抗中国东亚钳蝎蝎毒F(ab’)2抗体制备及其使用方法

摘要

本发明涉及一种抗中国东亚钳蝎蝎毒F(ab’)2抗体制备及其使用方法，本发明的抗体与山西产BMK蝎毒在2:1(M:M)时可保护小鼠100％存活；与辽宁产BMK蝎毒在0.5:1(M:M)时可保护小鼠100％存活；与山东和河南产BMK蝎毒在1:1(M:M)时可保护小鼠100％存活；免疫扩散测定结果表明与各地产蝎毒质量比在0.4:1时出现清晰免疫沉淀线；本发明以东亚钳蝎蝎毒免疫马获得免疫血浆，经盐析制备IgG再酶解、离子交换柱纯化后得到高纯度的F(ab′)2活性片段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种蝎毒抗体的制备，属于生物医药制品领域，特别涉及 一种抗中国东亚钳蝎蝎毒F(ab′)2抗体及制备工艺。

技术背景

蝎属节肢动物门(Phylum Arthropoda)，蝎目(Order Scorpionidae)， 共包括800多种蝎。据报道对人有害且具有医学意义的蝎近50种，它们几 乎都属于钳蝎科。中国的蝎子种类共29种，钳蝎在中国约有十余种，其中 分布最广的为东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch，BMK)。东亚钳蝎亦称 马氏钳蝎，在我国主要分布在辽宁、内蒙古、山东、山西、陕西、河北、 河南、湖北、湖南、安徽、江苏等省。蝎毒的毒性和成分因蝎子种类不同 有较大差异，根据已报道的蝎毒LD₅₀，毒性最强的是A.crassicauda，LD₅₀为0.067mg/kg，而我国分布最广的东亚钳蝎由于产地不同毒力也有很大差 别，如辽宁产BMK蝎毒腹腔LD₅₀为10.3mg/kg，而河南和山东产BMK蝎毒 腹腔LD₅₀为2.4mg/kg，江西产东亚钳蝎蝎毒LD₅₀为1.67mg﹒kg^-1。

蝎伤者的临床反应主要是局部表现大片状红肿、剧痛；全身症状于伤 后2h即可出现，为神经毒中毒症状，严重者可发生急性肾衰竭、呼吸肌、 心肌麻痹而致死。偶有过敏性休克，严重者可致死亡。毒力较强的BMK蛰 伤还会使有的病人出现高血糖和尿糖，甚至引起胰腺炎。如果治疗及时， 大多数病人于24小时内可逐渐好转至症状消失，严重者则有神经系统后遗 症，而高热39℃以上者，往往在被刺后24小时左右死亡。重度毒蝎蛰伤常 于婴幼儿，通常会引起呼吸短促，肺内积液、呼吸困难、视力模糊、吞咽 困难、肌肉抽搐、行走障碍及其它肌肉运动共济失调等症状，患者如不治 疗，死亡率较高。儿童被蝎蛰伤必须要用抗血清治疗。近年来在我国河北 等地陆续报道了多起蝎蛰伤病例，其中多起出现畏寒、发热、抽搐、休克 等严重症状。这些病例的治疗大多常采用西医常规加中医治疗，存在患者 治疗时间长、患者恐惧、焦虑等问题。

对生物毒素中毒的治疗目前抗血清仍是最有效的药物。我国目前还未 见利用蝎毒制备抗血清的研究报道，国际上有关蝎毒抗血清的产品已经相 应的文献报道如下：

1.Serum production against Tityus serrulatus scorpion venom using  cross-linked chitosan nanoparticles as immunoadjuvant.Rocha Soares  K.S.Cardozo Fonseca J.L.Oliveira Bitencourt M.A.Santos K.S.C.R. Silva-Junior A.A.Fernandes-Pedrosa M.F.Toxicon(2012)60:8 (1349-1354).

