一种用于柑橘蒂腐病防治的含有聚氨丙基双胍的保鲜剂及其制备和应用

摘要

本发明涉及一种用于柑橘蒂腐病防治的含有聚氨丙基双胍的保鲜剂及其制备和应用，所述保鲜剂的成份和配比如下：聚氨丙基双胍10－45重量％；防腐剂5－15重量％；生物活性剂2－10重量％；乳化剂10－20重量％；余量为水。该保鲜剂可显著降低柑橘果实采后病害的发生，防治蒂腐病害，对柑橘具显著的防腐保鲜效果，延缓果实衰老，延长果实的贮藏期和货架期。本发明保鲜剂具有安全、环保、对环境无污染，制备方法简单、综合成本低，使用方法灵活、方便，易于推广应用的特点。

说明书

技术领域

本发明属于果蔬保鲜领域，涉及柑橘蒂腐病的防治，特别涉及一种用于柑橘蒂 腐病防治的含有聚氨丙基双胍的保鲜剂及其制备和应用。

背景技术

柑橘(citrus fruit)蒂腐病是柑桔后期主要腐烂病害，包括由拟茎点霉属 (Phomopsis stem-end rot)引起的褐色蒂腐病和壳色单隔孢属(Diplodia stem-end rot) 引起的黑色蒂腐病。病害主要在贮藏柑桔后期发病，开始于果蒂或伤口，从局部延 伸至全果，发病后的果实变褐或黑，病果果肉腐烂比果皮腐烂快，又称“穿心烂”， 柑橘间易交叉感染。

柑橘采后防腐保鲜最普遍使用的化学杀菌剂(如50％甲基托布津1500～2000 倍液或50％多菌灵可湿性粉剂2000倍液)对青绿霉、炭疽病等病害有很好的防治 效果，但对于蒂腐病则防效不佳。近年来蒂腐病发病率有上升势头，但对其防效不 佳、相关研究又少，影响了柑橘的产业发展。为此，从提高对柑橘蒂腐病防效、减 少杀菌剂使用量、降低抗药性产生，保证食品安全角度，寻求并开发对柑橘蒂腐病 有效、安全的物质具重要意义。

聚氨丙基双胍是双胍类物质的一种，分子式：(C₅H₁₄N₆)X，是一种高效广谱安 全的防霉防菌物质。阳离子高聚物的特性，使其可选择性的吸附于致病微生物表面， 作用于细胞膜，破坏膜及细胞结构进而起到杀菌防霉作用。研究表明聚氨丙基双胍 8500mg/L溶液，小鼠急性经口LD50大于5000mg/kg，大鼠急性吸入毒性LC50(2h) 大于10000mg/m3，属于实际无毒级。另外，3-4ppm的聚氨丙基双胍对水生生物是 绝对安全的，对环境无污染，能自然或被生物分解，当高度稀释后可被微生物消化 分解代谢。

目前国内外聚氨丙基双胍主要应用于化妆品、医药、食品加工的表面消毒，未 有聚氨丙基双胍应用于柑桔采后蒂腐病研究报道或相关成熟产品上市。

因此，提供一种用于柑橘蒂腐病防治的含有聚氨丙基双胍的保鲜剂就成为该技 术领域急需解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于柑橘蒂腐病防治的含有聚氨丙基双胍的保 鲜剂。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

一种用于柑橘蒂腐病防治的含有聚氨丙基双胍的保鲜剂，其成份和配比如下：

其中，所述防腐剂为柠檬酸、苯甲酸盐、对羟基苯甲酸酯类及其钠盐或双乙酸 钠中的一种或几种任意比例的混合；所述生物活性物质为氯化钙、抗坏血酸钙、壳 聚糖、壳寡糖或草酸中的一种或几种任意比例的混合。

