一种产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌及生产5-酮基米尔贝霉素的方法

摘要

本发明涉及基因重组技术领域，尤其涉及一种产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌及生产5-酮基米尔贝霉素的方法。本发明提供了一种用于敲除链霉菌milF基因的重组载体，包括milF基因同源片段，该片段的序列为在如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中第158～924位核苷酸间缺失105～767个核苷酸。并提供了该重组载体的构建方法，以及采用该重组载体敲除链霉菌中milF基因的方法，及milF基因被敲除的链霉菌。该链霉菌可以直接发酵产生5-酮基米尔贝霉素，简化了米尔贝肟的合成工艺，并避免了传统的化学合成方法带来的污染。

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组技术领域，尤其涉及一种产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌及生产5-酮基米尔贝霉素的方法。 

背景技术

米尔贝霉素是一种大环内酯类驱虫药物，日本三共株式会社于1967年发现，经过多年的改良于1986年正式以商品名米尔贝肟（milbemycin oxime）上市。米尔贝肟是米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4的肟衍生物，米尔贝肟对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果。通常用来预防恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病。由于米尔贝肟杀虫活性高、毒性小，LD₅₀是临床推荐用量的2000倍以上，同时对阿维菌素类药物敏感的犬毒性较小，所以具有很好的市场前景。 

目前，米尔贝肟是通过半合成的方法生产。首先，产米尔贝霉素的链霉菌经过发酵，从发酵产物中提取得到米尔贝霉素A3和A4。然后米尔贝霉素A3或A4的C-5羟基被氧化成酮。这种5-酮基米尔贝霉素与盐酸羟胺在二噁烷-甲醇-水中发生反应，得到米尔贝肟。 

其中，米贝尔霉素A3具有式I所示结构，米贝尔霉素A4具有式II所示结构，5-酮基米尔贝霉素A3的结构如式III所示，5-酮基米尔贝霉素A4的结构如式IV所示。 

所述产米尔贝霉素A3和/或A4的链霉菌主要有链霉菌（Streptomyces milbemycinicus）和冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis)，冰城链霉菌如(Streptomyces bingchengsis sp.nov)CGMCC NO.1734（亦称Streptomyces bingchenggensis BCW-1）内有基因（GenBank:FJ560599.2），在大肠杆菌中进行表达后的体外实验证明，该基因的表达产物可以将5-酮米尔贝霉素A3和/或A4对应转化为米尔贝霉素A3和/或A4，本发明将milF基因定义为泛指：来自于链霉菌、序列与GenBank FJ560599.2高度类似或相同、具有“将5-酮米尔贝霉素A3和/或A4对应转化为米尔贝霉素A3和/或A4”功能的基因；Streptomyces milbemycinicus，如本发明的链霉菌HS023亦有milF基因（经本发明人测序，序列如SEQ ID NO:2所示，基本与GenBank FJ560599.2同）。显然，能直接产5-酮基米尔贝霉素的菌株，将缩短米尔贝肟的生产工艺，但目前尚未有直接生产5-酮基米尔贝霉素的菌株的报道。 

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌及生产5-酮基米尔贝霉素的方法，本发明采用基因工程的方法，敲除链霉菌中的milF基因，阻止链霉菌代谢产生的5-酮基米尔贝霉素被milF氧化为米尔贝霉素，从而使其能够产5-酮基米尔贝霉素。 

本发明提供了一种用于敲除产米尔贝霉素A3和/或米尔贝霉素A4的原始链霉菌milF基因的基因敲除质粒，其包含milF基因同源片段，该片段缺失了SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中第158～924位核苷酸间的105～767个核苷酸，本发明的“缺失”是指该片段与SEQ ID NO:2相比包含这样的同源序列：该同源序列不含所述SEQ ID NO:2的105～767个核苷酸序列，而SEQ ID NO:2的其他序列均出现在该同源序列中。缺失的片段可为连续的也可为不连续的，本发明对此不做限定，其皆在本发明的保护范围之内。 

作为优选，本发明提供的用于敲除链霉菌milF基因的基因敲除质粒，包含抗性标记基因，还包含顺序连接的以下核苷酸片段：上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段； 

其中，所述上游核苷酸片段为如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第n～2467个核苷酸，1≤n≤2178，n为整数； 

所述milF基因同源片段为在如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中第158～924位核苷酸间缺失105～767个核苷酸的序列； 

所述下游核苷酸片段为如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的第1～m个核苷酸，997≤m≤3108，m为整数。 

本发明利用同源重组将基因组中的某段基因替换，而达到基因敲除的目的。本发明构建了含有milF基因同源片段及上下游核苷酸片段的基因敲除载体；利用该基因敲除质粒使能够产生米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4的原始链霉菌中的milF基因被milF基因同源片段替换，从而达到敲除链霉菌中milF基因的 目的。 

优选的，所述milF基因同源片段的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示： 

SEQ ID NO:5为在SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中缺失第359～646位核苷酸，即288个核苷酸的序列；SEQ ID NO:7为在SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中缺失第158～924位核苷酸，即767个核苷酸的序列；SEQ ID NO:9为在SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列中第缺失762～866位核苷酸，即105个核苷酸的序列。 

