一种含水飞蓟宾和索拉非尼的药物组合物及其应用

摘要

本发明公开了一种含水飞蓟宾和索拉非尼的药物组合物，其中，所述药物组合物中水飞蓟宾和索拉非尼的质量比例为1∶1～1∶5。该药物组合物在提高肿瘤抑制效果的同时，有效地改善了水飞蓟宾的溶解度以及索拉非尼的副作用，且两者的联合用药表现出了较好的协同作用。

说明书

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及一种含水飞蓟宾和索拉非尼的药物组合物及其应用。 

背景技术

原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是威胁生命的最主要癌症之一。尽管治疗HCC的药物在近年取得了长足的进步，但由于环境因素、生活习惯的改变以及卫生医疗体系的相对滞后，它业已成为影响人类健康的重要杀手，且发病率和死亡率仍在逐年攀升。目前，全球每年新发肝癌患者约六十万，而半数以上(55％)来自我国。因此，开发新型高效的抗肝癌药物或制剂显得迫在眉睫。 

水飞蓟宾(silybin)是一种黄酮类天然产物药，在临床上通常作为一种保肝药物被应用于治疗肝炎、肝硬化及代谢中毒性肝损伤等疾病。近年来研究表明，水飞蓟宾对各种上皮肿瘤来源的肿瘤如肝癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌等均具有良好抑制作用。口服水飞蓟宾生物利用率低，疗程长，但由于水飞蓟宾水溶性差，制备注射制剂时需加入助溶剂或将其制备成水溶性盐，如CN1762344中将其制备成葡甲胺盐或氨基酸盐以增加去水溶性；也可直接通过调节pH值以增加溶解度，但副作用大。 

CN1969924A公开了一种水飞蓟宾和板蓝根的复方药物，其具有协同作用；CN1875963公开了水飞蓟宾与联苯双酯联用治疗肝脏疾病；CN1981833A公开了水飞蓟宾和栀子、茵陈联用以治疗肝脏疾病；CN1907383A公开了水飞蓟宾与数十味中药材的联合用药技术；CN101357129A公开了水飞蓟宾与苦参素或苦参碱的药物组合物联用用于治疗肝炎、肝损伤和肝癌等疾病的用途。 

索拉非尼(Sorafenib)是一个多靶向药物，它通过抑制RAF／MEK／ERK介导的细胞信号传导通路而直接抑制肿瘤细胞的增殖，又通过作用于VEGFR和PDGFR来阻断肿瘤新生血管的形成，间接抑制肿瘤生长。该药物对包括肝癌在内的多种恶性肿瘤均有明显的抑制作用，但却只能将肿瘤无进展期的基线控制在6个月内，且服用后容易导致皮疹、血压升高、手掌或足底部发红、疼痛、肿胀或出现水疱等不良症状。 

CN102274220B公开了索拉非尼与其他药物联用在制备逆转肿瘤多药耐药性的药物中的应用。 

目前，尚无将水飞蓟宾与索拉非尼联合用药的报道。 

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明提出一种含水飞蓟宾和索拉非尼的药物组合物及其应用，有效地改善了水飞蓟宾的溶解度以及索拉非尼的副作用，并提高了肿瘤抑制效果。 

技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出了一种含水飞蓟宾和索拉非尼的药物组合物，其中，所述药物组合物中水飞蓟宾和索拉非尼的质量比例为1∶1～1∶5。 

作为优选，所述含水飞蓟宾和索拉非尼的药物组合物中，水飞蓟宾和索拉非尼的质量比例为1∶2。 

其中，所述含水飞蓟宾和索拉非尼的药物组合物还包括药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体可以为本领域技术人员公知的药用载体。 

本发明还提出了上述药物组合物在制备用于治疗恶性肿瘤的药物上的用途。 

其中，所述恶性肿瘤为原发性肝癌、肺癌和乳腺癌中的任意一种。 

其中，水飞蓟宾和索拉非尼是分别以其化学上可接受的形式作为药物活性剂给药的，其药学上可接受的形式包括药学上可接受的盐、酯等。 

本发明给出的药学上可接受的形式的水飞蓟宾和索拉非尼的标量，包括质量时，该标量是关于化合物本身给出的。除非另有说明，本发明所述的配比均为质量配比。 

本发明的药物组合物可以以药剂学上常用的各种剂型，如口服给药和注射给药，也适合其他如给药途径如经皮给药。上述药剂学上常用的各种剂型可以是片剂、胶囊、颗粒剂、栓剂等，或者口服液或无菌胃肠外溶液或悬液等液体制剂形式。本发明的药物组合物也可以是大或小容量注射剂、冻干粉剂、无菌粉分装等制剂形式。 

