEL7402，SMMC-7721，HepG2，分别转染miR-424-5p mimics，转染后24h置poly-HEMA培养 板中培养24h，消化计数后以1000个细胞/孔种在六孔板中。7-10天计数单个细胞形成的大 于50个细胞的克隆数。结果表明转染miR-424-5p的肝癌细胞克隆形成能力下降(图6)。

用miR-424-5p对肝癌细胞进行转染，结果显示miR-424-5p能够下调ICAT在肝癌细胞中 的表达(图8)。报告基因分析显示，ICAT是miR-424-5p的直接靶基因(图9)。进一步的细 胞实验显示，miR-424-5p能够促进E-cadherin和β-catenin复合物的形成，促进细胞粘附， 抑制间质细胞蛋白的表达；而ICAT的作用则相反，表现为促进细胞的侵袭转移，提示 miR-424-5p通过靶向ICAT对肝癌细胞发挥效应(图11-14)。

通过检测人肝癌组织和正常肝组织中microRNA的表达水平，发现与正常肝组织相比， miR-424-5p在癌组织中表达下调，见图15，相关性分析也显示miR-424-5p的表达水平与肝 癌的进展和转移呈显著性负相关(表1)。

本发明依据病人的转移状况将其分为转移组和非转移组，在两组病人中对miR-424-5p的 表达进行了检测，并对其与临床指标的相关性进行了分析。结果显示，miR-424-5p在转移患 者中的表达相对下调(图15)，与肝癌临床指标的相关性分析显示在疾病进展期、以及预后 较差的患者中，miR-424-5p的表达显著性下调(表1)，提示其表达失调参与了肝癌的转移和 疾病进程。miR-424-5p与ICAT在肝癌中的表达水平呈负相关，临床标本中的检测进一步说 明ICAT是miR-424-5p的直接靶基因(图16)。

在临床诊断中，血清检测作为无创诊断具有很大的优势，microRNA等小分子在外周血血 清中的表达往往与肿瘤发展密切相关。根据以上结果提示miR-424-5p在肝癌中发挥抑癌作 用。为了进一步判断miR-424-5p在肝癌中的诊断以及治疗意义，在这一部分中引入对肝癌病 人血清中miR-424-5p表达的检测。

收集的病人血清62例，详细病人信息及miR-424-5p与临床指标的相关性见表2。由表2 可见，肝癌病人血清miR-424-5p的表达与其临床分期及病理分级呈负相关，与癌细胞的转移 呈负相关。

利用real-time PCR分别检测正常人，原位癌患者以及转移癌患者血清中miR-424-5p的 表达，应用2^-△△Ct公式计算得到miR-424-5p的相对表达量。应用graphpad prism软件分析， 对不同分组miR-424-5p的表达进行U检验，结果如图17A。结果显示miR-424-5p在正常人 外周血清中表达水平最高，在转移癌患者外周血清中表达水平最低。对比分析miR-424-5p在 血清和组织中的表达，虽然例数较少但可以看出两者呈正相关的趋势(图17B)。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

所涉及的试剂、方法等，若无特别说明，均为本领域常规试剂、方法。

实施例1细胞株及培养条件

BEL7402、HepG2和SMMC7721细胞系均为人肝癌细胞系，购自中国科学院上海细胞生物 研究所，引进后在本实验室长期培养。以RPMI1640+10％FBS，37℃、5％CO₂，95％空气，饱和湿 度条件下进行培养。

实施例2肝癌患者手术标本和血清标本的收集

收集2012年4月至2013年11月间，在山东省立医院肝胆外科行肝癌根治性手术的50 例患者切除标本及癌旁组织作为肝癌组织标本和癌旁对着。所有患者术前未接受过放化疗等 抗肿瘤治疗。标本取材后立即放入4％甲醛溶液中进行组织固定。所有组织标本的病理学特征 均经病理检查确认。50例患者的一般临床特征(见表1)。收集2012年4月至2013年11月间， 在山东省立医院诊断为肝癌的患者血清标本62例，详细病人信息及miR-424-5p与临床指标 的相关性见表2。

实施例3失巢细胞模型的建立

(1)用20mL95％的乙醇溶解2.4gPoly-HEMA粉末，65℃振荡混匀8h以上，制备成 Poly-HEMA储存液，于4℃密封保存。用时用95％的乙醇稀释成工作液，在无菌条件下将工 作液沿孔壁轻轻加入培养板孔的底部至覆盖整个孔底，紫外线照射过夜，4℃保存，用前在 紫外灯下照射0.5h，并用无菌PBS洗涤3遍。