优选的，所述上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段共同形成SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示核苷酸片段。 

作为优选，本发明提供的基因敲除质粒中抗性标记基因为壮观霉素抗性基因aadA（表达产物起抗壮观霉素的作用）。 

在保证各元件功能不发生改变的前提下，壮观霉素抗性基因在本发明提供的用于敲除链霉菌milF基因的重组载体中的位置，只要不对敲除结果产生影响，均在本发明的保护范围之内。 

作为优选，壮观霉素抗性基因为任一含SEQ ID NO：4所示序列的核苷酸片段，如可来自于质粒载体pIJ778。 

优选的，壮观霉素抗性基因的制备方法为：取pIJ778质粒载体，经PCR扩增或酶切，即得。 

优选的，本发明提供的基因敲除质粒的骨架为pMD19（Simple）、pBlueScript SK(+)或pSTV28。 

此处骨架意指构建基因敲除质粒所用的起始质粒，该起始质粒的基本结构最终保留在基因敲除质粒中。 

本发明利用商业化的普通骨架，构建能够敲除链霉菌中milF基因的重组载体，并通过同源重组将原始链霉菌中的milF基因敲除。 

优选的，骨架为pMD19（Simple），上游核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，milF基因同源片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，下游核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；壮观霉素抗性基因可以如SEQ ID NO：11所示核苷酸片段的形式，连入最终的基因敲除质粒；顺序连接的上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。 

其中，SEQ ID NO：11位于pMD19（Simple）的Ssp I酶切位点处，顺序连接的上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段的位置位于：pMD19（Simple）的EcoR V酶切位点处。 

SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为在SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中第359～646位核苷酸间缺失288个核苷酸的序列。 

优选的，骨架为pBlueScript SK(+)，上游核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，milF基因同源片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，下游核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，壮观霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；顺序连接的上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下 游核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。 

其中，顺序连接的上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段的位置位于：pBlueScript SK(+)的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间，壮观霉素抗性基因位于pBlueScript SK(+)的Xba I酶切位点处。 

SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为在SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第574～2467个核苷酸；SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列为在SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中第158～924位核苷酸间缺失767个核苷酸的序列；SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列为在SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的第1～997个核苷酸。 

优选的，骨架为pSTV28，上游核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，milF基因同源片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，下游核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；壮观霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；顺序连接的上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。其中，顺序连接的上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段的位置位于：pSTV28的Sma I酶切位点与Sph I酶切位点之间，壮观霉素抗性基因位于pSTV28的Sph I酶切位点处。 

SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为在SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第574～2467个核苷酸；SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列为在SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中第762～866位核苷酸间缺失105个核苷酸的序列；SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列为在SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的第2178～2467个核苷酸。 

优选的，本发明提供的基因敲除质粒的序列如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39所示。 

本发明提供的基因敲除质粒的制备方法，包括以下步骤： 

步骤1：将抗性标记基因连接入骨架质粒，获得第一载体； 

步骤2：以链霉菌总DNA为模板，扩增第一核苷酸片段，将所述第一核苷酸片段连接入所述第一载体，获得第二载体； 

步骤3：取所述第二载体，用限制性内切酶切除所述第一核苷酸片段中milF基因第158～924位核苷酸间的105～767个核苷酸，制得所述基因敲除质粒； 

其中，所述第一核苷酸片段为顺序连接的上游核苷酸片段、milF基因、下游核苷酸片段； 

所述上游核苷酸片段为如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第n～2467个核苷酸，1≤n≤2178，n为整数； 

所述milF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 

所述下游核苷酸片段为如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的第1～m个核苷酸，997≤m≤3108，m为整数。 

作为优选，步骤3中切除第一核苷酸片段中milF基因第158～924位核苷酸间的105～767个核苷酸之后还包括平末端化和自连接的步骤。 

作为优选，第二载体中没有适宜切除第一核苷酸片段中milF基因第158～924位核苷酸间的105～767个核苷酸的限制性内切酶位点（或第二载体上存在两个或两个以上该酶切位点），则步骤3具体为： 