另外，还可按照常规方法将药物组合物中的单味活性制剂或药物组合物制成缓控释制剂，如缓释片、微丸或控释片。 

根据不同的给药方法及药物剂型，制剂中可以含有质量分数为0.1％～99％的活性物质，优选质量分数为10％～60％的活性物质。 

药理学和药效学试验证实，本发明的水飞蓟宾和索拉非尼药物组合物具有协同治疗原发性肝癌等恶性肿瘤的功用，所述的恶性肿瘤优选为原发性肝癌、肺癌、乳腺癌等疾病。 

有益效果：与现有技术相比，本发明的含水飞蓟宾和索拉非尼的药物组合物有效地改善了水飞蓟宾的溶解度低及索拉非尼的副作用问题，使药物的生物利用度提高，同时， 水飞蓟宾和索拉非尼的联合使用可使药效产生协同作用。特别地，当水飞蓟宾和索拉非尼的质量比为1∶2时，这种协同作用非常好，并在体外抗癌实验中得到证实，此外，当两者比例为1∶2时，药物的毒副作用最小。 

具体实施例

以下实施例所用细胞系及所用昆明小鼠的来源如下：HepG2细胞系由本实验保存，其余细胞系及昆明小鼠由第三军医大学、重庆医科大学和重庆大学生物工程学院相关机构提供。 

药物与试剂：索拉非尼由拜耳公司生产，用100％DMSO溶解，后于-20℃保存，实验时稀释(DMSO终浓度＜0.5％)。水飞蓟宾由江苏中兴药业有限公司提供；MTT及DMSO由sigma公司生产，AnnexinV-FITC／PI凋亡试剂盒由南京凯基生物科技有限公司生产。其余涉及的为实验室常规试剂。 

实施例1水飞蓟宾和索拉非尼联合药物浓度的确定与IC₅₀测定。 

本实施例采用MTT法分析HepG2细胞对水飞蓟宾以及索拉非尼的药物敏感性。HepG2细胞以1×10⁴／mL的浓度接种于96孔培养板，100μL／孔，培养过夜后加入不同浓度的药物或对照液(每孔加20μL)，其中，水飞蓟宾设8个浓度梯度，分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1500和0.0750(单位均为μmol/L)；索拉非尼设7个浓度梯度，分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125和0.1500(单位均为μmol/L)。每种药物浓度设3个重复孔，实验重复3次，同时设有不含药物对照组。培养24h、48h、72h后分别在每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h，分别在每孔中加入二甲亚砜(DMSO)130μL，在震荡器上充分混匀后于酶标仪下490nm波长测定OD值，计算50％细胞生长抑制所需的各药浓度(IC50)，从而确定下一步实验药物浓度。结果如表1所示，两种药物对HepG2细胞的抑制作用呈现药物浓度与时间依赖性。从结果可以看出，细胞在培养72小时后，水飞蓟宾对HepG2细胞的IC₅₀值为1.08±0.54μmol／L，索拉非尼对HepG2细胞的IC₅₀值为2.10±0.63。 

表1不同时间HepG2细胞的IC₅₀值(单位：μmol／L，mean(x)±s) 

实施例2药物组合物对HepG2细胞增殖的抑制率实验。 

将对数期HeG2细胞以1×10⁴／孔的密度接种于96孔板，50μL／孔，培养24h后加入药物(每孔各加水飞蓟宾、索拉非尼、联合组或对照液50μL)。其中，水飞蓟宾浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.0(单位均为μmol／L)，索拉非尼浓度分别为0.01、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和2.0(单位均为μmol／L)，联合组浓度为(0.01μmol／L水飞蓟宾+0.01μmol／L索拉非尼)、(0.05μmol／L水飞蓟宾+0.1μmol／L索拉非尼)、(0.1μmol／L水飞蓟宾+0.2μmol／L索拉非尼)、(0.2μmol／L水飞蓟宾+0.4μmol／L索拉非尼)、(0.4μmol／L水飞蓟宾+0.8μmo1／L索拉非尼)、(0.8μmol／L水飞蓟宾+1.6μmol／L索拉非尼)和(1.0μmol／L水飞蓟宾+2.0μmol／L索拉非尼)，且每种浓度各4次重复。加药后分别培养72h，然后每孔加浓度为5mg／L的MTT10μL，继续培养4h后加入DMSO80μL，振荡10min并用酶标仪(波长490nm)测定各孔的OD值，按照以下公式计算细胞增殖抑制： 

用q值判断索拉非尼和水飞蓟宾联用的特性，计算公式： 

其中，EA和EB分别为索拉非尼和水飞蓟宾的单用抑制率，EAB为两药合用抑制率。当q＞1.15时为协同作用，0.85≤q≤1.15为相加作用，q＜0.85为拮抗作用。 