其中，所述乳化剂为聚乙二醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、丙二醇脂肪酸酯、 单甘油脂肪酸酯、双甘油脂肪酸酯、海藻酸丙二醇酯、琥珀酸单甘油、聚甘油脂肪 酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯(吐温20)、聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯(吐 温40)、聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯(吐温60)、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(吐 温80)、氢化松香甘油酯、乳酸钙、山梨醇酐单月桂酸酯(司盘20)、山梨醇酐单 棕榈酸酯(司盘40)、山梨醇酐单硬脂酸酯(司盘60)、山梨醇酐叁硬脂酸酯(司 盘65)、山梨醇酐单油酸酯(司盘80)、硬脂酰乳酸钠、硬脂酰乳酸钙、辛基酚聚 氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基苯磺酸钙、苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚系 列或烷基酚甲醛树脂聚氧乙烯醚中的一种或几种任意比例的混合。

本发明的另一个目的是提供一种上述用于柑橘蒂腐病防治的含有聚氨丙基双 胍的保鲜剂的制备方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

一种用于柑橘蒂腐病防治的含有聚氨丙基双胍的保鲜剂的制备方法，其步骤如 下：

(1)将聚氨丙基双胍按比例加入容器，加适量水，持续加热，搅拌至溶解， 得聚氨丙基双胍溶液；

(2)将防腐剂和生物活性剂按比例加入另一容器，加适量水溶解，得防腐剂 和生物活性剂的混合溶液；

(3)将步骤(2)所得防腐剂和生物活性剂的混合溶液与步骤(1)所得聚氨 丙基双胍溶液混合，再加入适量的乳化剂，混合均匀，补水至100％，得到用于柑 橘蒂腐病防治的含有聚氨丙基双胍的保鲜剂。

其中，所述防腐剂为柠檬酸、苯甲酸盐、对羟基苯甲酸酯类及其钠盐或双乙酸 钠中的一种或几种任意比例的混合；所述生物活性剂为氯化钙、抗坏血酸钙、壳聚 糖、壳寡糖或草酸中的一种或几种任意比例的混合。

其中，所述乳化剂为聚乙二醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、丙二醇脂肪酸酯、 单甘油脂肪酸酯、双甘油脂肪酸酯、海藻酸丙二醇酯、琥珀酸单甘油、聚甘油脂肪 酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯(吐温20)、聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯(吐 温40)、聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯(吐温60)、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(吐 温80)、氢化松香甘油酯、乳酸钙、山梨醇酐单月桂酸酯(司盘20)、山梨醇酐单 棕榈酸酯(司盘40)、山梨醇酐单硬脂酸酯(司盘60)、山梨醇酐叁硬脂酸酯(司 盘65)、山梨醇酐单油酸酯(司盘80)、硬脂酰乳酸钠、硬脂酰乳酸钙、辛基酚聚 氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基苯磺酸钙、苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚系 列或烷基酚甲醛树脂聚氧乙烯醚中的一种或几种任意比例的混合。

本发明的再一目的是提供一种上述用于柑橘蒂腐病防治的含有聚氨丙基双胍 的保鲜剂的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

一种用于柑橘蒂腐病防治的含有聚氨丙基双胍的保鲜剂在防治柑橘采后蒂腐 病中的应用。

本发明所述用于柑橘蒂腐病防治的含有聚氨丙基双胍的保鲜剂的具体使用方 法如下：

刚采收或采收放置24小时后的鲜果，去除机械损伤、感染、落蒂等损伤、品 质较差果实，自来水冲洗晾干。将本发明的保鲜剂用水稀释300-1500倍，具体所需 倍数依成本、所需贮藏的时间等具体情况而定。将采收后的鲜果浸泡于已稀释的柑 橘保鲜剂中1～3分钟，或直接向果实果面喷雾，直至果面完全湿润。取出于室温， 通风处摊开晾干。用厚度为0.03mm的聚乙烯保鲜袋对处理后鲜果进行单果包装， 以保持水分，减少果间的互相影响及发病后的交叉感染。将包装后的鲜果，轻装于 纸皮果箱内，置于室温或低温条件下贮藏。