步骤a：取第二载体，经第一酶切获得第五载体及包含有待切除片段的核苷酸序列； 

步骤b：将包含有待切除片段的核苷酸序列连接入第六载体，获得第七载体； 

步骤c：取第七载体，第二酶切去除待切除片段，自连接后，经第三酶切，将第三酶切所得片段连入第五载体，获得用于敲除链霉菌milF基因的重组载体。 

所述第六载体为任意质粒载体，其具有适宜切除第一核苷酸片段中milF基因第158～924位核苷酸间的105～767个核苷酸的限制性内切酶位点。 

作为优选，骨架为pMD19（Simple）。 

优选的，骨架为pMD19（Simple），壮观霉素抗性基因连接入pMD19（Simple）载体的BstB I酶切位点与Ssp I酶切位点之间。 

优选的，骨架为pMD19（Simple），第一核苷酸片段连接入第一载体EcoR V酶切位点处。 

骨架为pMD19（Simple），第二载体上没有适宜切除第一核苷酸片段中milF基因第158～924位核苷酸间的105～767个核苷酸的限制性内切酶位点。 

优选的，第一酶切的酶切位点为Kpn I与EcoR V。 

优选的，包含有待切除片段的核苷酸序列连接入第六载体的Kpn I与EcoR V酶切位点之间。 

优选的，第二酶切的酶切位点为Nru I和Xho I。 

优选的，第二酶切的酶切位点为Kpn I与EcoR V。 

更优选的，骨架为pMD19（Simple），用于敲除链霉菌milF基因的敲除质粒的制备方法，包括以下步骤： 

步骤1：取pMD19（Simple）载体，经Ssp I酶切、平末端化，获得线性化的pMD19（Simple）载体；取pIJ778质粒，经BstB I和Ssp I双酶切，电泳、回收SEQ ID NO:11所示序列的壮观霉素抗性基因；取SEQ ID NO:11所示序列的壮观霉素抗性基因，经平末端化，与线性化的pMD19（Simple）载体连接，获得第一载体； 

步骤2：以链霉菌总DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示的上游引物，及核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示的下游引物，经扩增获得第一核苷酸片段；取第一载体，经EcoR V酶切，与第一核苷酸片段连接，获得第二载体； 

步骤3：取第二载体经Kpn I和EcoR V双酶切，电泳回收，获得大小为1926bp的核苷酸片段，及第五载体； 

步骤4：取pBlueScript SK(+)载体经Kpn I和EcoR V双酶切，与大小为1926bp的核苷酸片段连接获 得第七载体； 

步骤5：取第七载体，Nru I和Xho I双酶切去除SEQ ID NO：19所示序列的核苷酸片段，经平末端化，自连接后，经Kpn I和EcoR V双酶切，电泳回收大小为1638bp的核苷酸片段； 

步骤6：取大小为1638bp的核苷酸片段连接入第五载体，即得。 

本发明还提供了另一种用于敲除链霉菌milF基因的重组载体的制备方法，包括以下步骤： 

步骤1：以链霉菌总DNA为模板，扩增第二核苷酸片段，所述第二核苷酸片段连接入骨架质粒，获得第三载体； 

步骤2：以链霉菌总DNA为模板，扩增第三核苷酸片段，所述第三核苷酸片段连接入第三载体，获得第四载体； 

步骤3：将抗性标记基因连接入第四载体，得基因敲除质粒； 

其中，所述第二核苷酸片段为顺序连接的上游核苷酸片段和milF基因5’端片段； 

所述第三核苷酸片段为顺序连接的milF基因3’端片段和下游核苷酸片段； 

所述上游核苷酸片段为如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第n～2467个核苷酸，1≤n≤2178，n为整数； 

所述下游核苷酸片段为如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的第1～m个核苷酸，997≤m≤3108，m为整数； 

所述milF基因5’端片段的核苷酸序列为如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中的第1～x个核苷酸，157≤x≤761，x为整数； 

所述milF基因3’端片段的核苷酸序列为如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中的第y～936个核苷酸，866≤y≤925，y为整数； 

105≤y-x≤767。 

作为优选，骨架为pBlueScript SK(+)或pSTV28。 

优选的，骨架为pBlueScript SK(+)，第二核苷酸片段连接入pBlueScript SK(+)载体的BamH I和Hind III酶切位点之间。 

优选的，骨架为pBlueScript SK(+)，第三核苷酸片段连接入pBlueScript SK(+)载体的Xho I和Hind III酶切位点之间。 

优选的，骨架为pBlueScript SK(+)，壮观霉素抗性基因连接入第四载体的Xba I酶切位点处。 

更优选的，骨架为pBlueScript SK(+)，用于敲除链霉菌milF基因的重组载体的制备方法，包括以下步骤： 

步骤1：以链霉菌总DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示的上游引物，及核苷酸序 列如SEQ ID NO:21所示的下游引物，扩增得到SEQ ID NO:24所示核苷酸序列的第二核苷酸片段，经BamH I和Hind III双酶切，与经BamH I和Hind III双酶切的pBlueScript SK(+)载体连接，获得第三载体； 

步骤2：以链霉菌总DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示的上游引物，及核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示的下游引物，扩增得到SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的第三核苷酸片段，经Xho I和Hind III双酶切，与经Xho I和Hind III双酶切的第三载体连接，获得第四载体； 

步骤3：取pIJ778载体，经Xba I酶切，获得核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的壮观霉素抗性基因，与经Xba I酶切的第四载体连接，即得。 

优选的，骨架为pSTV28，第二核苷酸片段连接入pSTV28载体的BamH I和Sma I酶切位点之间。 

优选的，骨架为pSTV28，第三核苷酸片段连接入pSTV28载体的Sph I和Pst I酶切位点之间。 

优选的，骨架为pSTV28，壮观霉素抗性基因连接入第四载体的Sph I酶切位点处。 

更优选的，骨架为pSTV28，用于敲除链霉菌milF基因的重组载体的制备方法，包括以下步骤： 

步骤1：以链霉菌总DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示的上游引物，及核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示的下游引物，扩增得到SEQ ID NO:30所示核苷酸序列的第二核苷酸片段，经BamH I酶切，与经BamH I和Sma I双酶切的pSTV28载体连接，获得第三载体； 

步骤2：以链霉菌总DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示的上游引物，及核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示的下游引物，扩增得到SEQ ID NO:31所示核苷酸序列的第三核苷酸片段，经Sph I和Pst I双酶切，与经Sph I和Pst I双酶切的第三载体连接，获得第四载体； 

