中国虎纹蛙及泰国虎纹蛙的分子鉴定方法

摘要

为了解决中国虎纹蛙实际保护工作中对外形酷似的中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙的鉴定，本发明提供一种中国虎纹蛙及泰国虎纹蛙的分子鉴定方法。该鉴定方法以PCR技术为基础，设计特异性引物进行扩增，从而达到对中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙的快速鉴定，具体实现步骤为：1）提取样本DNA；2）样本DNA检测；3）PCR扩增；分别采用四对特异性引物进行扩增；4）特异扩增产物鉴别。本发明设计的四对引物涉及不同基因位置，只需通过PCR扩增即可区分中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙，引物特异性强，琼脂糖凝胶电泳特征谱带稳定性高，无区域性差异，在实际应用中能够获得可靠而有益的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及蛙类的分子鉴定方法，具体涉及一种中国虎纹蛙及泰国虎纹蛙的分子鉴定方法，属于生物技术领域。

背景技术

虎纹蛙皮肤粗糙，头部和身体两侧有深黑色的斑纹。背部具十几行纵向排列的肤棱，肤棱之间散布着棕黑色小疣粒。腹面白色或灰色，也有不规则的斑纹，咽部和胸部具灰棕色斑，前后肢具横斑。由于受到人为过度捕捉，虎纹蛙数量大量减少，被列为国家Ⅱ级重点保护动物，也是蛙类中唯一的国家级保护动物。随着泰国养殖场的泰国虎纹蛙的人工引进，国内各养殖场大量饲养泰国虎纹蛙。因泰国虎纹蛙和中国虎纹蛙是否属于同一物种一直存在广泛争议，加之两者形态特征几乎一模一样，无法从形态上有效进行鉴别，导致一些不法商人直接捕捉野外中国虎纹蛙冒充养殖场泰国虎纹蛙进行贩卖。而林业执法部门缺少相应仪器及技术无法有效对市场上销售的虎纹蛙究竟是国家二级保护动物中国虎纹蛙还是允许销售的泰国虎纹蛙进行鉴定，导致执法难，近几年野生中国虎纹蛙种群数量呈直线下降趋势，迫切需要快速准确的鉴定方法协助执法机构用于物种鉴定。

发明内容

针对中国虎纹蛙及泰国虎纹蛙难以从形态特征进行鉴定的问题，本发明应用分子生物学技术解决中国虎纹蛙及泰国虎纹蛙的分子鉴定，提供一种以PCR技术为基础，设计特异性引物进行扩增，从而实现快速鉴定中国虎纹蛙及泰国虎纹蛙的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种中国虎纹蛙及泰国虎纹蛙的分子鉴定方法，其特征在于：该方法以PCR技术为基础，设计特异性引物进行扩增，根据扩增产物电泳条带的不同实现对中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙的快速鉴定，包括如下步骤：

1）提取样本DNA；

2）样本DNA检测；

3）PCR扩增；分别采用以下四对特异性引物进行扩增，

HWW-H1J/N，其上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQID No.2所示的核苷酸序列；

HWW-H2J/N，其上游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQID No.4所示的核苷酸序列；

HWW-H3J/N，其上游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQID No.6所示的核苷酸序列；

HWW-H4J/N，其上游引物具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQID No.8所示的核苷酸序列；

4）特异扩增产物鉴别

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，120V恒压，核酸染色剂染色；在凝胶成像系统中进行观察和分析，并记录结果；当引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N、HWW-H4J/N分别扩增出1000bp、3000bp、3000bp、3500bp片段大小时，证明是中国虎纹蛙；当引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N不能扩增出片段而能HWW-H4J/N能扩增出3500bp片段大小时，证明为泰国虎纹蛙。

作为优选，采用引物HWW-H1J/N时，PCR扩增反应总体积为50μl，其中包括以下组分：10×PCR Buffer(Mg²⁺free)为5μl，dNTP Mixture(各2.5mM)为4μl，MgCl₂为4μl，Primer（J）为2μl，Primer（N）为2μl，双蒸水为31.75μl，样本总DNA为1μl，TaKaRa Taq为0.25μl。

作为优选，采用引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N时，PCR扩增反应总体积为50μl，其中包括以下组分：10×LA PCR Buffer(Mg²⁺free)为5μl，dNTP Mixture(各2.5mM)为8μl，MgCl₂为4μl，Primer（J）为2μl，Primer（N）为2μl，双蒸水为27.75μl，样本总DNA为1μl，TaKaRa La Taq为0.25μl。

