一种向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的方法及相关的叶绿体基因组序列

摘要

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体的说是一种向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的方法及相关的叶绿体基因组序列。基因序列包括SEQID NO:1所示的序列、SEQ ID NO:2所示的序列以及插入两者之间的外源基因。具体方法通过电穿孔法将包括SEQ ID NO:1所示的序列、SEQ ID NO:2所示的序列以及插入两者之间的外源基因的叶绿体转化载体导入微拟球藻细胞。本发明提供了根据七株微拟球藻叶绿体基因组之间的保守基因以及微拟球藻叶绿体和硅藻或褐藻叶绿体基因组的保守基因，可以用于设计构建在微拟球藻中通用的叶绿体遗传改造体系以及多个种属单细胞微藻通用的叶绿体遗传改造体系。

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体的说是一种向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的方法及相关的叶绿体基因组序列。 

技术背景

能源和资源短缺已经成为制约我国经济持续发展、影响我国国家安全的重大战略问题。基于生物催化剂清洁、高效、可再生等特点，生物制造可以大大减少工业发展对化石资源依赖，减少能耗、物耗、水耗和废弃物排放，显著提高经济效益，增强市场竞争力。与石化路线相比，生物制造可以平均节能30-50%，减少人类对环境的影响达20-60%。太阳光是地球上最充足的清洁能源。光合作用是唯一能捕捉太阳能的生物途径,还可以固定二氧化碳，因此是实现利用太阳能与大幅减排CO₂进行清洁能源生产的有效途径。 

微藻是最有潜力实现现实意义上的光能整合生物制造的细胞工厂之一，其优势在于：第一、高效光能转化生物质：微藻（包括原核蓝藻和真核藻类），和绿色高等植物一样，有比较完整的光合作用系统。微藻的理论光合作用效率最高可达10%。相比而言，陆生作物一般仅能将0.1~0.7%（C3作物）或1.5~2.5%（C4作物）的太阳能转化为生物质。可见，微藻作为光能整合生物加工细胞工厂的优势远大于陆生植物。此外，一些微藻具备出色的环境耐受能力，可以在淡水、海水、生活废水、工业废水中生长；在通入烟道气时强劲生长，能够室外规模培养。第二、高效CO₂固定：微藻遍布于地球海洋、河流和湖泊等淡水和海洋水体中以及各种土壤（包括酷暑和寒冷的荒芜环境）里，甚至人迹罕至的南北极等极端环境中。每年由微藻光合作用固定的二氧化碳占全球二氧化碳固定量的40%以上，在能量转化和碳元素循环中起到重要的作用。大规模微藻培养有望实现工业化方式固定太阳能和大幅度减排CO₂，提供低碳的清洁能源。第三、高效积累高能量密度、高附加值产物：微藻代谢途径丰富，以微拟球藻为例，它不仅可以在静止状态下大量积累油脂（甘油三酯，即生物柴油），还可以积累微藻蛋白（藻蓝蛋白、饲料蛋白、必需氨基酸）、长链多不饱和脂肪酸（AA、EPA、DHA）、多种色素（虾青素、胡萝卜素、叶黄素）等高附加值产物，可以用于开发颜料、肥料、土壤调节剂、抗氧剂、食品添加剂、化妆品。 

海洋微拟球藻（Nannochloropsis sp.)，是一种海洋单细胞微藻，在分类学上归属于褐藻门(Phaeophyta)，大眼藻纲(Eustigmatophyceae)，单珠藻科（Monodopsidaceae）。微拟球藻直径2-5μm，无组织分化，生态分布广泛； 具有丰富的在藏藻株资源；进化地位独特，是单细胞微藻中独立的一个属。有研究比较了31种微藻的生物量、脂质含量及产量，其中海洋微藻Nannochloropsis的脂质产量排在第一位（表1）。已发现许多株Nannochloropsis都具有1）生长迅速；2）在高光强或营养缺失条件下积累大量三脂酰甘油（TAG）等优点。此外，在一些大型（如美国Solix公司）和半工业规模（亚利桑那州立大学、中国科学院青岛生物能源与过程研究所）室外培养中发现，当通入烟道气时，Nannochloropsis（如Nannochloropsissalina和Nannochloropsis oculata OZ-1）能强劲生长，且能在生长静止期积累大量的油脂，具备大规模工业化培养的潜力。此外，微拟球藻藻体微小，富含碳水化合物、蛋白质和多不饱和脂肪酸，已被作为优良饵料大量应用于水产养殖；微拟球藻还含有多种经济价值较高的色素，如玉米黄素、斑蝥黄素和虾青素等。可见，微拟球藻作为功能基因组学研究和商业化应用具有明显的优势。 