步骤3：以pIJ778载体为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示的上游引物，及核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示的下游引物，扩增得到核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的壮观霉素抗性基因，经Sph I酶切，连接入经Sph I酶切的第四载体，即得。 

本发明还提供了一种产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌，其通过本发明提供的基因敲除质粒，将产米尔贝霉素A3或米尔贝霉素A4的原始链霉菌的milF基因敲除而制得。 

作为优选，原始链霉菌为链霉菌（Streptomyces milbemycinicus）或冰城链霉菌(streptomyces bingchengsis)，优选链霉菌（Streptomyces milbemycinicus）HS023CGMCC No.7677、链霉菌（Streptomyces milbemycinicus sp.nov）NRRL NO.5739或冰城链霉菌(streptomyces bingchengsis sp.nov)CGMCC NO.1734。 

本发明提供的重组链霉菌的制备方法包括以下步骤： 

步骤1：取权利要求1～6任一项所述的基因敲除质粒，转化入大肠杆菌，获得转化子； 

步骤2：以原始链霉菌孢子或菌丝体为受体，与所述转化子进行接合转移，筛选出milF基因被敲除的菌株，即得产5-酮基米尔贝霉素的重组链霉菌。 

作为优选，本发明提供的产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌其制备方法中大肠杆菌（Escherichia coli）为 ET12567(pUZ8002)： 

该菌为经典菌，见MacNeil DJ,Gewain KM,Ruby CL,Dezeny G,Gibbons PH,MacNeil T,Analysis of Streptomyces avermitilis genes required for avermectin biosynthesis utilizing a novel integration vector.Gene111(1),61-68,1992。其中一种制备方法为：在保藏编号为ATCC BAA-525的大肠杆菌ET12567中转化入质粒pUZ8002（可购自E.coli Genetic Stock Center）。 

作为优选，本发明提供的产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌的制备方法中转化采用热击法。 

优选的，热击法具体为：取本发明提供的用于敲除链霉菌milF基因的重组载体与大肠杆菌感受态细胞混合，经冰上放置30min，42℃热击90s，冰上冷却1min，与不含抗生素的LB液体培养基混合，经37℃培养50min，取培养物涂布于含有抗生素的LB固体培养基，37℃培养8h～12h后，挑取单菌落，于含有抗生素的LB液体培养基，37℃培养8h～12h后，取培养所得单菌落，接种于含有抗生素的LB液体培养基培养至OD₆₀₀为0.4～0.6，收集菌体、洗涤后重悬菌体，即为转化子。 

更优选的，不含抗生素的LB液体培养基中各组分的质量-体积浓度为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0。 

更优选的，含有抗生素的LB固体培养基中各组分的质量-体积浓度为：25μg/mL氯霉素、50μg/mL卡那霉素、100μg/mL壮观霉素，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH7.0。 

更优选的，含有抗生素的LB液体培养基中各组分的质量-体积浓度为：25μg/mL氯霉素、50μg/mL卡那霉素、100μg/mL壮观霉素，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH7.0。 

作为优选，接合转移包括以下步骤： 

步骤1：取原始链霉菌孢子，制得孢子悬液，取转化子与孢子悬液混合，涂布于不含抗生素的MS固体培养基，28℃培养16h～20h；用含有1000μg/mL的壮观霉素和500μg/mL萘啶酮酸（Nal）的无菌水覆盖培养基表面，28℃培养4d～8d，获得接合子； 

步骤2：取一个经同源单交换的接合子，在不含抗生素的MS固体培养基上28℃连续培养2代后，在不含抗生素的MS固体培养基上划线分离单菌落，28℃培养4d～6d。 

优选的，在接合转移的步骤2之前还包括：在含有100μg/mL壮观霉素和25μg/mL萘啶酮酸的MS固体培养基上划线，28℃培养4d～6d。 

优选的，孢子悬液的制备方法为：取用MS固体培养基培养的原始链霉菌，洗下孢子，4000rpm离心5min，弃除上清液取孢子，加入500μL2×YT液体培养基，打散孢子后，放入50℃水浴10min，即得。 

优选的，不含抗生素的MS固体培养基中，各组分的质量-体积浓度为：琼脂20g/L，甘露醇20g/L，黄豆粉20g/L，以水配制。 

优选的，2×YT液体培养基中各组分的质量-体积浓度为：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，氯化 钠5g/L，以蒸馏水配制。 

更优选的，含有100μg/mL壮观霉素的MS培养基中，各组分的质量-体积浓度为：琼脂20g/L，甘露醇20g/L，黄豆粉20g/L，壮观霉素100μg/mL，以水配制。 

作为优选，采用含壮观霉素的MS固体培养基进行抗性筛选，壮观霉素浓度可设为100μg/mL，可将同一单菌落分别接种到含/不含壮观霉素的培养基，28℃培养4d～6d，挑选在含抗培养基不生长、而在不含抗的培养基生长的菌落。 

优选的，抗性筛选后进行PCR验证。 

更优选的，PCR验证采用的引物为：SEQ ID NO:34所示核苷酸序列的上游引物，SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的下游引物。经电泳，PCR产物小于870bp的菌落即为产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌。 