本发明的复合保鲜剂也可用于采后柑橘青绿霉、酸腐病、蒂腐病、炭疽病、黑 腐病等贮藏主要病害的防治，对蒂腐病防效好。

本发明具有下列优点和效果：

本发明的用于柑橘蒂腐病防治的含有聚氨丙基双胍的保鲜剂，是综合聚氨丙基 双胍对蒂腐病防治的研究结果开发的制备方法简单、成本低的用于柑橘蒂腐病防治 的保鲜剂。本研究表明聚氨丙基双胍在低浓度下就能有效的抑制蒂腐病菌的生长， 减少柑橘果体蒂腐病的发病率，可用于柑橘蒂腐病的防治。所述的用于柑橘蒂腐病 防治的含有聚氨丙基双胍的保鲜剂中聚氨丙基双胍对柑橘贮藏病害具广谱抑菌性， 特别是对蒂腐病防效佳，能有效清除果实表面病菌，并作用于潜伏浸染的病菌，减 少病害发生；防腐剂对表面、伤口病菌起清毒、杀菌作用，对潜伏浸染的病菌防治 效果弱，可协同聚氨丙基双胍提高保鲜剂对柑橘病害的防治效果。生物活性剂选用 了具延续衰老、诱导抗性的生物活性物质，这些物质可提高果实抗病性，抑制潜伏 浸染的病菌繁殖生长，提高果实抗氧化能力、延缓衰老进程，从而减少果实营养物 质消耗，保持果实新鲜性、食用品质。

本发明选用了聚氨丙基双胍、食品类防腐剂、生物活性成份开发柑橘保鲜剂， 完全摒弃了农用杀菌剂，确保食品安全、环境友好，具绿色、安全、环保等优点。 使用方法灵活、方便，可用于采摘前喷洒保鲜，也可用于采后果实浸泡，或采前喷 洒保鲜与采后果实浸泡配合使用。

下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明 保护范围的限制。

附图说明

图1是不同浓度的聚氨丙基双胍对壳色单隔孢属蒂腐病菌丝抑制生长的趋势 图。

图2-1至图2-3是不同浓度的聚氨丙基双胍对壳色单隔孢属蒂腐病菌丝抑制效果 图。

图3是不同浓度的聚氨丙基双胍对早熟柑橘损伤接种蒂腐病的抑制作用的趋 势图。

具体实施方式

实施例1：含聚氨丙基双胍的保鲜剂1的制备

制备方法：(1)称取15g市售聚氨丙基双胍，置于带有搅拌器的容器中，加 水搅拌1小时，溶解，得聚氨丙基双胍溶液；(2)在另一带搅拌器的容器中加入 市售苯甲酸钠10g，市售氯化钙4g，加入适量水，搅拌30分，制备均匀的混合液； (3)步骤(2)所得混合液和步骤(1)所得聚氨丙基双胍溶液混合，再加入市售 山梨醇酐单油酸酯3g，市售聚氧乙烯山梨醇酐2g，市售丙二醇6g，混合，补水 至100g，搅拌30分钟，充分乳化混合，所得产品为含聚氨丙基双胍的保鲜剂1。

所得含聚氨丙基双胍的保鲜剂1的最终配比如下：

对照例1：含聚氨丙基双胍的对照保鲜剂1的制备

制备方法：(1)称取15g市售聚氨丙基双胍，置于带有搅拌器的容器中，加 水搅拌1小时，溶解，得聚氨丙基双胍溶液；(2)再加入市售山梨醇酐单油酸酯3g， 市售聚氧乙烯山梨醇酐2g，市售丙二醇6g，混合，补水至100g，搅拌30分钟， 充分乳化混合，即得含聚氨丙基双胍的对照保鲜剂1。

所得对照保鲜剂1的最终配比如下：

实施例2：含聚氨丙基双胍的保鲜剂2的制备

制备方法：(1)称取30g市售聚氨丙基双胍，置于带有搅拌器的容器中，加 水搅拌1.5小时，溶解，得聚氨丙基双胍溶液；(2)在另一带搅拌器的容器中加入 市售双乙酸钠6g，市售抗坏血酸钙2.5g，加入适量水，搅拌30分，制备均匀的混 合液；(3)步骤(2)所得混合液和步骤(1)所得聚氨丙基双胍溶液混合，再加入 市售乙二醇3g，市售聚甘油脂肪酸酯4g，市售辛基酚聚氧乙烯醚5g，混合，补 水至100g，搅拌30分钟，充分乳化混合，得含聚氨丙基双胍的保鲜剂2。