2.FDA.FDA approves the first specific treatment for scorpion stings [EB/OL].(2011-08-03)[2011-08-16].

http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm266 611.htm

国际上采用的制备蝎毒抗血清的方法有如下报道：

主要采用脱毒后的蝎毒加入佐剂免疫马，先对免疫原血浆进行胃酶酶 解后再进行硫酸铵盐析和加热来获得马免疫球蛋白F(ab’)2片段。或采 用辛酸沉淀法获得纯化的马免疫球蛋白F(ab’)2片段。

以上制备蝎毒抗血清的方法由于蝎种不同、毒素成分和毒性大小差异 很大，因此全世界制备的蝎毒抗血清都是这对本国主要蝎种的，采用的免 疫源也主要是国内主要蝎毒，因此免疫原中每种蝎毒的比例和免疫周期及 免疫效价都不一样。目前通用的生产蝎毒抗血清的制备技术存在以下缺陷： 免疫血浆首先进行酶解，由于胃蛋白酶作用位点的非特异性，将导致血浆 中除IgG外的其它蛋白（如白蛋白、纤维蛋白原、脂蛋白等）也都被水解， 为后期纯化带来很大困难。同时也使得制备过程中硫酸铵用量较大，生产 周期长。如采用辛酸沉淀法进行纯化，则由于辛酸价格高（500元/L以上）， 导致生产成本成倍增加，另由于辛酸对眼、皮肤和粘膜有轻度刺激作用， 吸入蒸气引起咳嗽。受热分解释出有腐蚀性、刺激性的烟雾、对环境有危 害，对水体可造成污染等因素因此不能用于药品的生产。

其次现有工艺除盐析和加热外未采取进一步的纯化措施，这样的工艺 导致制备的产品中未酶解的IgG和酶解后的Fc片段残留较多，产品的纯度只 能达到70%左右，从而容易导致临床应用过敏反应的发生。同时也由于纯度 不高导致产品的效价降低，需要增加药品用量才能达到救治效果，药品使 用量的增加又增加了不良反应的发生。

本发明在现有技术的基础上，利用东亚钳蝎毒作为免疫原，通过技术 改进，制备出一种东亚钳蝎毒蝎毒F(ab′)₂抗体，为我国蝎蜇伤利用抗血清 进行治疗提供可能。

发明内容

（一）本发明提供一种东亚钳蝎毒蝎毒F(ab′)₂抗体，其特征在于：

其分子量为：97000～110000Da

其理化性质如下：

白色或淡黄色疏松体，注射用水或生理盐水溶解后ｐＨ值在6.0～7. 0之间，能与抗马血清或ＩｇＧ反应呈阳性。

其F(ab’)2抗体纯度大于85%，ＩｇＧ含量低于5％。

本发明所述抗体具有如下功能特性：

与山西产BMK蝎毒在2:1(M:M)时可保护小鼠100％存活；

与辽宁产BMK蝎毒在0.5:1(M:M)时可保护小鼠100％存活；

与山东和河南产BMK蝎毒在1:1(M:M)时可保护小鼠100％存活；

免疫扩散测定，本发明抗体与与各地产蝎毒质量比在0.4:1时出现清 晰免疫沉淀线；

其它检测项符合2010年《中国药典》蛇毒抗血清质量标准。

（二）本发明进一步提供制备本发明东亚钳蝎蝎毒F(ab′)₂抗体的方 法，所述方法依次包括如下步骤：

（1）从至少三个产地获取东亚钳蝎，采集它们的蝎毒，混合后作为免 疫原，免疫动物后取动物血液，得到具有特异性IgG的蝎毒免疫血浆；

（2）取蝎毒免疫血浆，通过硫酸铵分步盐析获得IgG组分；

（3）用无菌水补IgG溶液至原血浆体积，HCl调pH值，加入胃蛋白酶 酶解IgG后再加入硫酸铵，待完全溶解后于57℃保持15～20min，分离上 清液；

（4）上清用Sephadex G25树脂色谱柱脱盐，再用1mol/L的Tris-HCl 调节电导率值到2～3ms/cm后，上预先用0.1mol·L^-1Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）平衡好的DEAE-Sepharose FF柱，上柱后用0.1mol·L^-1Tris-HCl缓 冲液（pH8.0）淋洗1-3倍柱床体积，再用0.1mol·L^-1Tris-HCl+0.5 mol·L^-1NaCl缓冲液进行线性梯度洗脱（0%→100%，3倍柱床体积），收集 穿透峰洗脱液，脱盐过滤冻干即得本发明抗体。