通过转化入本发明提供的重组载体的大肠杆菌与原始链霉菌接合，使其中的基因发生同源单交换和同源双交换，从而获得milF基因被敲除的链霉菌。 

利用本发明提供的产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌制备5-酮基米尔贝霉素的方法，包括：取本发明提供的产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌，经发酵、纯化，即得。 

优选的，发酵采用的培养基包括：蔗糖、黄豆饼粉、麦芽膏、K₂HPO₄、FeSO₄·7H₂O、CaCO₃和MgSO₄。 

更优选的，发酵采用的培养基中各组分的质量百分数为：蔗糖16%，黄豆饼粉2%，酵母膏0.5%，麦芽膏0.5%，K₂HPO₄0.05%，FeSO₄·7H₂O0.005%，CaCO₃0.3%，MgSO₄0.05%；pH7.2。 

优选的，发酵温度为28℃，220rpm，培养10d。 

本发明提供了一种用于敲除链霉菌milF基因的重组载体，并提供了该重组载体的构建方法，以及采用该重组载体敲除原始链霉菌中milF基因的方法，及milF基因被敲除的链霉菌。本发明提供的方法，通过基因工程的手段，对链霉菌种milF基因进行敲除，其结果具有良好的重现性，避免了诱变手段改造菌株的不确定性，鉴定结果表明，本发明提供的milF基因被敲除的链霉菌中的milF基因失效。利用本发明提供的milF基因被敲除的链霉菌，经发酵、纯化，即得5-酮基米尔贝霉素。该方法可以直接发酵产生5-酮基米尔贝霉素，简化了米尔贝肟的合成工艺，并避免了传统的化学合成方法带来的污染。 

生物保藏说明 

链霉菌HS023：分类命名为链霉菌（Streptomyces milbemycinicus），菌株编号HS023，于2013年6月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7677。 

附图说明

图1示实施例2以pMD19（Simple）为骨架构建用于敲除链霉菌milF基因的敲除质粒流程图； 

图2示实施例2以pMD19（Simple）为骨架构建的用于敲除链霉菌milF基因的敲除质粒图谱； 

图3示实施例3以pBlueScript SK(+)为骨架构建用于敲除链霉菌milF基因的敲除质粒流程图； 

图4示实施例3以pBlueScript SK(+)为骨架构建的用于敲除链霉菌milF基因的敲除质粒图谱； 

图5示实施例4以pSTV28为骨架构建用于敲除链霉菌milF基因的敲除质粒流程图； 

图6示实施例4以pSTV28为骨架构建的用于敲除链霉菌milF基因的敲除质粒图谱； 

图7示实施例6对同源双交换后菌落进行PCR验证的电泳图； 

其中，泳道1示DNA分子标记；泳道2示本发明实施例2构建的敲除质粒经PCR产生的条带；泳道3示保藏编号为CGMCC No.7677的原始链霉菌经PCR产生的条带；泳道4～5为敲除掉milF基因的链霉菌经PCR产生的条带； 

图8示实施例7的HPLC检测图谱；其中，图8（a）示5-酮基米尔贝霉素A3、A4标准品的HPLC检测的图谱；其中，峰1为5-酮基米尔贝霉素A3，峰2为5-酮基米尔贝霉素A4；图8（b）示米尔贝霉素A3、A4标准品的HPLC检测的图谱，其中，峰3为米尔贝霉素A3，峰4为米尔贝霉素A4图8（c）示实施例6制备的milF基因被敲除的链霉菌的发酵产物的HPLC检测图谱；图8（d）示保藏编号为CGMCCNo.7677的原始链霉菌发酵产物的HPLC检测图谱。 

具体实施方式

本发明提供了一种产5-酮基米尔贝霉素的链霉菌及生产5-酮基米尔贝霉素的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。 

本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。 

其中，本发明采用： 

原始链霉菌保藏编号为CGMCC No.7677； 

骨架：pMD19（Simple）购自Takara公司； 

pBlueScript SK(+)购自Fermentas公司； 

pSTV28购自Takara公司； 

壮观霉素抗性基因来源载体pIJ778购自E.coli Genetic Stock Center； 

制备采用的限制性内切酶、PCR扩增反应相关试剂购自Takara公司； 

平末端化所用的试剂盒均为BKL，购自Takara公司； 

下面结合实施例，进一步阐述本发明： 

实施例1：链霉菌总DNA的提取 

取链霉菌冻存管孢子悬液50μL接种于30mL TSB培养基（购自Bacto Tryptic Soy Broth.BD公司），28℃、220rpm培养48h后，于50mL离心管中，4000rpm离心10min，去上清，沉淀用30mL蔗糖-Tris缓冲液（其中，蔗糖的质量百分数为10.3%，Tris-HCl的摩尔-体积浓度为10mM，pH值为8.0）洗涤2遍后，以5mL蔗糖-Tris缓冲液悬浮。加入质量-体积溶度为100mg/mL溶菌酶溶液20μL，37℃水浴2h。加入质量百分数为10%的SDS溶液500μL，温和颠倒直至基本澄清。加酚-氯仿-异戊醇（其中：酚-氯仿-异戊醇的体积比为25:24:1（pH值为8.0）溶液5mL，温和颠倒数次后，4000rpm离心10min。取上层溶液4mL，加酚-氯仿-异戊醇（pH值为8.0）溶液4mL，温和颠倒数次后4000rpm离心10min。接着取上层3mL溶液，加入摩尔-体积浓度为3mol/L的NaAc缓冲液（pH值为5.3）300μL、异丙醇3mL，温和颠倒数次后，将结团的沉淀挑到新的1.5mL离心管。沉淀用体积分数为70%乙醇水溶液洗涤2遍后，室温干燥。加入500μL Tris-HCl（pH8.0）溶解，得到链霉菌的总DNA。 