(2)BEL7402和SMMC7721细胞系以RPMll640加10％胎牛血清为培养液，在37℃、5％ C02条件下培养至对数生长期，O.25％的胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调整好浓度后，加入 Poly-HEMA培养板中继续培养24h，得到失巢细胞模型。

实施例4细胞的转染

(1)转染前一天，胰酶消化预转染的细胞，调整细胞浓度为2x10⁵个/孔接种于6孔培养 板中，置于37℃，5％CO₂培养箱培养。

(2)16-20h后，细胞密度达到80％，将板内完全培养基换成opti-MEM培养液。

(3)取5μl的miR-424-5p mimics或miR-control稀释于250μl opti-MEM培养基中。

(4)取10μl Lipofectamine2000脂质体稀释于250μl opti-MEM培养基中。

(5)将稀释好的脂质体与miR混合，室温孵育25min。

(6)将miR脂质体混合液按每孔500ml/孔加到6孔板中，轻轻摇动混匀。

(7)37℃，5％CO2培养箱中培养6h后，更换为完全培养基继续培养。

实施例5microRNA的表达的分析

1.细胞/组织总RNA的提取

按TRIzol(Invitrogen)试剂说明进行，步骤如下：

(1)组织研磨后或细胞收集后用PBS洗2次，按1×10⁷细胞加入1ml细胞总RNA抽 提试剂Trizol，充分匀浆；

(2)加入0.2ml氯仿混匀，室温静置3分钟后，4℃、12,000g离心15分钟；吸 取上层水相置于新管中，加入0.5ml异丙醇，室温静置10分钟后，4℃、12,000g离心 20分钟；

(3)弃上清，沉淀以75％乙醇洗涤，4℃、7,500g离心5分钟后，空气干燥；溶解 于40μl DEPC处理的水溶液，进行浓度和纯度测定后保存于－80℃用于反转录。

2.血清microRNA的提取

(1)吸取400μl冻存的病人血清，加入750μl裂解液MRL，吹打几次。

(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在室温下孵育5min，小心吸取上清转入一个新的RNase  free的离心管中。

(3)每750μl裂解液加200μl氯仿，改进样品管盖，剧烈震荡15s并将其在室温下孵 育3min。

(4)于4℃12000rpm离心10min，样品会分成3层，去上层水相，移到新的RNase free  EP管中。

(5)加入0.6倍体积的70％乙醇，颠倒混匀，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA 中。

(6)10000rpm离心45s，收集下滤液，加入2/3体积的无水乙醇，颠倒混匀，将混合液 倒入吸附柱RB，10000rpm离心30s，弃掉废液。

(7)加入700μl漂洗液RW，12000rpm离心60s，弃掉废液。

(8)加入500μlRW，12000rpm离心60s，弃掉废液。

(9)将吸附柱RB放回空收集管，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。

(10)取出RB，放入到一个新的RNase free EP管中，在吸附膜中间加30μl RNase free  water，室温放置2min，12000rpm离心1,min。收集得到纯净microRNA保存于-80℃。

血清microRNA的逆转录和real-timePCR检测同组织microRNA操作。

3.microRNA逆转录

(1)取2μg细胞或组织总RNA，在室温解冻，解冻后迅速置于冰上。按照表3配制混 合液。

表3microRNA逆转录体系

(2)85℃，5min后放于冰上，得到的microRNA cDNA可用于后续实验，或置于-20℃保 存。

4.Real-timePCR检测microRNA表达

以上述逆转录反应得到的cDNA为模板，每个待测基因每个模板设置三个复孔，在冰上操 作，反应体系配制如表4。

表4Real-time PCR反应体系

按照两步法PCR设定反应步骤。

反应结束，根据熔解曲线和Ct值，按照按照2^-ΔΔCT计算得到目的基因在这一模板中的相 对表达值后进行分析。

U6及Hsa-miR-424-5p的引物的序列如表5所示(U6基因的上游引物序列如SEQ ID NO.10 所示，下游引物序列如SEQ ID NO.11所示)。

表5引物序列

实施例6Western blot检测caspase3的活化

HepG2以及SMMC7721细胞株贴壁培养24小时后转染miR-424-5p及对照序列，24h后置 poly-HEMA板中培养24h后收集蛋白，western blot检测caspase3原型及其剪切体的表达。 另外，利用caspase-3活性检测试剂盒对转染前后失巢细胞内caspase-3的活化进行检测。 结果显示，转染miR-424-5p的失巢的肝癌细胞中，Caspase3活性增强，说明miR-424-5p促 进了失巢引起的细胞凋亡(见图3)。