表1代表性藻种生物量积累、油脂含量和油脂产量 

尽管微拟球藻用于光能整合生物加工的优势明显，但其经济可行性仍面临着巨大挑战，主要的技术瓶颈包括微藻生长密度低，且仅在环境胁迫条件下积累油脂等。其在正常生理状态下，积累长链（C16和C18）和极长链（C20、C22、C24和C26）脂肪酸，中短链脂肪酸含量低，造成其生产的生物柴油浊点高、易氧化，且长链脂肪酸的积累对微藻中性脂合成产生抑制，这些因素都成为制约微拟球藻用于光能整合生物生产的关键瓶颈。 

另一方面，随着微藻生物技术的发展，微拟球藻用于构建高效微藻反应器（生产高值蛋白、油脂、色素、抗菌肽）、开发口服型渔药等方面具有独特优势。然而，微拟球藻基因工程的缺失，严重制约了微拟球藻作为生物反应器在实践中的应用。 

在能进行光合作用的真核细胞中，细胞核、叶绿体和线粒体三种细胞器各含有一套DNA分子，构成了既独立又相互联系的遗传体系。自20世 纪70年代基因工程技术诞生以来，向细胞核导入外源基因的转化技术已经得到普遍应用。然而随着研究的深入发展，人们逐渐认识到核基因组中的基因工程操作有着如下难以克服的困难：1.细胞核基因组庞大，背景复杂；2.导入的外源基因随机插入到核基因组中；3.外源基因表达效率低，且表达不稳定；4.有时外源基因的插入会引起其他性状的变异，从而影响其经济价值；5.安全性不好，外源基因容易扩散等。这些问题严重制约着外源基因转化技术的改进及其在实践中的应用。 

叶绿体转化技术可以克服以上缺点。1988年，Boynton等构建了莱茵衣藻的叶绿体稳定转化体系，首次证明了叶绿体转化的可行性（Boynton等，Science,1988）。在此之后，叶绿体转化技术被成功的应用于烟草等高等植物（Svab等，Proc Natl Acad Sci，1990）。与核转化相比，叶绿体转化技术具有如下特点：1.外源基因可以定向插入；2.外源基因表达效率高、变异小；3.叶绿体基因组属于原核表达系统，多个基因形成多顺反子，可以实现同时表达；4.生物安全性高。 

叶绿体转化系统包括以下两个关键因素：一是合适的叶绿体转化载体；二是有效的载体导入细胞方法。合适的叶绿体转化载体包括同源片段、选择标记基因和具备叶绿体启动、终止功能的调控序列。叶绿体转化基于同源重组的原理，叶绿体表达载体中，外源基因两侧各具有一段叶绿体的同源片段，长度约1Kb，较长的同源片段有利于同源重组的发生。同时，为了防止外源基因插入引起的致死效应和重要序列的丢失，还应选择合适的插入位点。此外，叶绿体基因组的拷贝数很高，需要建立高效的选择系统，如抗生素和除草剂等筛选，使叶绿体转基因细胞实现同质化，因而选择标记基因是影响叶绿体转化效率的关键因素。外源基因需要能够在叶绿体中起作用的启动子和终止子，来保障外源基因整合后在叶绿体中的稳定高效表达。 