实施例2：用于敲除链霉菌milF基因的重组载体的构建 

以pMD19（Simple）为骨架，其构建流程如图2所示，具体为： 

a)：以实施例1所得链霉菌总DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示的上游引物，及核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示的下游引物，经扩增获得第一核苷酸片段； 

1、PCR扩增反应液的配制，其中PrimeSTAR试剂盒购自TaKaRa： 

2、分装成2管进行PCR反应，程序为： 

经琼脂糖凝胶电泳，PCR产物用DNA胶回收试剂盒（购自上海华舜生物技术有限公司）回收，得到第一核苷酸片段，其序列如SEQ ID NO:36所示。 

b)：质粒构建 

取pMD19(Simple)质粒载体（购自Takara公司）经Ssp I酶切，平末端化后，获得线性化的pMD19（Simple）载体；取pIJ778质粒，经BstB I和Ssp I双酶切，电泳、回收SEQ ID NO:11所示序列的核苷酸片段；取SEQ ID NO:11所示序列的核苷酸片段，经平末端化，与线性化的pMD19（Simple）载体连接，获得第一载体； 

取第一载体，经EcoR V(购自TaKaRa公司)酶切，与第一核苷酸片段连接，获得第二载体； 

取第二载体经Kpn I(购自TaKaRa公司)和EcoR V(购自TaKaRa公司)双酶切，电泳回收，获得第五载体及大小为1926bp的核苷酸片段；大小为1926bp的核苷酸片段中包含milF基因序列。 

取pBlueScript SK(+)载体经Kpn I和EcoR V双酶切，与大小为1926bp的核苷酸片段连接获得第七载体； 

取第七载体，Nru I和Xho I双酶切去除SEQ ID NO：19所示序列的核苷酸片段，经平末端化，自连接后，得到第八载体； 

取第八载体经Kpn I和EcoR V双酶切，电泳回收含milF基因同源片段的核苷酸片段（大小为1638bp）； 

取大小为1638bp的核苷酸片段连接入第五载体，即得以pMD19（Simple）为骨架的，用于敲除链霉菌milF基因的重组载体。 

构建出的用于敲除链霉菌milF基因的重组载体图谱如图3所示，其序列如SEQ ID NO:37所示，具有壮观霉素抗性基因、oriT转移起始位点和顺序连接的以下核苷酸片段：SEQ ID NO：1所示序列的上游核苷酸片段，SEQ ID NO:5所示序列的milF基因同源片段，及SEQ ID NO:3所示序列的下游核苷酸片段。链霉菌milF基因中第359位～646位共计288bp碱基被切除。 

实施例3：用于敲除链霉菌milF基因的重组载体的构建 

以pBlueScript SK(+)为骨架，其构建流程如图4所示，具体为： 

a）、以链霉菌总DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示的上游引物，及核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示的下游引物，PCR扩增得到SEQ ID NO:24所示核苷酸序列的第二核苷酸片段： 

1、PCR扩增反应液的配制，其中PrimeSTAR试剂盒购自TaKaRa： 

2、分装成2管进行PCR反应，程序为： 

经琼脂糖凝胶电泳，PCR产物用DNA胶回收试剂盒（购自上海华舜生物技术有限公司）回收，得到第二核苷酸片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示。 

b）、取第二核苷酸片段，经BamH I和Hind III进行双酶切，与经BamH I和Hind III双酶切的pBlueScript SK(+)（购自Fermentas公司）载体连接，获得第三载体。 

c）、以链霉菌总DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示的上游引物，及核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示的下游引物，扩增得到SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的第三核苷酸片段； 

1、PCR扩增反应液的配制，其中PrimeSTAR试剂盒购自TaKaRa： 

2、分装成2管进行PCR反应，程序为： 

经琼脂糖凝胶电泳，PCR产物用DNA胶回收试剂盒（购自上海华舜生物技术有限公司）回收，得到第三核苷酸片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。 

d）、取第三核苷酸片段，经Xho I和Hind III双酶切，与经Xho I和Hind III双酶切的第三载体连接，获得第四载体； 

e）、取pIJ778载体，经Xba I酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收得到核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的壮观霉素抗性基因，与经Xba I酶切的第四载体连接，获得以pBlueScript SK(+)为骨架，用于敲除链霉菌milF基因的重组载体。 

构建出的用于敲除链霉菌milF基因的重组载体图谱如图5所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示，具有壮观霉素抗性基因、oriT转移起始位点，SEQ ID NO：6所示序列的上游核苷酸片段，SEQ ID NO:7所示序列的milF基因同源片段，SEQ ID NO:8所示序列的下游核苷酸片段。敲除链霉菌milF基因中第158位～924位共计767bp碱基。 