本发明抗体经活性和纯度检测，抗体成分集中在穿透峰上，冻干抗体 纯度大于85%；分离图谱如图1所示。

根据本发明的方法，其中步骤（1）中所述三个产地选自山西，辽宁， 山东，河南的任何一个。优选三个产地选自山西：山东：河南，采集三个 产地的东亚钳蝎蝎毒的重量比例是山西：山东：河南=3:1:1。

其中步骤（2）中所述通过硫酸铵分步盐析获得IgG组分；步骤如下：

血浆中加入硫酸铵使硫酸铵浓度为0.55g﹒mL^-1，待硫酸铵完全溶解后 离心，取沉淀，以无菌水溶解后，加入硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为0.30g ﹒mL^-1，待硫酸铵完全溶解后离心，取沉淀，加入无菌水溶解，使用Sephadex  G25树脂色谱柱脱盐，获得IgG组分。

其中步骤（3）中所述方法如下：将IgG组分用无菌水补体积至原血浆 体积，加入0.2mL甲苯使甲苯终浓度为2μg﹒mL^-1，以6mol·L^-1盐酸调 pH值至3.0～3.5，按每1000mL加入胃蛋白酶0.1g的比例加入胃蛋白酶， 置30℃水浴2.5～3.5hr，然后以5mol·L^-1氢氧化钠调pH值至5.0，置 57℃保持30min，待温度降至45℃以下后离心，上清为抗体粗品。

其中步骤（4）为纯化步骤，收集穿透峰洗脱液后，经过Sephadex G-25 柱或8000-10000Da超滤膜超滤脱盐后0.22μm膜过滤除菌、冻干，获得 F(ab′)₂冻干品。

本发明经IgG提取、IgG酶解、离子交换柱纯化后F(ab′)₂片段纯度可达 90％以上，抗蝎毒F(ab′)₂抗体纯度远超过目前国家药典中抗血清纯度60 ％的要求。通过具体实施的动物实验证明，本发明工艺流程制备的抗蝎毒 抗体能够有效中和我国常见东亚钳蝎蝎毒，同时由于效价高，需要的抗体 剂量小，注入体内的IgG和Fc片段量也大大减少，能够在保证疗效的同时可 以较大幅度地降低不良反应发生率。

本发明的制备方法和外国已经报道的制备方法相比优点如下：

由于采用多地产东亚钳蝎蝎毒按一定比例混合作为免疫原，因此能够 有效中和我国多个地方东亚钳蝎蝎毒，制品具有广谱性。国内外马源的抗 毒血清均是采用的是胃酶消化—硫酸铵盐析的工艺。采血离心得到血浆后， 先是用胃酶消化再用硫酸铵沉淀提纯IgG。我们经反复摸索采用在酶切制备 F(ab’)2前纯化IgG，可使酶用量大大减少，在保证效价的同时提高酶切 效率，其它试剂使用量不增加的同时，使盐析用硫酸铵用量减少一半；缩 短盐析过程的一半生产周期，并且有利于下一步的纯化。结合目前蛋白质 纯化的最新研究成果，本申请摸索出的柱层析技术使得F(ab’)2抗体纯度 得到大幅提高，因此该制品在临床使用时，注射进入人体的蛋白总量降低， 引起过敏反应的大分子IgG及Fc有效去除，大大降低了药物的不良反应发 生率。

以下为本发明的制备方法比外国制备方法优越的比较实验：

表1

附图说明

图1为DEAE-Sepharose FF柱层析结果。图中：1.穿透峰1；2.穿透峰 2；3.洗脱1峰；4.洗脱2峰。

图2为IgG制备过程SDS-PAGE图。图中：1.马免疫原血浆;2.(50% 硫酸铵)上清;3.(50%硫酸铵)沉淀;4.(33%硫酸铵)上清;5.(33%硫酸 铵)沉淀;6.透析液7.标准蛋白。

图3为离子交换柱纯化后各峰SDS－PAGE图。图中：1.穿透峰1；2. 穿透峰2；3.洗脱1峰；4.洗脱2峰；5.标准MK。

图4为纯化前后的IgG与东亚钳蝎蝎毒的免疫扩散图。图中：A图为免 疫原血浆；B为纯化后的IgG。中间孔为蝎毒，周围为蝎毒抗体。

SDS－PAGE电泳胶板用Bio-Rad Gel doc EQ凝胶成像系统对电泳结果进行 图像采集后，使用Quantity One4.4凝胶分析软件测定。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围包括 但不限于以下实施例。