常用的有效的将载体导入叶绿体基因组的方法是基因枪法（Gene gun），该方法首先在衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中成功实现了叶绿体基因组的转化，之后被广泛应用于高等植物和藻类的叶绿体遗传改造中。其基本原理是通过动力系统将带有靶基因DNA的金属颗粒（金粒或钨粒），以一定的速度射进细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。微弹耗材往往采用钨粉或金粉，两者相比较，金粉可能比钨粉对细胞的伤害与毒性更小，且颗粒大小一致。钨粉比较便宜，但对某些细胞可能有毒害作用。因此，金粉往往被用于叶绿体转化中，常用金粉的直径为4μm，更小的直径不易制备，且小直径金粉会因空间阻力，在轰击的过程中发生漂移。然而，此种大小的金粉在微藻叶绿体遗传改造的应用中，存在着无法逾越的障碍。多数单细胞微藻，直径较小，过大的金粉子 弹对细胞造成不可修复的创伤，无法有效的筛选获得转化子。如微拟球藻直径为2~5μm，叶绿体直径仅为1μm左右，采用基因枪法根本无法实现对其叶绿体的基因工程改造。电穿孔法（Electroporation）是将外源基因通过电场作用，导入目标组织。其原理是直流电场作用的瞬间，细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道，这种通道能维持几毫秒到几秒，然后自行恢复。在此期间生物大分子如DNA可通过这种微小的通道进入细胞。该方法原理简单，可有效导入外源基因，且效率较高，相对其它物理和化学转化方法，是一种有价值和有效的替代方法。在单细胞微藻基因工程中，尤其是叶绿体转化中，电穿孔法是唯一有效的途径。然而，该方法尚未被用于单细胞微藻叶绿体遗传改造中。 

在微拟球藻中建立叶绿体遗传转化技术可以为其遗传改造提供有力的工具，将可能从根本上突破生物质能源与材料等新兴产业的遗传资源瓶颈。工程藻株有望在构建高效微藻反应器（生产高值蛋白、油脂、色素）、开发口服型渔药等方面发挥独特优势。此外，微拟球藻叶绿体遗传转化体系的建立可以推动对于其功能基因组学方面的研究。叶绿体稳定表达技术的关键是实现外源基因在叶绿体基因组中的整合与稳定表达。微拟球藻细胞中有一个杯型叶绿体，这一结构也有利于叶绿体转化体系的建立。但是目前还没有关于微拟球藻叶绿体基因组序列和以微拟球藻叶绿体为对象进行遗传转化的报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的方法及相关的叶绿体基因组序列。为实现上述目的本发明采用技术方案为： 

一种向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的序列，基因序列包括SEQ IDNO:1所示的序列、SEQ ID NO:2所示的序列以及插入两者之间的外源基因。 

所述基因序列包括SEQ ID NO:1所示微拟球藻叶绿体基因组中的等效序列、SEQ ID NO:2所示微拟球藻叶绿体基因组中的等效序列以及插入两者之间的外源基因。所述外源基因为一个或多个基因。 

所述基因序列具有叶绿体表达适用的启动子、终止子和选择标记的DNA片段。 

利用向微拟球藻叶绿体中导入外源DNA的基因序列导入外源DNA的方法，通过电穿孔法将包括SEQ ID NO:1所示的序列、SEQ ID NO:2所示的序列以及插入两者之间的外源基因的叶绿体转化载体导入微拟球藻细胞。 

通过电穿孔法将包括SEQ ID NO:1所示微拟球藻叶绿体基因组中的等效序列、SEQ ID NO:2所示微拟球藻叶绿体基因组中的等效序列以及插入两者之间的外源基因的叶绿体转化载体导入微拟球藻细胞。 

本发明方法成功构建了微拟球藻的叶绿体表达系统。通过本发明能够有效的将外源基因重组到微拟球藻的叶绿体基因组中，并通过筛选获得转基 因突变藻株。 

与现有技术相比，本发明实现了微拟球藻基因工程技术的重点突破，具有如下有益效果： 

1.本发明利用两段来源于微拟球藻叶绿体基因组序列的同源重组片段，构建叶绿体定点转化载体，转化载体可以将外源基因导入微拟球藻叶绿体，并使之在微拟球藻叶绿体中高效稳定的表达。 

2.本发明提供用于微拟球藻叶绿体改造的叶绿体基因组图谱和序列。利用叶绿体基因组序列可以阐释与光合作用密切相关的一些蛋白、酶和相关调控机理，并用于改良生物（如植物、微生物（如细菌、古细菌、蓝藻、单细胞真核微藻等））的农艺性状（提高光能吸收和转化效率等）。 

3.本发明提供了多株微拟球藻叶绿体基因组之间的保守序列以及微拟球藻和硅藻或褐藻叶绿体基因组的保守序列，可用于构建微拟球藻属通用的叶绿体遗传改造体系或适用于多个种属单细胞微藻的通用的叶绿体遗传改造体系。 

4.本发明能将外源基因定点整合到微拟球藻的叶绿体基因组上，并能实现外源基因的稳定表达，利用单细胞微拟球藻荧光诱发下的生理特性，采用绿色荧光蛋白GFP基因用于叶绿体转化体系的构建。 