实施例4：用于敲除链霉菌milF基因的重组载体的构建 

以pSTV28为骨架，其构建流程如图6所示，具体为： 

a）、以链霉菌总DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示的上游引物，及核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示的下游引物，扩增得到SEQ ID NO:30所示核苷酸序列的第二核苷酸片段； 

1、PCR扩增反应液的配制，其中PrimeSTAR试剂盒购自TaKaRa： 

2、分装成2管进行PCR反应，程序为： 

经琼脂糖凝胶电泳，PCR产物用DNA胶回收试剂盒（购自上海华舜生物技术有限公司）回收，得到第二核苷酸片段，SEQ ID NO:30所示核苷酸序列。 

b）、取第二核苷酸片段，经BamH I酶切，与经BamH I和Sma I双酶切的pSTV28载体（购自Takara公司）连接，获得第三载体； 

c）、以链霉菌总DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示的上游引物，及核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示的下游引物，扩增得到SEQ ID NO:31所示核苷酸序列的第三核苷酸片段， 

1、PCR扩增反应液的配制，其中PrimeSTAR试剂盒购自TaKaRa： 

2、分装成2管进行PCR反应，程序为： 

经琼脂糖凝胶电泳，PCR产物用DNA胶回收试剂盒（购自上海华舜生物技术有限公司）回收，得到第三核苷酸片段，SEQ ID NO:31所示核苷酸序列。 

d）、取第三核苷酸片段，经Sph I和Pst I双酶切，与经Sph I和Pst I双酶切的第三载体连接，获得第四载体； 

e）、以pIJ778载体为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示的上游引物，及核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示的下游引物，扩增得到核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的壮观霉素抗性基因， 

1、PCR扩增反应液的配制，其中PrimeSTAR试剂盒购自TaKaRa： 

2、分装成2管进行PCR反应，程序为： 

经琼脂糖凝胶电泳，PCR产物用DNA胶回收试剂盒（购自上海华舜生物技术有限公司）回收，得到第三核苷酸片段，核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的壮观霉素抗性基因。 

f）、取核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的壮观霉素抗性基因经Sph I酶切，连接入经Sph I酶切的第四载体，获得以pSTV28为骨架，用于敲除链霉菌milF基因的重组载体。 

构建出的用于敲除链霉菌milF基因的重组载体图谱如图7所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示，具有壮观霉素抗性基因、oriT转移起始位点，SEQ ID NO：6所示序列的上游核苷酸片段，SEQ ID NO:9所示序列的milF基因同源片段，SEQ ID NO:10所示序列的下游核苷酸片段。敲除链霉菌milF基因中第762位～866位共计105bp碱基。 

实施例5：转化子的制备 

a）、配制培养基： 

不含抗生素的LB液体培养基：以水配制，其中，各组分的质量-体积浓度为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0，灭菌，即得。 

含有抗生素的LB固体培养基：以水配制，其中，各组分的质量-体积浓度为：25μg/mL氯霉素、50μg/mL卡那霉素、100μg/mL壮观霉素，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH7.0，高温灭菌，即得。 

含有抗生素的LB液体培养基：以水配制，其中，各组分的质量-体积浓度为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH7.0，灭菌后加入终浓度为25μg/mL氯霉素、50μg/mL卡那霉素、100μg/mL壮观霉素即得。 

b）、载体转化 

取1μL本发明实施例2提供的用于敲除链霉菌milF基因的重组载体，加入到100μL大肠杆菌ET12567(pUZ8002)的感受态细胞中，冰上放置30min后，42℃热击90s，再迅速放到冰上冷却1min，加入900μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃水浴50min；然后取水浴后所得混合液100μL涂布于含有抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。 

取培养所得单菌落，接种于不含抗生素的LB液体培养基，37℃、250rpm培养约4h，至OD₆₀₀为0.4收集菌体、离心后，用LB培养基洗涤2遍，最后加入500μL不含抗生素的LB液体培养基悬浮菌体，即为转化子。 

实施例6：milF基因被敲除的链霉菌的构建 

a）、培养基的配制 

不含抗生素的MS固体培养基：以水配置，其中各组分的质量-体积浓度为：琼脂20g/L，甘露醇20g/L，黄豆粉20g/L，灭菌，即得。 

2×YT液体培养基：以蒸馏水配置，其中胰蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，氯化钠5g/L，灭菌，即得。 