实施例1，抗体的制备

东亚钳蝎蝎毒购自江西、山东和河南等地蝎养殖场，分别测定腹腔LD50 后作为免疫原，东亚钳蝎蝎毒小鼠腹腔注射的LD50：山西产为1.4～2.0 mg·kg-1﹒山东产为2.0～3.0mg·kg-1﹒河南产为2.0～3.5mg·kg-1； 免疫用马为昆明矮种马，4～15岁，按2010年《中国药典》三部相关规定 检疫合格，昆明种小白鼠（清洁级，体重18～22g，），胃蛋白酶经类A物质 检验合格，比活1：3000。

（一）免疫及免疫血浆采集

按3:1:1比例分别称取山西、山东和河南产BMK蝎毒适量，0.9%氯化 钠注射液溶解后配制成10mg·mL^-1溶液，0.22um滤器过滤后与弗氏佐剂等 量混合，利用乳化器进行充分乳化。然后采用背部皮内多点注射法进行马 匹免疫，首次免疫剂量蝎毒1.0mg/匹；此后每间隔2周加强免疫1次，每 次剂量递增0.5mg，每次免疫完成两周后从颈静脉采血10mL，并用酶联免 疫吸附方法（ELISA）测定血浆效价，血浆ELISA效价达到10^-6稀释为阳性 时可进行采血，每匹马采血2000～4000mL，加入柠檬酸抗凝剂（终浓度5mg ﹒mL-1），5000rpm4℃离心30min，取上层血浆，保存于-20℃，累积几次 血浆后，混合并制备。

（二）盐析获得IgG组分

在马血浆中缓慢加入饱和硫酸铵溶液使溶液中硫酸铵终浓度为0.55g ﹒mL^-1），该过程在缓慢搅拌条件下进行，搅拌1h后8000rpm室温离心30min， 弃上清保留下层沉淀，加入原血浆等体积的注射用水，再次在缓慢搅拌条 件下缓慢加入饱和硫酸铵溶液使溶液中硫酸铵终浓度为0.30mg﹒mL^-1，搅拌 20min后同前条件离心，取沉淀加入适量无菌水溶解，使用Sephadex G25树 脂色谱柱脱盐，收集蛋白峰即为IgG。

（三）酶解

制备的IgG用无菌水补体积到原血浆体积，先加入甲苯（终浓度2μg ﹒mL^-1），再加入HCl溶液（6mol﹒L^-1）调节pH值至3.2，加入胃酶（Sigma 公司，比活1：3000）30℃酶解2.5h，加入NaOH溶液（5mol﹒L^-1）调节 pH值至5.2终止反应。溶液57℃保温20min，然后使温度自然下降到45℃ 以下，8000rpm室温离心30min，得上清。

（四）纯化

使用Sephadex G25XK50/100色谱柱脱盐后备用，经以上步骤得到的 F(ab′)₂抗体粗液纯度在61.5%。将以上F(ab′)₂抗体粗提液用1mol/L的 Tris-HCl调节电导后到2～3ms/cm后上预先用0.1mol·L^-1Tris-HCl缓冲 液（pH8.0）平衡好的DEAE-Sepharose FF柱，用该缓冲液淋洗1-3倍柱 床体积后，用0.1mol·L^-1Tris-HCl+0.5mol·L^-1NaCl缓冲液进行线性梯 度（0%→100%，3倍柱床体积）洗脱，收集穿透峰，将收集的活性峰产物经 Sephadex G-25柱脱盐或8000-10000Kda超滤膜超滤脱盐后经0.22μm膜过 滤除菌再冻干获得F(ab′)2冻干品。

分离图谱如图1所示。

如图3SDS－PAGE图显示：经DEAE-Sepharose FF柱层析柱纯化的 F(ab′)2条带纯度为93.5％。

通过以上步骤，如果F(ab′)2纯度低于85%，则进一步将收集的 F(ab′)2穿透峰经0.45μm膜滤后再以相同条件上DEAE-Sepharose FF柱 层析柱进行纯化，可进一步提高F(ab′)2抗体纯度。