所得含聚氨丙基双胍的保鲜剂2的最终配比例下：

对照例2：含聚氨丙基双胍的对照保鲜剂2的制备

制备方法：(1)称取30g市售聚氨丙基双胍，置于带有搅拌器的容器中，加 水搅拌1.5小时，溶解，得聚氨丙基双胍溶液；(2)再加入市售乙二醇3g，市售 聚甘油脂肪酸酯4g，市售辛基酚聚氧乙烯醚5g，混合，补水至100g，搅拌30分 钟，充分乳化混合，得含聚氨丙基双胍的对照保鲜剂2。

所得含聚氨丙基双胍的对照保鲜剂2的最终配比如下：

实施例3：含聚氨丙基双胍的保鲜剂3的制备

制备方法：(1)称取45g市售聚氨丙基双胍，置于带有搅拌器的容器中，加 水搅拌1.5小时，溶解，得聚氨丙基双胍溶液；(2)在另一带搅拌器的容器中加入 市售柠檬酸6g，壳聚糖4g，加入适量水，搅拌30分，制备均匀的混合液；(3) 步骤(2)所得混合液和步骤(1)所得聚氨丙基双胍溶液混合，再加入市售山梨醇 酐单月桂酸酯3g，市售乳酸钙4g，市售丙二醇4g，混合，补水至100g，搅拌30 分钟，充分乳化混合，得含聚氨丙基双胍的保鲜剂3。

所得含聚氨丙基双胍的保鲜剂3的最终配比如下：

对照例3：含聚氨丙基双胍的对照保鲜剂3的制备

制备方法：(1)称取45g市售聚氨丙基双胍，置于带有搅拌器的容器中，加 水搅拌1.5小时，溶解，得聚氨丙基双胍溶液；(2)再加入市售山梨醇酐单月桂酸 酯3g，市售乳酸钙4g，市售丙二醇4g，混合，补水至100g，搅拌30分钟，充分 乳化混合，得含聚氨丙基双胍的对照保鲜剂3。

所得含聚氨丙基双胍的对照保鲜剂3的最终配比如下：

实施例4：含聚氨丙基双胍的保鲜剂4的制备

制备方法：(1)称取10g市售聚氨丙基双胍，置于带有搅拌器的容器中，加 水搅拌1小时，溶解，得聚氨丙基双胍溶液；(2)在另一带搅拌器的容器中加入 市售对羟基苯甲酸乙酯钠15g，市售壳寡糖5g，加入适量水，搅拌30分，制备均 匀的混合液；(3)步骤(2)所得混合液和步骤(1)所得聚氨丙基双胍溶液混合， 再加入市售壬基酚聚氧乙烯醚8g，市售十二烷基苯磺酸钙2g，市售丙二醇4g， 市售丙三醇6g，混合，补水至100g，搅拌30分钟，充分乳化混合，得含聚氨丙基 双胍的保鲜剂4。

所得含聚氨丙基双胍的保鲜剂4的最终配比如下：

对照例4：含聚氨丙基双胍的对照保鲜剂4的制备

制备方法：(1)称取10g市售聚氨丙基双胍，置于带有搅拌器的容器中，加 水搅拌1小时，溶解，得聚氨丙基双胍溶液；(2)再加入市售壬基酚聚氧乙烯醚8 g，市售十二烷基苯磺酸钙2g，市售丙二醇4g，市售丙三醇6g，混合，补水至100g， 搅拌30分钟，充分乳化混合，得含聚氨丙基双胍的对照保鲜剂4。