含有100μg/mL壮观霉素的MS培养基：以水配置，其中各组分的质量-体积浓度为：琼脂20g/L，甘露醇20g/L，黄豆粉20g/L，壮观霉素100μg/mL，灭菌，即得。 

b）、原始链霉菌孢子悬液的制备： 

取保藏编号为：CGMCC No.7677的链霉菌，接种于MS固体培养基，待长出孢子，洗下孢子，4000rpm离心5min，弃除上清液取孢子，加入500μL2×YT液体培养基，打散孢子后，放入50℃水浴10min，即得。 

c）、同源单交换 

取500μL原始链霉菌孢子悬液，与500μL本发明实施例5提供的转化子混合，离心去掉800μL上清。 以剩余的上清悬浮菌体，涂布于不含抗生素的MS固体培养基，28℃培养16h～20h；用1mL含有1000μg/mL的壮观霉素和500μg/mL萘啶酮酸（Nal）的无菌水覆盖培养基表面，28℃培养4d～8d，获得接合子。 

d)、同源双交换 

挑取一个经同源单交换的接合子，在含有100μg/mL壮观霉素和25μg/mL萘啶酮酸的MS固体培养基上划线，28℃培养4d～6d。取一个经同源单交换的接合子，在不含抗生素的MS固体培养基上28℃连续培养2代后，在不含抗生素的MS固体培养基上划线分离单菌落，28℃培养4d～6d；用无菌牙签挑取单菌落接种至含有100μg/mL壮观霉素的MS固体培养基上，28℃培养4d～6d；同一单菌落接种至不含壮观霉素的MS固体培养基上，28℃培养4d～6d；挑选在含有100μg/mL壮观霉素的MS培养基上不生长，而在不含壮观霉素的固体MS培养基上生长的菌落，步骤d将进一步验证其是否为milF基因被敲除的重组链霉菌。 

d)、PCR验证 

以上步同源双交换得到的菌落为模板，以SEQ ID NO:34所示核苷酸序列的上游引物及SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的下游引物进行PCR反应： 

上游引物为：5’ATACCGCCGGAGGCGTCG3’ 

下游引物为：5’CTCGGCTTCCGGTGGAGTCC3’ 

反应采用购自TaKaRa的rTaq试剂盒，按以下配比配制反应液： 

取PCR管分装，15μL/管分装，分别用牙签挑取步骤c经壮观霉素筛选得到的菌落为模板进行PCR反应（泳道4～5），同时以0.2μL实施例1制的链霉菌总DNA和实施例2制的基因敲除质粒为对照。PCR反应程序为： 

经电泳，若PCR产物大小为870bp，说明基因型与出发菌株相同，没有敲除成功；而PCR产物大小为580bp的是milF基因缺失的重组链霉菌。 

PCR结果如图8所示，其中泳道1示DNA分子标记，泳道2示本发明实施例2构建的重组载体经PCR 产生的条带，泳道3示保藏编号为CGMCC No.7677的原始链霉菌经PCR产生的条带，泳道4～5为敲除掉milF基因的链霉菌经PCR产生的条带。结果表明，采用本发明提供的方法，成功的敲除掉了吸水链霉素中的milF基因。 

实施例7：发酵验证 

a）配制培养基 

不含抗生素的MS固体培养基：以水配置，其中各组分的质量-体积浓度为：琼脂20g/L，甘露醇20g/L，黄豆粉20g/L，高温灭菌，即得。 

种子培养基：以水配置，其中各组分的质量百分数为：蔗糖1%，脱脂奶粉0.1%，蛋白胨0.35%，酵母膏0.5%，K₂PO₄0.05%，调节pH值为7.2，灭菌即得。 

发酵培养基：以水配置，其中各组分的质量百分数为：蔗糖16%，黄豆饼粉2%，酵母膏0.5%，麦芽膏0.5%，K₂HPO₄0.05%，FeSO₄·7H₂O0.005%，CaCO₃0.3%，MgSO₄0.05%；调节pH值为7.2，灭菌即得。 

b）发酵 

取本发明实施例6制得的milF基因被敲除的链霉菌和保藏编号为CGMCC No.7677的原始链霉菌分别在MS固体培养基上，28℃培养3d～4d。 

其中，保藏编号为CGMCC No.7677的原始链霉菌为对照。 

将面积为1cm²左右菌落挖到30mL种子培养基上，28℃、220rpm培养24h～30h； 

以2mL的接种量转接到发酵培养基上，28℃、220rpm培养10d。 

3）产物检测 

取培养获得的发酵液1mL，加入4mL无水甲醇，浸泡过夜后过滤。用HPLC检测发酵液中是否存在5-酮米尔贝霉素。采用相同的检测方法对5-酮米尔贝霉素A3和5-酮米尔贝霉素A4标准品检测作为对照。 

HPLC方法为：安捷伦C18反相柱(2.1-by50-mm,2μm）， 

流动相为：乙腈：水=80:20， 

检测波长为240nm， 

流动相流速为1ml/min。 

检测所得色谱图如图8所示，其中图8（a）示本发明实施例6制备的milF基因被敲除的链霉菌经发酵后，对发酵液进行HPLC检测的图谱；图8（b）示对标准品进行检测的图谱。 

结果表明，本发明实施例6制备的milF基因被敲除的链霉菌的发酵产物的HPLC检测图谱中，9.881min有峰检出，与5-酮基米尔贝霉素A3的出峰时间对应；12.191min处有峰检出，与5-酮基米尔贝霉素A4的出峰时间对应。表明：本发明构建的milF基因被敲除的链霉菌经发酵可以直接产生5-酮基米尔贝霉素 A3及5-酮基米尔贝霉素A4。而在对照菌株的HPLC检测图谱相应位置，没有峰被检出，而有米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4的峰被检出（而本发明的重组链霉菌的发酵产物无米尔贝霉素A3和A4的峰）。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。