5.本发明利用微拟球藻对博来霉素的敏感性，采用一种可行的选择标记基因-选择压力组合（ble基因-博来霉素）用于叶绿体转化体系的构建。 

6.本发明能使外源基因在微拟球藻叶绿体中高效表达，并能大量积累目的蛋白、生物制剂（生长素、干扰素、血清蛋白、胰岛素等）和疫苗（霍乱、狂犬病、炭疽病、破伤风、阿米巴等）。 

7.利用本发明构建的转基因工程微藻，可具备更加优越的规模培养性状，如抗虫性、抗病性、抗盐耐旱、抗除草剂等。可用于设计与构建针对特定工程微藻的低成本高光效的反应设施，降低规模培养成本。 

8.利用本发明，可移植和构建生产类萜、长链烃、长链脂肪醇化合物的生物元件与模块，建立细胞工厂用于生产长链烃、长链脂肪醇、色素、蛋白质等高能量密度碳氢燃料。获得光能利用与固碳效率提高和产品途径优化且可控的新型光合生产细胞工厂。 

9.微拟球藻积累高附加值底物（虾青素、植物甾醇、二十二碳六烯酸），借助本发明构建的转基因工程微藻，可以进一步提高高附加值底物的含量。 

10.微拟球藻具有光合效率高、繁殖快、环境适应性强的特点，借助本发明构建的转基因工程微藻，可以进一步提高其光合效率，从而可以有效的固定二氧化碳，降低大气中二氧化碳的浓度。 

11微拟球藻核基因组序列已经测定，借助本发明可以对微拟球藻进行功能基因组学研究。 

附图说明

图1为本发明实施例提供的微拟球藻总蛋白浓度测定图。 

图2为本发明实施例提供的微拟球藻限制-修饰系统鉴定图（其中，微拟球藻总蛋白对质粒p124S和pGenD无任何酶切效果，可见，微拟球藻中不存在限制性酶切系统。）。 

图3为本发明实施例提供的微拟球藻在不同电压下的致死率图（其中，分别以0v/cm，600v/cm，900v/cm，1100v/cm，1300v/cm，1600v/cm，进行电击，其中电容设置为50μF，每个处理3个平行。）。 

图4为本发明实施例提供的微拟球藻OZ-1叶绿体基因组物理图谱。 

图5为本发明实施例提供的多株微拟球藻叶绿体基因组保守基因以及微拟球藻和硅藻或褐藻叶绿体基因组的保守基因。 

图6本发明实施例提供的质粒pXJ01物理图谱。其中，同源整合位点为光非依赖性的原叶绿素酸酯还原酶（light-indepen-dent protochlorophyllidereductase）chlL基因；启动子为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulosebisphosphate carboxylase oxygenase）大亚基rbcL的5’-UTR；终止子为叶绿体psbA的3’-UTR。 

图7为本发明实施例提供的转基因微拟球藻荧光显微镜图（其中，（a）~（d）为458nm激发光下图片；（e）可见光下图片。）。 

图8为本发明实施例提供的转基因微拟球藻激光共聚焦图（其中，（a）采集红色光；（b）采集绿色光；（c）同时采集红色和绿色光。）。 

具体实施方式

本发明获得的微拟球藻叶绿体转化藻株，是指利用电击法或其他直接导入方法，将含有本发明的微拟球藻叶绿体同源重组片段的载体导入微拟球藻叶绿体中，通过同源重组，将带有外源基因的DNA片段定点插入到微拟球藻叶绿体基因组中。 

导入外源DNA的方法： 

（1）利用SEQ ID NO:1所示的序列或其约1Kb的叶绿体基因组等效序列、SEQ ID NO:2所示的序列或其约1Kb的叶绿体基因组等效序列和外源基因构建DNA重组片段；（2）将DNA重组片段插入一种克隆载体中；（3）将重组质粒导入微拟球藻细胞；（4）同质化筛选获得转基因微拟球藻。 

所述带有外源基因的重组DNA片段具有叶绿体适用的启动子、终止子和选择标记； 

所述的用于构建叶绿体载体的SEQ ID NO:1，2的等效序列包括依据微拟球藻叶绿体基因组序列所设计的适用于叶绿体同源重组的基因间隔区、假基因区、功能庸余区、重复片段区等所有被重组后既不引起原有叶绿体基因组重要序列丢失，又不致干扰临近基因正常功能的区段。 