所得含聚氨丙基双胍的对照保鲜剂4的最终配比如下：

实施例5：含聚氨丙基双胍的保鲜剂5的制备

制备方法：(1)称取20g市售聚氨丙基双胍，置于带有搅拌器的容器中，加 水搅拌1小时，溶解，得聚氨丙基双胍溶液；(2)在另一带搅拌器的容器中加入 市售对羟基苯甲酸甲酯钠10g，市售壳聚糖4g，市售草酸6g，加入适量水，搅拌 30分，制备均匀的混合液；(3)步骤(2)所得混合液和步骤(1)所得聚氨丙基双 胍溶液混合，再加入市售海藻酸丙二醇酯4g，市售聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂6g， 市售乙二醇4g，混合，补水至100g，搅拌30分钟，充分乳化混合，得含聚氨丙基 双胍的保鲜剂5。

所得含聚氨丙基双胍的保鲜剂5的最终配比如下：

对照例5：含聚氨丙基双胍的对照保鲜剂5的制备

制备方法：(1)称取20g市售聚氨丙基双胍，置于带有搅拌器的容器中，加 水搅拌1小时，溶解，得聚氨丙基双胍溶液；(2)再加入市售海藻酸丙二醇酯4g， 市售聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂6g，市售乙二醇4g，混合，补水至100g，搅拌30 分钟，充分乳化混合，得含聚氨丙基双胍的对照保鲜剂5。

所得含聚氨丙基双胍的对照保鲜剂5的最终配比如下：

应用效果试验：

1、聚氨丙基双胍对蒂腐病菌丝生长抑制实验

为证明本发明保鲜剂对柑橘蒂腐病的效果，通过对壳色单隔孢属(Diplodia stem-end rot)菌丝生长抑菌实验证明。利用案例处理柑橘果实，自然发病率的方法 观察本发明保鲜剂的效果。

果实为正常商业成熟度的柑橘果实，试验品种为广西产早熟蜜橘。去除机械损 伤、感染、大小和成熟度大一等外观品质不一致的果实，用自来水冲洗，在室温下 (20-25℃)晾干后备用。

壳色单隔孢属(Diplodia stem-end rot)为实验室保存菌种。壳色单隔孢属 (Diplodia stem-end rot)为黑色蒂腐病致病菌，分离于发病的柑橘果实，经菌落形 态、显微镜观察及回接实验验证。实验前，接种于PDA培养基活化、扩大，所用菌 为PDA培养6-8天的壳色单隔孢属(Diplodia stem-end rot)。

抑菌活性测定(菌丝生长速率法)：

将不同浓度的聚氨丙基双胍样品用无菌水配制成不同浓度，分别取1ml加入到 9ml已融化并冷却至50℃的PDA培养基中，充分混匀后倒人灭菌的培养皿 (Ф＝90mm)中，制成系列浓度的含药培养基，以加入等体积无菌水的PDA平板为对 照。从PDA上培养4-6天的各菌株菌落边缘打取直径5mm的菌饼，菌丝面向下， 接种于已经凝固的含药PDA培养基中央，置于28℃恒温培养箱内黑暗培养。每个 处理5次重复，试验重复2次。5天后测量供试病菌在不同浓度含药培养基上的菌 落直径，与对照比较计算各药剂处理对菌丝直线生长的抑制率。根据生物统计几率 值换算表，将抑制百分率换算成抑制几率值。以试验中设定的浓度对数为横坐标， 抑制几率值为纵坐标，计算聚氨丙基双胍的毒力回归直线方程和有效中浓度EC50。

损伤接种方法：

接种时，果实表面先用70％酒精擦拭消毒，然后用灭菌铁钉在果实赤道部位等 距离刺孔3个(深5mm，直径5mm)，然后将其在设定浓度的聚氨丙基双胍中浸泡1 分钟，对照用清水浸泡，取出后自然晾干。接入已备好的从PDA上培养4-6天的各菌 株菌落边缘打取直径5mm的菌饼，接入孔中，然后放置10-12小时，装入纸箱内， 密封，于室温20-25℃，相对湿度RH为80～95％条件下贮藏。每处理重复3次。每处 理用30个柑橘果实。