实施例7Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测转移性肝癌细胞凋亡

选择肝癌细胞株HepG2和BEL7402细胞，转染miR-424-5p mimics,24h后消化细胞，置 poly-HEMA培养板中继续培养24h。收集失巢后的肝癌细胞，用移液器轻轻吹开细胞团成单个 细胞，1000rpm4℃离心5min，预冷PBS冲洗3遍，进行AnnexinV-FITC染色，并应用流式 细胞术检测凋亡细胞，结果显示转染miR-424-5p的转移性细胞失巢后凋亡增加(见图4)。

实施例8转移性肝癌细胞的侵袭能力检测

前期研究表明，抵抗失巢凋亡的肝癌细胞获得了更高的侵袭能力，我们进一步研究这种 高侵袭力的获得是否与miR-424-5p下调有关。为此在SMMC7721，BEL7402，HepG2细胞株中， 进行miR-424-5p mimics的转染。转染24h后置poly-HEMA培养板中继续培养24h，胰酶消 化离心后，进行细胞计数并按照1000/小室将细胞加入铺有matrigel胶的transwell小室， 16h后进行结晶紫染色，分析穿过小室膜的细胞并拍照计数(见图5)。结果表明转染 miR-424-5p后，穿过小室的肝癌细胞减少，细胞侵袭力下降。

实施例9转移性肝癌细胞的克隆形成能力检测

在肝癌细胞株BEL7402、SMMC-7721和HepG2中，进行miR-424-5p mimics的转染。转染 24h后置于poly-HEMA培养板中继续培养24h，消化计数后以1000个细胞/孔接种在六孔板中。 7-10天计数细胞数大于50的细胞克隆数(见图6)。结果表明转染miR-424-5p的失巢的肝癌 细胞克隆形成能力下降。

实施例10miR-424-5p的靶基因预测与验证

生物信息学预测miR-424-5p的可能靶基因，分析与肝细胞癌恶性行为相关的靶基因，选 择ICAT、Bcl2l2、DICER等基因为miR-424-5p的潜在靶点。在肝癌细胞中进行miR-424-5p 的转染，并检测靶基因的表达水平，由此对筛选出的潜在靶基因进行调控效应验证；并应用 报告基因检测miR-424-5p与ICAT等潜在靶基因3’UTR预测靶序列的结合。

分别用miR-424-5p mimic和miR-424-5p inhibitor对肝癌细胞进行转染，结果显示 miR-424-5p能够下调ICAT在肝癌细胞中的表达,而其inhibitor能够上调ICAT的表达(图7)。

为了进一步验证miR-424-5p对ICAT的负向调控效应，我们在三个肝癌细胞系BEL7402， SMMC7721以及HepG2中转染了miR-424-5p mimic，24h后收集细胞蛋白，Western blot检测 ICAT蛋白表达，β-actin为内参基因(见图8)，ICAT在miR-424-5p转染后表达下调，说明 ICAT的表达受miR-424-5p的抑制。

为了探究miR-424-5p对ICAT的负向调控作用是否是通过靶向结合ICAT mRNA3’-UTR 发挥作用，我们构建了pmiR-GL0-ICAT-3’UTR的野生型和突变型报告基因载体，我们将 miR-424-5p和报告载体共转染到HEK293细胞后，发现miR-424-5p可以有效抑制pmiR-GL0 野生型报告质粒的活性。而miR-424-5p的结合位点突变的载体，miR-424-5p对报告基因的 抑制活性消失(图9)，说明miR-424-5p直接结合在ICAT mRNA3’UTR，从而下调ICAT蛋白 表达。

进一步的细胞实验显示，miR-424-5p能够促进E-cadherin和β-catenin复合物的形成， 促进细胞粘附，抑制间质细胞蛋白的表达；而ICAT的作用则相反，表现为促进细胞的侵袭转 移，提示miR-424-5p通过靶向ICAT对肝癌细胞发挥效应。