作为优选，采用引物HWW-H1J/N时，PCR扩增反应程序为，95℃预变性4min，然后进入如下循环：95℃变性40s、55℃退火40s、72℃延伸1min，循环35次，循环结束后72℃再延伸10min；

采用引物HWW-H2J/N时，PCR扩增反应程序为，95℃预变性4min，然后进入如下循环：95℃变性40s、55℃退火1min、72℃延伸3min，循环35次，循环结束后72℃再延伸10min；

采用引物HWW-H3J/N时，PCR扩增反应程序为，95℃预变性4min，然后进入如下循环：95℃变性40s、59℃退火1min、72℃延伸3min，循环35次，循环结束后72℃再延伸10min；

采用引物HWW-H4J/N时，PCR扩增反应程序为，95℃预变性4min，然后进入如下循环：95℃变性40s、56℃退火1min、72℃延伸4min，循环35次，循环结束后72℃再延伸10min。

本发明该方法是一种以PCR技术为基础，设计特异性引物进行扩增，根据扩增产物电泳条带的不同实现对中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙的快速鉴定，具体实现步骤为：

1）提取样本DNA：

①剪取蛙样本的脚趾3mm，用无菌水反复冲洗，置于灭菌的1.5ml离心管中充分剪碎；

②加入800μl的DNA裂解缓冲液及7μL的蛋白酶K（20mg/ml），在漩涡混合仪上混匀，金属浴（56℃450rpm）消化5h，不时上下颠倒，直至溶液澄清透明，消化完全后冷却至室温；

③于预冷至4℃的离心机中4℃8000rpm离心5min，取750μl上清液，向上清液中加入等体积Tris饱和苯酚，金属浴（4℃300rpm）混匀15min，不时上下颠倒至水相成乳胶状；

④4℃8000rpm离心10min，取600μl上清液，向上清液中加入等体积溶剂，溶剂由苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1的体积比混合而成，金属浴（4℃400rpm）混匀15min；

⑤4℃8000rpm离心10min，取400μl上清液，向上清液中加入2倍体积的预冷无水乙醇；

⑥将上述离心管放置于-20℃冰箱中沉淀DNA3h或以上；

⑦4℃12000rpm离心15min，弃上清液，用400μl的70%乙醇洗涤沉淀；

⑧4℃12000rpm离心15min，弃上清液，室温干燥DNA；

⑨将上述提取的总DNA溶于200μl无菌水中，标号后置于-20℃冰箱内保存。

2）样本DNA检测；

①配制1%琼脂糖凝胶，取琼脂糖0.4g、0.5×TBE液40ml置于锥形瓶中，混匀后微波炉加热至琼脂糖完全溶解，室温冷却至50℃，加入2μl Gold View核酸染色剂，混匀后倒入制胶板中静置20min；

②分别吸取Marker和各样本总DNA各4μl于点样孔内，凝胶板置于电泳槽中，由负极到正极方向120V电泳30min；

③将凝胶置于凝胶成像系统中进行检测，观察各泳道是否出现条带，出现目的条带则表明样本总DNA提取成功。

3）PCR扩增；

分别采用四对特异性引物于PCR仪中进行扩增，四对引物信息如表1所示。

表1PCR扩增引物

（4）特异扩增产物鉴别

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，120V恒压，Gold View核酸染色剂染色；在凝胶成像系统中进行观察和分析，并记录结果。

本发明人在采用本法鉴定中国虎纹蛙及泰国虎纹蛙时发现，采用引物HWW-H1J/N时，中国虎纹蛙在1000bp处扩增出特异条带；采用引物HWW-H2J/N、HWW-H3J/N时，中国虎纹蛙在3000bp处扩增出特异条带；采用引物HWW-H4J/N时，中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙在3500bp处扩增出特异条带，上述条带无性别和个体差异，均可作为中国虎纹蛙及泰国虎纹蛙的特征谱带。