所述的用于构建叶绿体载体的SEQ ID NO:1，2的等效序列包括依据微拟球藻叶绿体基因组序列所设计的适用于叶绿体同源重组的功能基因区等可用于功能基因组学研究的位点。 

所述的用于构建叶绿体载体的克隆载体是已知的任何一种克隆载体，如pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pBluescript SK等）。 

所述的用于构建叶绿体载体的启动子包括微拟球藻叶绿体基因组来源的rbcL启动子以及所有具备叶绿体启动功能的DNA序列。 

具备叶绿体启动功能的DNA序列包括植物、微藻、病毒、原核微生物等来源的所有具备叶绿体启动功能的DNA序列。 

所述的终止子包括微拟球藻叶绿体基因组来源的psbA终止子以及所有具备叶绿体终止功能的DNA序列。 

所述的具备叶绿体终止功能的DNA序列包括微拟球藻核基因组、叶绿体基因组以及植物、微藻、病毒、原核微生物等来源的所有具备终止功能的DNA序列。 

所述的选择标记的DNA片段包括绿色荧光蛋白GFP基因以及所有具有指示作用的报告基因。 

所述的选择标记的DNA片段包括博来霉素抗性基因ble基因以及所有对应于微拟球藻敏感的抗生素、农药的基因。 

所述的选择标记的DNA片段包括可以回复微拟球藻突变株原始性状的基因编码序列。 

所述的用于叶绿体转化的外源基因是任意的目的基因，可以是一个基因或者多个基因；如编码高值蛋白、动物疫苗的基因；编码调控微拟球藻生长、代谢、光合作用或高附加值底物（中性脂、虾青素、二十二碳六烯酸）积累的调控因子、蛋白或酶。 

下面结合实施案例对本发明的方法及该方法所达到的效果作进一步详细说明。 

实施例：实现绿色荧光蛋白GFP基因在微拟球藻叶绿体中的稳定表达 

一、微拟球藻限制修饰系统的验证 

细菌细胞中具有专一性的限制性核酸内切酶用于对抗噬菌体的入侵，该系统被成为限制修饰系统。蓝藻中也存在该系统。单细胞真核微藻进化地位独特，是否也存在类似的限制修饰系统。为此，采用如下步骤进行验证： 

（1）微拟球藻总蛋白提取：培养微拟球藻至对数期，5000g，10min，4℃收集藻体；5ml PENA溶液（10mM K3PO4,10mM EDTA,50mM NaCland a teblet of aprotinin per 50ml,pH 7.0）漂洗2遍；将藻体重悬于1ml PENA溶液；加入100mg玻璃珠，剧烈涡旋1min；4000g，15min，4℃离心;取上清，加入等体积甘油和1/5体积1mg/ml牛血清蛋白，-20℃保存备用。 

（2）微拟球藻总蛋白浓度测定：绘制标准曲线；10倍稀释微拟球藻总蛋白储液；测定稀释液OD260；计算出蛋白浓度为30mg/L（图1）。 

（3）载体DNA制备：BamHI 37℃消化p124S 4h，XbaI 37℃消化pGenD4h；采用PCR产物回收试剂盒（Qiagen公司）回收片段。 

（4）微拟球藻总蛋白消化处理线性化p124S和pGenD载体： 

酶切体系如下：微拟球藻总蛋白悬液Xμl，Fermentas buffer(fast digest)1μl，线性化载体（6μg/μl）0.5μl，用dd H₂O补齐至10μl。 

经37℃过夜处理，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果。如图2所示，微拟球藻总蛋白对质粒p124S和pGenD无任何酶切效果，可见，微拟球藻中不存在限制性酶切系统，无需对用于转化的的载体进行修饰保护。图2中各泳道对应的酶切体系如下表。 

质粒 5μl 3μl 1μl 1μl(10倍稀释液) 1μl(100倍稀释液) p124S ① ③ ⑤ ⑦ ⑨ p124S ② ④ ⑥ ⑧ ⑩ pGenD a c e g i pGenD b d f h j