实施例11验证miR-424-5p是否通过直接靶向ICAT逆转转移性肝癌细胞的恶性行为

通过以上实验结果，我们已经证实了miR-424-5p对其预测靶基因ICAT的负向调控效应， 我们进一步证实miR-424-5p对失巢后肝癌细胞的EMT和肿瘤转移的也具有抑制效应。

1.靶向ICAT的小干扰的合成

根据前面结果，ICAT在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中表达上调，为进一步验证ICAT在肝 癌细胞抵抗失巢凋亡中的作用，我们合成了ICAT小干扰RNA，下调其在肝癌细胞中的表达。 小干扰序列如表6所示(如SEQ ID NO.12～14所示)：

表6.ICAT小干扰序列

在肝癌细胞株HepG2中转染分别转染三条小干扰RNA，同时转入荧光标记阴性对照，通 过荧光显微镜观察荧光，监测转染效率。转染24h后收集蛋白，western blot检测ICAT的 表达(见图10)。结果显示三条小干扰中Si-1和Si-3干扰效率较高，达到百分之七十，遂 在下一步实验中将①和③混合转染肝癌细胞，下调ICAT的水平。

2.ICAT小干扰逆转了转移性肝癌细胞的上皮向间质转化(EMT)

向肝癌细胞株HepG2中转入ICAT小干扰，并检测EMT相关蛋白的表达，发现β-catenin  mRNA水平上调，而间质化标志蛋白N-cadherin，Snail，Vimentin表达水平下调(见图11)， 说明ICAT促进了肝癌细胞中EMT的发生。

3.ICAT下调E-cadherin/β-catenin复合物的形成

在HepG2细胞中按照0.5μg、1μg、2μg分别转染ICAT表达质粒，检测不同剂量的ICAT 对E-cadherin/β-catenin形成复合物的影响，结果发现随着ICAT蛋白水平的提高，β -catenin可结合的E-cadherin减少，这与miR-424-5p促进E-cadherin和β-catanin复合 物形成的结果相反，提示miR-424-5p通过ICAT促进E-cadherin/β-catenin复合物形成(图 12)。

4.miR-424-5p通过ICAT逆转EMT

将肝癌细胞株HepG2分为四组，分别是：①转染miR-424-5p组，②转染ICAT表达载体 组，③先转染miR-424-5p,24h后转染ICAT表达载体组，④空白对照组。实验结果表明,转染 miR-424-5p后，E-cadherin表达下调，N-cadherin表达上调，ICAT表达下调。而转染ICAT 表达载体后，以上分子的表达变化出现了逆转，说明miR-424-5p的确通过ICAT发挥抑制EMT 的作用。同时，肝癌细胞内高水平的ICAT影响EMT相关基因的表达，而miR-424-5p的同时 过表达能够逆转这一效应(图13)。

5.下调ICAT的表达能够抑制肝癌细胞的侵袭转移

为了进一步验证ICAT促进EMT的效应，根据5.1.1部分的结果，利用合成的ICAT的小 干扰Si-ICAT(1和3)，对肝癌细胞转染进行transwell实验，发现转染靶向ICAT小干扰的 肝癌细胞表现出侵袭能力下调(见图14)，这与miR-424-5p的对肝癌细胞的作用效应一致, 提示miR-424-5p的作用效应通过对其靶基因ICAT的抑制作用实现。

6.miR-424-5p对失巢凋亡抵抗相关恶性行为的作用效应

向肝癌细胞中转入miR-424-5p mimics，通过免疫共沉淀以及westernblot检测细胞粘附 关键分子E-cadherin/βcatenin复合物的表达以及EMT相关恶性行为。通过对肝癌细胞进行 ICAT真核表达载体及小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)的转染，从正反向明确 miR-424-5p对肝癌细胞的作用效应是否通过ICAT介导(图14)。

实施例12临床肝癌组织中验证miR-424-5p与ICAT的相关性

与非癌肝组织相比，miR-424-5p在肝癌组织中表达显著下调，并且与病理分级和临床分 期呈负相关(表1)；并且miR-424-5p在转移患者中的表达水平显著低于原位癌患者，提示 miR-424-5p在肝癌组织中的表达失调参与了肝癌进展(图15)。miR-424-5p与ICAT在肝癌 中的表达水平呈负相关，临床标本中的检测进一步说明ICAT是miR-424-5p的直接靶基因(图 16)。

表1.临床肝癌病人中miR-424-5p的表达与病人临床检测指标之间的相关性