研究结果表明：HepG2细胞经索拉非尼+水飞蓟宾联合处理后，在72h出现细胞生长抑制作用，与单用索拉非尼或水飞蓟宾相比，细胞抑制率明显增高。索拉非尼组抑制率为8％～24％，水飞蓟宾组抑制率为16％～29％，而联合组抑制率为26％～58％ (P＜0.05)。同时，2μmol／L索拉非尼+1μmol／L水飞蓟宾在72h的q值为1.18，表现为协同作用，其余组q值为0.83～1.08，表现为相加作用。此外，联合组抑制率随药物浓度增加而增加，P＜0.05。 

实施例3单独药物以及联合用药对多种肿瘤细胞的体外抑制实验。 

用MTT方法测定72小时内单独用水飞蓟宾(1μmol／L)、索拉非尼(2μmol／L)和联合使用两者(0.5μmol／L的水飞蓟宾+1μmol／L的索拉非尼)对多种肝癌细胞(MHCC97，KMHC和HepG2细胞)以及肾癌细胞(786-0细胞)增殖的抑制作用。试验结果如表2显示，相比单独用药，联合用药(0.5μmol／L的水飞蓟宾+1μmol／L的索拉非尼)对多种恶性肿瘤细胞均有更好的效果，尤其对于与原发性肝癌细胞更接近的HepG2细胞的抑制效果更佳。 

表2索拉非尼、水飞蓟宾以及两者联用对癌症增殖的抑制作用(测定时间72小时) 

实施例4联合药物对HepG2肝癌细胞凋亡的影响 

采用流式细胞技术分析水飞蓟宾、索拉非尼单独使用及联合使用对HepG2细胞凋亡的影响。将HepG2细胞以1×10⁴／mL的浓度接种于96孔培养板，100μL／孔，培养过夜后加入药物，(每孔各加水飞蓟宾、索拉非尼、联合组或对照液100μL)水飞蓟宾设7个浓度梯度，分别为0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.0(单位均为μmol／L)；索拉非尼设7个浓度梯度，分别为0.01、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和2.0(单位均为μmol／L)；联合组(水飞蓟宾与+索拉非尼)浓度分别为(0.01μmol／L水飞蓟宾+0.01μmol／L索拉非尼)、(0.05μmol／L水飞蓟宾+0.1μmol／L索拉非尼)、(0.1μmol／L水飞蓟宾+0.2μmol／L索拉非尼)、(0.2μmol／L水飞蓟宾+0.4μmol／L索拉非尼)、(0.4μmol／L水飞蓟宾+0.8μmol／L索拉非尼)、(0.8μmol／L水飞蓟宾+1.6μmol／L索拉非尼)和(1.0μmol／L水飞蓟宾+2.0μmol／L索拉非尼)。每种药物浓度设3个重复孔，实验重复3次，并设不含药物的 对照组。72小时后，测定细胞凋亡率。 

水飞蓟宾、索拉非尼单独使用及联合使用对HepG2细胞凋亡的影响研究的结果表明：水飞蓟宾(浓度1μmol／L)或索拉非尼(浓度2μmol／L)单独作用后，细胞凋亡率均较对照组升高。其中：对照组所致的凋亡率为3.6％，水飞蓟宾所致的凋亡率为12.9％，索拉非尼所导致的凋亡率为15.8％。而联合用药组(1μmol／L的水飞蓟宾+2μmol／L的索拉非尼)引起的凋亡率升高更为明显，达56.3％，与单独给药相比，有显著的统计学差异(P＜0.05)，且协同作用明显。 

实施例5单独药物给药、联合用药对血药浓度的影响及生物利用度测试。 

水飞蓟宾溶于丙酮、乙酸乙酯，略溶于醇，不溶于水。由于水飞蓟宾不溶于水，其在体内的吸收速度和疗效大大降低。索拉非尼是一种含氮杂原子的碱性分子，可与水飞蓟宾的酚羟基作用，形成的复合物具有很高的亲脂性，吸收快，疗效强，可大大提高水飞蓟宾在体内的生物利用度。 

本试验选取成年健康昆明小鼠15只，随机分为三组，每组5只，一组为索拉非尼组，二组为水飞蓟宾组，三组为联合用药组(其中索拉非尼与水飞蓟宾的质量比为2∶1)。禁食12h后，按照20mg／kg剂量灌胃给药，分别在给药前和给药后0.5、1、2、4、6、8、10、12、24小时于耳缘静脉采血1mL，置加有油肝素的EP管内，静置后处理，测定血浆浓度，结果如表3所示；计算药动参数及各实验组间相对生物利用度，结果如表4所示。实验结果表明：联合用药组因脂溶性增加，吸收好，平均血药浓度高于索拉非尼组、水飞蓟宾组；联合用药组相对生物利用度是索拉非尼组的7.7倍，是水飞蓟宾组的11.5倍，综上，联合用药方案使得药物的生物利用度得到了明显的提高。 