本发明从分子生物学基本理论出发，应用现代分子标记技术对中国虎纹蛙及泰国虎纹蛙进行分子鉴别，具有理论基础科学可信，技术手段和实现步骤先进合理，检测结果可靠等特点。本发明利用中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙基因排列顺序同其他所有蛙类的不同，首先设计一对引物把泰国虎纹蛙、中国虎纹蛙和其他所有蛙类区分开，然后再利用中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙基因序列的重排差异设计特异性引物，所得三对引物涉及不同基因位置，只需通过PCR扩增即可区分，中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙中国虎纹蛙采用了来自云南、浙江、湖北三个地区的样本做鉴别，有效性达100%，即引物特异性高，操作简便，琼脂糖凝胶电泳特征谱带稳定性高，无区域性差异。

附图说明

图1是23个蛙样本特异性引物HWW-H1J/N的DNA扩增图谱，

图2是23个蛙样本特异性引物HWW-H2J/N的DNA扩增图谱，

图3是23个蛙样本特异性引物HWW-H3J/N的DNA扩增图谱，

图4是23个蛙样本特异性引物HWW-H4J/N的DNA扩增图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。

实施例：

以采集于云南、浙江、湖北三个地区的中国虎纹蛙，采集于浙江地区的泰国虎纹蛙、美国青蛙、牛蛙、棘腹蛙、棘胸蛙、黑斑蛙、中国林蛙作为鉴定对象。

取中国虎纹蛙样本7个，泰国虎纹蛙样本6个，美国青蛙样本1个，中国林蛙样本1个，牛蛙、棘腹蛙、棘胸蛙、黑斑蛙样本各2个。具体操作步骤如下：

1）样本DNA提取：

①取剪刀和镊子数把，用无水乙醇浸泡，取各蛙类样品，用无菌水冲洗脚趾，用滤纸吸干表面水分；

②将剪刀在酒精灯上灼烧，镊子夹住脚趾部，冷却后剪取各样品脚趾3mm，放置在1.5ml离心管中；

③蛙脚趾在无菌水中清洗，用剪刀充分剪碎；

④向上述离心管中加入800μl的DNA裂解缓冲液及7μl的蛋白酶K（20mg/ml），在WH-2微型漩涡混合仪混匀，56℃、450rpm条件下金属浴（Bioer Mixing Block MB-102）消化5h，期间不时上下颠倒，直至溶液澄清透明，消化完全后冷却至室温；

⑤提前打开台式高速冷冻离心机（Eppendorf Centrifuge5417R）预冷至4℃，然后将上述离心管于4℃、8000rpm离心5min，取上清液750μl至另一新的离心管中，加入750μl Tris饱和苯酚，金属浴(4℃、300rpm)混匀15min，期间不时上下颠倒，至水相成乳胶状；

⑥将上述离心管于4℃、8000rpm离心10min，取上清液600μl至另一新的离心管中，加入600μl苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，金属浴(4℃、400rpm)混匀15min；

⑦将上述离心管于4℃、8000rpm离心10min，取上清液400μl至另一新的离心管中，加入800μl预冷-20℃无水乙醇；

⑧将离心管置于-20℃冰箱（Haier BCD-196DT）中沉淀DNA3h或以上；

⑨将上述离心管于4℃、12000rpm离心15min，弃去上清液，用400μl70%的乙醇洗涤沉淀；

⑩将上述离心管于4℃、12000rpm离心15min，弃去上清液，室温干燥DNA；

将上述提取的总DNA溶于200μl的无菌水中，标记好对应编号并置于-20℃冰箱内保存备用。

2）样本DNA检测

①配制1%琼脂糖凝胶，用电子天平（Mettler AM100）称取0.4g琼脂糖，用量筒量取40ml的0.5×TBE液，于锥形瓶中混匀，Galanz微波炉中加热至琼脂糖完全溶解，室温冷却至50℃，加入2μl Gold View核酸染色剂（购自上海生物工程股份有限公司），混匀后倒入制胶板中静置20min；

②用移液枪（Eppendorf Research）分别吸取DL2000DNA Marker（购自上海生物工程股份有限公司）和各样本总DNA各4μl于点样孔内，将凝胶板置于电泳仪（Bio-RADPowerPac）的电泳槽中，由负极到正极方向120V电泳30min；

③将凝胶置于凝胶成像系统（Bio-RAD Molecular Imager Gel Doc XR+Imaging System）中进行检测，观察各泳道是否出现条带，出现目的条带则表明样本总DNA提取成功。