结果如下：

表1

表1是不同浓度的聚氨丙基双胍对壳色单隔孢属(Diplodia stem-end rot)蒂腐病 菌丝生长的影响的数据表。

根据该表数据绘制趋势图，得图1：不同浓度的聚氨丙基双胍对壳色单隔孢属 (Diplodia stem-end rot)蒂腐病菌丝抑制生长的趋势图。

同时对空白组0mg/L(空白对照)、浓度为25mg/L、浓度为50mg/L的两个试验组 的结果进行拍照，分别得到图2-1、图2-2和图2-3：不同浓度的聚氨丙基双胍对壳色 单隔孢属(Diplodia stem-end rot)蒂腐病菌丝抑制效果图。

根据图1可以看出，当聚氨丙基双胍的浓度为10mg/L时，对蒂腐病菌的抑菌 率为43.27％；浓度越大，对蒂腐病的抑菌作用越大，浓度与抑菌率呈正相关性，当 浓度达50mg/L时，抑菌率92.86％，可有效控制蒂腐病原生长。通过统计分析，可 知聚氨丙基双胍对蒂腐病菌对EC50为14.04，表明聚氨丙基双胍能很好的抑制蒂腐 病菌丝的生长，对柑橘蒂腐病的防治具巨大的应用价值。

2、不同浓度的聚氨丙基双胍对蒂腐病的防治应用实验

如图3所示，不同浓度的聚氨丙基双胍对柑橘损伤接种蒂腐病的抑制作用的趋 势图，柑橘果实损伤接种4天后，对照组发病率为100％，不同浓度的聚氨丙基双胍 处理的柑橘蒂腐病发病率都显著低于对照(P﹤0.05)；不同浓度间，浓度越高，发 病率越低，对蒂腐菌抑制作用越明显。400ppm与600ppm处理间蒂腐病发病率差异 最大，差异极显著(P﹤0.01)；浓度大于600ppm的处理，临近浓度间的发病率差异 小，1000ppm与600ppm差异不明显(P﹥0.05)，即当使用浓度大于600ppm，继续提 高使用浓度对蒂腐病防治效果影响较小。

3、本发明实施例保鲜剂和对照例对柑橘蒂腐病的防治效果

用下述方法处理柑橘果实：

采收放置24小时后的柑橘鲜果，去除机械损伤、感染、落蒂等损伤、品质较 差果实，自来水冲洗晾干。将本发明的含聚氨丙基双胍的保鲜剂用水作300～600 倍稀释，搅拌均匀后。将鲜果浸泡于稀释液2～3分钟，取出于室温24小时通风摊 晾。用厚度为0.03mm的聚乙烯保鲜袋对处理后鲜果进行单果包装，以保持水分， 减少果间的互相影响及发病后的交叉感染。将包装后的鲜果，轻装于纸皮果箱内， 室温20-25℃，相对湿度为80-95％条件下贮藏。

引起早熟蜜橘腐烂的主要病害为蒂腐病、炭疽病，这也是实例实验选择早熟蜜 橘的原因，以便观察统计对蒂腐病的防治效果。分别用本发明实施例1～5及相应对 照实施例1～5制备的保鲜剂进行处理，每处理用果30kg,以清水处理为空白，室温 20-25℃，相对湿度为80-95％条件下贮藏30天后自然腐烂及发病情况。

清水空白贮藏30天后腐烂率为25.6％，其中蒂腐病发病率18.9％，具体结果如表 2所示。结果进一步证实了：1、聚氨丙基双胍对柑橘病害具广谱性，减少柑橘贮藏 发病腐烂，且可用于蒂腐病防治，降低蒂腐病的发病率。2、聚氨丙基双胍与防腐 剂和生物活性剂具协同增效作用，可提高对病害的防治能效。实施例1～5中的柑橘 食用品质明显优于相应对照实施例1～5，能更好地保持果实的新鲜性。

表2

  腐烂率(％) 蒂腐病(％) 清水空白 25.56 18.89 对照例1 13.56 5.39 对照例2 9.9 5.21 对照例3 10.12 3.54 对照例4 15.68 6.73 对照例5 13.24 5.41 实施例1 11.11 3.33 实施例2 7.68 2.75 实施例3 5 1.11 实施例4 9.52 3 实施例5 8.9 2.5