表3索拉非尼、水飞蓟宾以及两者联用的平均血药浓度(ng／ml；n＝6；X±SD) 

表4相对生物利用度结果 

实施例6联合用药急性毒性试验。 

本试验以昆明小鼠为研究对象，研究水飞蓟宾和索拉非尼组合药物对小鼠的急性毒性的影响，为水飞蓟宾和索拉非尼复合药物的进一步研究开发提供初步安全性评价资料。 

急性毒性试验按GB1519.3-2003《食品急性毒性试验》中最大耐受剂量法进行试验。18只清洁级小白鼠，随机分为3组：空白对照组(试验1)、水飞蓟宾和索拉非尼(质量比为1∶2)联合药物试验组(试验2)、索拉非尼单独供药组(试验3)，每组6只(N＝6)，雌雄各3只。根据食品安全性评价中的急性毒性分级标准，试验前小鼠禁食10h，以0.5mL／只灌胃给药，24h内给药2次，日用量为15g／Kg，空白对照组小鼠灌胃相同剂量的生理盐水。给药后，观察小鼠72h内是否死亡，以及未来一周内的体重变化。所有试验结果均以“x±s”表示，用t检验方法检验差异显著性。 

由表5可知，小鼠在喂养期间的体重是不断增加的，索拉非尼单独供药组(试验3)相对于空白对照组(试验1)体重明显下降，而水飞蓟宾和索拉非尼(质量比为1∶2)联合药物试验组(试验2)相对于空白对照组(试验1)体重虽有所下降，但幅度不大。说明，水飞蓟宾和索拉非尼(质量比为1∶2)联合药物的毒性相对于索拉非尼有所缓和。 

表5用药期间小鼠的体重变化情况(N＝6) 

脏器指数可近似反映该脏器的生理指标，反映动物总的营养状态和内脏器官的病变情况。脏器系数增大时表明有充血水肿增生肥大等变化，脏器系数减小时表明脏器可能出现萎缩退行性等变化。本发明根据脏器指数判断小鼠内脏器官是否发生病变。用药一周称重后，处死解剖，用肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、胃肠及胸腔、腹腔情况，索拉 非尼单独供药组(试验3)、水飞蓟宾和索拉非尼(质量比为1∶2)联合药物试验组(试验2)两组小鼠各器官均有不同程度病变。将取出的各内脏器官，经生理盐水冲洗，去除脏器表面的残留血液与结缔组织，用吸水纸擦干，准确称重，计算脏器指数(脏器指数＝脏器重量体／体重*100％)。 

从表6可以看出，与对照组相比，索拉非尼单独供药组(试验3)小鼠脏器指数有显著差异，水飞蓟宾和索拉非尼(质量比为1∶2)复合药物试验组(试验2)小鼠脏器指数差异性有所降低。小鼠的脏器指数初步说明水飞蓟宾和索拉非尼复合药物会造成小鼠内脏器官不同程度的病变。 

表6各组小鼠的脏器指数(N＝6) 

血清总胆固醇甘油三酯是反映生物体内血脂水平的重要指标，也是心血管疾病的危险因子，血清谷丙转氨酶谷草转氨酶是肝功能的主要检测指标，而尿素氮和肌酐是肾功能的主要检测指标。本发明通过小鼠的血清指标考察水飞蓟宾和索拉非尼复合药物的毒副性。由表7可知，给药试验组(2)、(3)的血清生化指标与对照组相比均有显著性差异，但水飞蓟宾和索拉非尼联合药物(质量比为1∶2)对小鼠的血清指标的影响明显小于索拉非尼单独供药组(试验3)。 

表7各组小鼠的血清生化指标(N＝6) 

总的来说，试验组小鼠的体重脏器指数和血清指标与正常对照组均显著差异，初步说明水飞蓟宾和索拉非尼联合药物可降低单独使用索拉非尼所带来的毒副作用，为其进一步的开发利用提供了科学依据。 

本发明的研究表明，一方面索拉非尼可增加水飞蓟宾在水中的溶解度和生物利用度，该发现有利于将难溶性的水飞蓟宾制备成注射制剂；另一方面，水飞蓟宾和索拉非尼的联合使用可使药效产生协同作用；此外，两者联合使用还可降低单独使用索拉非尼 所带来的毒副作用。通过对水飞蓟宾和索拉非尼的各种比例组合的药效试验表明，当水飞蓟宾和索拉非尼的质量比为1∶2时，这种协同作用非常好，并在体外抗癌实验中得到证实；此外，在该比例时候药物的毒副作用也最小。