3）PCR扩增

分别采用四对特异性引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N、HWW-H4J/N（委托上海生工生物工程股份有限公司合成）于PCR仪（Bio-RAD MJ Mini Personal ThermalCycler）中进行扩增；

PCR扩增反应体系组成：

采用引物HWW-H1J/N时，PCR扩增反应总体积为50μl，其中包括以下组分：10×PCRBuffer(Mg²⁺free)为5μl，dNTP Mixture(各2.5mM)为4μl，MgCl₂为4μl，Primer（J）为2μl，Primer（N）为2μl，双蒸水（Mylli-Q Biocel超纯水仪自制）为31.75μl，样本总DNA为1μl，TaKaRa Taq为0.25μl；

采用引物HWW-H1J/N、HWW-H2J/N、HWW-H3J/N时，PCR扩增反应总体积为50μl，其中包括以下组分：10×LA PCR Buffer(Mg²⁺free)为5μl，dNTP Mixture(各2.5mM)为8μl，MgCl₂为4μl，Primer（J）为2μl，Primer（N）为2μl，双蒸水为27.75μl，样本总DNA为1μl，TaKaRa La Taq为0.25μl（PCR Buffer、dNTP、MgCl₂、TaKaRa Taq、TaKaRa La Taq购自宝生物工程（大连）有限公司）；

PCR扩增反应程序：

采用引物HWW-H1J/N时，PCR扩增反应程序为，95℃预变性4min，然后进入如下循环：95℃变性40s、55℃退火40s、72℃延伸1min，循环35次，循环结束后72℃再延伸10min；

采用引物HWW-H2J/N时，PCR扩增反应程序为，95℃预变性4min，然后进入如下循环：95℃变性40s、55℃退火1min、72℃延伸3min，循环35次，循环结束后72℃再延伸10min；

采用引物HWW-H3J/N时，PCR扩增反应程序为，95℃预变性4min，然后进入如下循环：95℃变性40s、59℃退火1min、72℃延伸3min，循环35次，循环结束后72℃再延伸10min；

采用引物HWW-H4J/N时，PCR扩增反应程序为，95℃预变性4min，然后进入如下循环：95℃变性40s、56℃退火1min、72℃延伸4min，循环35次，循环结束后72℃再延伸10min。

4）特异扩增产物鉴别

扩增产物用电泳仪电泳检测，琼脂糖凝胶浓度为1%，其中加入Gold View核酸染色剂进行染色，将23个样本的PCR扩增产物和DL10000DNA Marker（购自上海生物工程股份有限公司）分别加入4μl于点样孔内，同时设定一个阴性对照（M为DL10000DNA Marker，1—6号为泰国虎纹蛙THW1、THW2、NW1、NW2、HWW1、HWW5，7—13号为中国虎纹蛙PHW2、WZW2、WZW3、JCW4、JCW5、JCW7、ZJ，14号为美国青蛙MGQW1，15—16号为牛蛙NWW1、NWW2，17—18号为棘腹蛙JFW1、JFW2，19—20号为棘胸蛙JXW1、JXW2，21—22号为黑斑蛙HBW1、HBW2，23号为中国林蛙SLS3，D为阴性对照），120V恒压电泳，参看图1—图4，在凝胶成像系统中观察结果，采用引物HWW-H1J/N进行PCR扩增时，样本7—13号在1000bp处扩增出特异条带，其余样本无条带；采用引物HWW-H2J/N、HWW-H3J/N进行PCR扩增时，样本7—13号在3000bp处扩增出特异条带，其余样本无条带；采用引物HWW-H4J/N时，样本1—13号在3500bp处扩增出特异条带，其余样本无条带，认定1—6号为泰国虎纹蛙，7—13号为中国虎纹蛙，与实际情况一致。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  浙江师范大学

 

<120>  中国虎纹蛙及泰国虎纹蛙的分子鉴定方法

 

<130>  ZJY

 

<160>  8    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cacataacgc ataaaggtct aa                                              22

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tacaggctga taaagcaagg                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

tacccctcct ccttattttc g                                               21

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gggcgtttag aatagattga cc                                              22

 

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ccgcaaccaa ctcctatgtc aa                                              22

 

 

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

aagtcaggcg aatgctgcta tg                                              22

 

 

<210>  7

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

cacactaaca agccaacaaa aga                                             23

 

 

<210>  8

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

aaagggtaag ataggaacaa acg                                             23