二、微拟球藻叶绿体基因组测定及拼接 

利用第二代测序技术Illumina测定了7种不同种、同种不同属微拟球藻N.oceanica OZ-1，N.oceanica CCMP531，N.granulata CCMP529，N.oculataCCMP525，N.limnetica CCMP505，N.gaditana CCMP527，和N.salinaCCMP537的叶绿体基因组序列（表2），通过PCR和传统的Sanger测序法对所拼接序列进行了大规模的验证，证实了拼接序列的可靠性和准确性，并补齐了缺口，拼接后采用Dogma注释，并进行人工校正。 

表2不同微拟球藻叶绿体基因组序列信息 

种属 大小(bp) G+C含量(％) 基因数目 tRNAs数目 N.oceanica OZ-1 117548 33.6 122 28 N.oceanica CCMP531 114614 33.0 121 28 N.granulata CCMP529 116056 33.2 122 28 N.oculata CCMP525 110774 32.7 115 26 N.limnetica CCMP505 89751 33.0 92 20 N.gaditana CCMP527 117548 33.6 122 28 N.salina CCMP537 107159 33.1 122 28

三、微拟球藻两段叶绿体同源重组片段的扩增与克隆 

设计并合成如下两对引物，其中引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的扩增产物是SEQ ID NO:1；引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的扩增产物是SEQ ID NO:2。 

以微拟球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4进行PCR扩增，反应程序为：94°C 5min预变性；94°C 30sec，58°C 30sec，72°C 1min，共30个循环；72°C 7min延伸。PCR扩增产物约为952bp，即为片段SEQ ID NO:1，纯化PCR产物，连接于pMD-18T载体，转化大肠杆菌，提取重组质粒，用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，与经过同样酶切的 pBluescript SK载体连接，获得含有片段SEQ ID NO:1的重组质粒pSK-1。 

以微拟球藻基因组总DNA为模板，经引物SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6进行PCR扩增，反应程序为：94°C 5min预变性；94°C 30sec，58°C30sec，72°C 1min，共30个循环；72°C 7min延伸。PCR扩增产物约为1038bp。即为片段SEQ ID NO:2，纯化PCR产物，连接于pMD-18T载体，转化大肠杆菌，提取重组质粒，用BamHI和Sac Ⅰ酶切，与经过同样酶切的pSK-1连接，获得含有片段SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的重组质粒pSK-2。 

SEQ ID NO:1 

5’-GTAAACCAAGGTCGTTCTCCAGTTGGTAAACGTGATGCTTCAATTGGTGGAAACCCAAACCCAGCTTCTTTAAAGTTTCAATCAAATACCTAGAATTTATTTCTAGATAGTATTAAAATACATCTTAATTCATATCCTTTTACTTTTACTTGAAGGGTATGATCTTAGGAGAGATGGCAGAGTGGTCGATTGCGTCTGACTTGAAATCAGAAGAACTAGGAATGGTTCCGTGGGTTCGAATCCCACTCTCTCTTCTCAATATTTTTATTAAAAATATAGGTTGATTCTTTTGATTTAACTTTTTTCTATTAAAATATCTAATAGAACATTTCAAAAGTATTGTTTGGTTAACCTAAACCAGTTTATAATCTTTTAACTAAAGAGGTATATATGTTAGTACTAAAAATAGCAGTTTACACAGTTGTTAGCTTTTTCGTTTATCTATTTTGGTTTGGATTTATTTCAAATGACCCGTCACGTAACCCTACACAGAATATTAATAACTAATTAAAAGTTTGGTATTTATCATAAGGCATATTAAATAAATAGAAATAATGCGCCTTATGATAAACGTAAATAAGTGCTATATATAAATAAAAGGGCAGTTAGCTCAGCGGTAGAGCTTCTGCCTTACAAGCAGAAGGCCACAGGTTCAAATCCTGTACTGCCCATAGGGCTCATCGTCTAAGGGATTAGGACAGAAACCTTCTAAGTTTCTAATGTAGGTTCGAATCCTACTGGGCCTAAGACGTACTGAGTATAAAAAATTAAACATGATATTTTAAGGGTTACAGATAAACAAATGTTTTTGAGAAGATACTCTTTACTCCCAGAATTTAAATACTAGTTGTCTGATTTTTTAACTCTGACACTCTAGACCTTATATTATAGTATTTTATGAGCAATTTATAAAAAATAAATTTGCGGTTACTTCTAGGAG