实施例2

抗东亚钳蝎IgG及F(ab′)₂抗体效价检测

（1）ELISA法测定抗体效价

用包被液（0.05mol﹒L^-1碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释蝎毒至蛋白终浓 度为0.5mg﹒mL^-1后包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜后用洗涤液洗板3 次。每孔加入10%小牛血清溶液100μL，37℃封闭1h。将待测样品用稀释 液（含10%小牛血清的PBS缓冲液，pH7.4）进行10¹～10¹⁰的10倍梯度稀 释，并以免疫前的健康马血清作为阴性对照，每个样品加3个复孔，37℃ 结合2h后洗板。加入HRP标记的二抗（兔抗马）100μL，37℃结合2h后 洗板。加入新配制的邻苯二胺（OPD）显色液，避光显色30min后加入H₂SO₄溶液（2mol﹒L^-1）终止反应。置自动酶标仪测定OD₄₉₂值。以S/N≥2（S： 样本数值，N：阴性对照数值）判定为阳性。免原血浆稀释至1×10-7mg ﹒mL-1与免疫前马血浆作对照呈阳性；纯化后的IgG稀释至1×10-9mg﹒ mL-1时呈阳性，纯化后的IgG ELISA活性提高了100倍。

（2）免疫扩散实验

载玻片上铺3mm厚的1%的琼脂，自然凝固后打出孔径4mm，孔距10mm的 梅花孔，中央孔加入蝎毒（1mg﹒mL^-1），周围孔分别加入倍比稀释的待检 抗体样品（0.2～6.4mg﹒mL^-1），至湿盒中37℃扩散24h，氨基黑(5mg﹒mL^-1) 染色，脱色液脱色至背景基本无色后观察。马免疫原血浆与蝎毒比例在4:1 （mg:mg）时出现清晰的沉淀线，而纯化后的IgG与各地产蝎毒比例在0.4:1 时均出现清晰的沉淀线；制备的F(ab’)2抗体与各地产蝎毒也在0.4:1时出 现清晰沉淀。结果见图4（中央孔为毒素）

（3）小鼠体外中和实验

昆明种小鼠66只，随机分为11组，每组6只，♀♂各半，10组为实验 组，1组为阴性对照组。注射蝎毒量为3LD₅₀，实验组以硼酸盐缓冲液分别 稀释蝎毒、蝎毒抗体，抗体与蝎毒按质量比0.5:1～10:12倍梯度混合； 阴性对照组只加蝎毒，不加抗体。摇匀后置37℃结合45min后注射小鼠， 每只0.4mL，观察72h并记录小鼠死亡情况。制备的BMK蝎毒F(ab’)2 抗体冻干品与山西产BMK蝎毒在2:1(M:M)时可保护小鼠100％存活；该抗 体与辽宁产BMK蝎毒在0.5:1(M:M)时可保护小鼠100％存活；与山东和河 南产BMK蝎毒在1:1(M:M)时可保护小鼠100％存活。结果见表2。

表2蝎毒F(ab’)₂抗体对不同产地BMK毒素的小鼠体外中和试验(n=6)

①F(ab’)2抗体与毒素质量比（mg:mg）。

实施例3

抗体制剂的制备

称取24g精制抗东亚钳蝎蝎毒F(ab’)₂抗体冻干品，用5050ml注射用 水复溶，经0.22um膜过滤后分装，5ml/瓶，冻干。

最后制备的冻干抗东亚钳蝎蝎毒F(ab’)₂抗体成品制剂经小鼠中和法 检测每瓶能有效中和山西产东亚钳蝎蝎毒对70kg成人的平均LD50毒量 11.9mg，可以中和山东和河南产BMK蝎毒24mg，辽宁产BMK蝎毒48mg。可 以有效中和进入人体内致死剂量的蝎毒。

实施例4

抗东亚钳蝎蝎毒F(ab’)₂抗体其它检测结果

按照2010年版《中国药典》抗血清成品的其它项目按药典标准进行检 测，检测结果见表3.

表3抗东亚钳蝎蝎毒F(ab’)2抗体其它相关项目检验结果