（a）序列特征： 

●长度：940bp 

●类型：碱基序列 

●链型：单链 

●拓扑结构：线性 

（b）分子类型：双链DNA 

（c）假设：否 

（d ）反义：否 

（e）最初来源：微拟球藻 

（f）特异性名称：光非依赖性的原叶绿素酸酯还原酶(light-indepen-dentprotochlorophyllide reductase)chlL 5’端序列 

SEQ ID NO:2 

ATCCGAAGCATGATAGCACTTTTACATTAACAGGATTTTTAATTCCAACAATTATTGATACATTACAAGTCAAAGATTACCACTATGAGGATGTTTGGCCTGAAGATGTAATTTATAGAGGATTTAATGGTGTAGATTGTGTTGAGCTGGTGGACCGCCAGCTGGAGCTGGTTGTGGTGGTTACGTCGTTGGTGAAACTGTTAAACTTTTAAAAGAGCTTAATGCATTTGATGAATACGATGTTATTCTTTTTGATGTATTAGGTGATGTAGTTTGCGGTGGATTTGCAGCACCATTGAATTATGCGGATTACTGTTTAATTGTTACAGACAATGGCTTTGATGCCTTATTTGCCGCAAATAGAATTGCAGCTTCGGTTCGCGAAAAAGCTAGGACTCACAGTTTAAGATTAGCTGGTTTAATAGGTAATCGAACTGCAACACGTGATTTAATTGTAAATATATTCAAACTGTACCAATCCCAGTTCTTGAAGTTTTGCCACTAATTGAAGATATACGGGTTTCAAGAATTAAAGGTAAAACGCTTTTTGAGATGTCTATAATTGATCCCTCATTGGGTACATTTGTGATTATTACTTAAATATTGCAGATCAACTTATAGCTAACCAGAAGGTGTAATTCCAAAAGAATCAGCTGATCCGTGAATTATTTACTCTTTTATCTGATTTTTATTTAAAACCCTCGGATACAGAACAAAATTTAGACAATATGGAGATGAATCTTTTTAATAATTAAATTACGTCTTAATGAATAAAAAAATTAAAAAGGAATTTAAATAATATGAATACAGAACAAGGTTCATTAATTAATTCTAATTCCATT ACTTTTGAATGCGAAACTGGTAATTATCATACATTTTGTCCTATAAGTTGTGTTGCTTGGTTATATCAAAAAATTGAAGACAGTTTCTTTTTGGTAATTGGAACAAAAACGTGTGGCTATTTCTTACAGAATGCATTAGGGGTAATGATATTTGCTGAACCAAGGTACGCAATGGCTGAACTTGAAGAAGCTG-3’ 

（a）序列特征： 

●长度：1038bp 

●类型：碱基序列 

●链型：单链 

●拓扑结构：线性 

（b）分子类型：双链DNA 

（c）假设：否 

（d）反义：否 

（e）最初来源：微拟球藻 

（f）特异性名称：光非依赖性的原叶绿素酸酯还原酶(light-indepen-dentprotochlorophyllide reductase)chlL 3’端序列 

SEQ ID NO:3 

ggtaccgtaaaccaaggtcgttctcca 

SEQ ID NO:4 

ctcgagctcctagaagtaaccgcaaat 

SEQ ID NO:5 

ggatccatccgaagcatgatagcactt 

SEQ ID NO:6 

gagctccagcttcttcaagttcagcca 

四、含有绿色荧光蛋白基因（gfp）的微拟球藻叶绿体定点转化载体pXJ01的构建 

载体pXJ01的构建是以上述重组质粒pSK-2为基础的。具体构建过程如下。（1）设计并合成引物。其中，引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的扩增产物是5’rbcL序列，为来源于微拟球藻叶绿体的具有叶绿体启动功能的启动子；引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的扩增产物是gfp基因，为绿色荧光蛋白基因；引物SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的扩增产物是3’-psbA，为来源于微拟球藻叶绿体的具有叶绿体终止功能的终止子。（2）HindIII和XhoI双酶切pSK-2和PCR产物5’rbcL，纯化酶切产物后,过夜连接，转化大肠杆菌，提取重组质粒，命名为pSK-3。（3）用EcoRV和HindIII双酶切pSK-3和PCR产物gfp，纯化酶切产物后，过夜连接，转化大肠杆菌，提取重组质粒，命名为pSK-4。（4）用EcoRV和EcoRI双酶切pSK-4和PCR产物3’-psbA，纯化酶切产物后，过夜连接，转化大肠杆菌，提取重组质粒，即为pXJ01（参见序列表3）。 

SEQ ID NO:7 

ctcgaggcttacttattagccaccacctaca 

SEQ ID NO:8 

aagcttttaggactccttttatatagcagtaaa 

SEQ ID NO:9 

aagcttatggtgagcaagggcgagga 

SEQ ID NO:10 

gatatcttacttgtacagctcgtccatgcc 

SEQ ID NO:11 

ggatccccgtatctaatgttcttccag 

SEQ ID NO:12 

gagctcaattggtcaccctgatggtat 

五、电穿孔法参数优化 

微拟球藻OZ-1（Nannochloropsis OZ-1）接种于f/2培养液中,25°C通气培养至至对数生长早期（1-3×10⁷cells/mL），6000g离心5min，弃上清，375mM山梨醇漂洗2次，用山梨醇调整细胞浓度到2×10⁸cells/mL。将浓缩藻体分装为200μl的小份，每份加入1μl变性处理的鲑鱼精DNA（15μg/mL，95°C处理1分钟)，混匀后冰置10分钟。将混合物转移入电击杯，分别以0v/cm，600v/cm，900v/cm，1100v/cm，1300v/cm，1600v/cm，进行电击，其中电容设置为50μF，每个处理3个平行。电击后立即将藻体转移入5mL新鲜f/2培养基。25℃摇床中100rpm，弱光复苏48小时。涂布于f/2平板。3周后可见藻落，计算致死率（图3），其中，半致死电压约为1100v/cm。 

六、电穿孔法将质粒pXJ01导入微拟球藻 

取浓度约为1-3×10⁷cells/mL的对数生长期的微拟球藻藻液OZ-1（Nannochloropsis OZ-1），6000g离心5min，弃上清，375mM山梨醇漂洗2次，用山梨醇调整细胞浓度到2×10⁸cells/mL。将浓缩藻体分装为200μl的小份，每份加入3μg线性化载体pXJ01和1μl变性处理的鲑鱼精DNA（15μg/mL），混匀后冰置10min。将混合物转移入2mm电击杯，以2200V（HV），50μF进行电击，电击后立即将藻体转移入5mL新鲜f/2培养基。25℃摇床中100rpm，弱光复苏48h。 

七、叶绿体转化藻株的观察 

经过恢复培养的微拟球藻细胞，用f/2稀释至10⁴个/mL，取10μl在荧光显微镜下观察。其中，激发光波长为458nm。如图7，野生型藻株因其叶绿素自发荧光而呈现红色，转化子因表达有绿色荧光蛋白而发出强烈的绿色荧光。 

经过恢复培养的微拟球藻细胞，用f/2稀释至10⁴个/mL，取10μl在激光共聚焦显微镜下观察。其中，激发光波长为458nm。如图8a，仅采集红色光时，视野中所有微藻细胞均呈现红色，此为叶绿素自发荧光；如图8b仅采集绿色光时，视野中仅三个细胞呈现绿色，此为绿色荧光蛋白发出的荧光；如图8c同时采集红色和绿色光时，视野中多数细胞呈现红色，仅有三个细胞呈现黄色，红色为叶绿色自发荧光，黄色为叶绿色自发红色荧光和绿色荧光蛋白绿色荧光叠加而成。这表明在一些阳性藻株中，pXJ01已经整合到叶绿体基因组中，且绿色荧光蛋白已成功表达。 

另外，根据不同微拟球藻的特性，结合本发明提供的用于转化的方法 和DNA，能够将不同特性的外源基因插入SEQ ID NO:1所示的序列与SEQID NO:2所示的序列之间，而后整合至微拟球藻中，可使本发明得到更高的利用。 

即微拟球藻是进行生物柴油炼制的理想之选，借助本发明构建的转基因工程微藻，可以进一步提高其油脂积累，推动微藻柴油的产业化进程；另外，微拟球藻是积累高附加值底物（虾青素、二十二碳六烯酸），借助本发明构建的转基因工程微藻，可以进一步提高高附加值底物的含量；更加上微拟球藻核基因组和叶绿体基因组序列已经测定，借助本发明可以在微拟球藻对其进行功能基因组学研究；此外，微拟球藻non-coding RNA组序列已经测定，借助本发明可以在微拟球藻中对其进行功能基因组学研究； 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。