一种基于酶促接枝的抗氧化丝素膜制备方法

摘要

本发明公开了一种基于酶促接枝的抗氧化丝素膜制备方法，属于纺织生物技术领域。本发明借助于酪氨酸酶，将具有抗氧化性的黄酮类化合物催化氧化后接枝到丝素蛋白表面；同时酶促丝素中酪氨酸与黄酮类化合物交联，增进丝素膜的抗氧化性能。具体工艺流程包括：丝素溶液准备、丝素膜制备、酶促丝素接枝黄酮类化合物、改性丝素膜后处理。通过本发明制备的丝素蛋白膜不仅抗氧化和抗菌性能得到改善，膜材料力学性能也得到提高。与基于化学交联丝素蛋白膜改性方法相比，本发明述及酶促改性方法能耗低、效率高、污染少，有利于环境保护。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于酶促接枝的抗氧化丝素膜制备方法，特别是一种利用酪氨酸酶催化具有抗氧化活性的黄酮类化合物在丝素蛋白表面接枝制备抗氧化丝素膜的方法，属于纺织生物技术领域。

背景技术

源于桑蚕丝的丝素蛋白具有良好的生物相容性，以其为原料加工的丝素蛋白膜在医用组织工程材料构建中有较广泛的用途。为改善丝素蛋白膜材料的应用性能，需借助于化学或生物的方法对丝素材料进行改性及功能化加工。

丝素蛋白膜常用的改性方法包括高温湿热处理法、化学交联改性法、与其他高分子共混法改性等。不同丝素膜改性方法中，化学改性法应用较广泛，其基本原理是利用丝素蛋白中含有较多氨基、羟基等极性反应性基团的特点，借助于化学交联剂（如戊二醛、多元羧酸等）使丝素大分子间发生交联，或与外源功能性化合物发生接枝。这类方法在改善丝素膜性能的同时也存在一定的不足，如使用的交联剂易产生有害物质残留，产生环境污染等。近年来，随着生物技术在高分子材料改性中的研究日趋深入，以生物技术进行丝素材料功能化改性的研究日益受到重视。

在丝素蛋白材料生物法改性中，具有潜在作用功效的酶制剂包括蛋白酶、谷氨酰胺转移酶、氧化还原酶（如漆酶、酪氨酸酶、辣根过氧化酶）等。其中，蛋白酶多用于丝素材料的降解；谷氨酰胺转移酶可催化丝素中谷氨酸与相邻丝素肽或外源氨基化合物接枝，但由于丝素中谷氨酸含量较少，因此该酶在丝素蛋白材料生物改性中应用较少。酪氨酸酶作为一种含铜多酚氧化酶，能催化氧化单酚、邻二酚、三酚等多种化合物，生成反应性较活泼的邻醌结构中间体，可进一步与伯胺化合物反应，实现新型化合物的合成或高分子接枝改性。丝素蛋白中氨基和具有酚羟基结构的酪氨酸含量较高，可根据这一特点，借助于酪氨酸酶的催化氧化作用，通过催化多酚化合物与丝素蛋白接枝，实现丝素蛋白功能化改性。

在不同丝素蛋白膜功能化改性加工中，具有抗氧化、抗菌消炎作用的丝素膜具有较高的医用价值和应用前景。黄酮类化合物（如黄酮醇、黄烷酮等）中含有多个与酪氨酸相似的酚羟基结构，具有抗炎症、抗氧化等多种功效。若借助于酪氨酸酶的催化氧化作用，将上述黄酮类化合物氧化，可进一步与丝素蛋白中氨基发生反应；与此同时，丝素蛋白中酪氨酸也可被酪氨酸酶氧化，继而与黄酮类化合物反应，可实现基于酶促接枝的抗氧化丝素蛋白膜的制备。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于酶促接枝的抗氧化丝素膜制备方法，所得丝素蛋白膜有较好的抗氧化及抗菌功效，拓展了丝素膜作为医用工程材料的性能。

为解决上述技术问题，本发明利用酪氨酸酶的催化氧化作用，催化具有酚羟基的黄酮类化合物与丝素蛋白发生接枝反应，提高丝素蛋白膜的应用性能。

具体工艺与步骤如下：

（1）丝素溶液制备：以溴化锂或氯化钙溶解丝素纤维，制备丝素溶液。

处理工艺处方及条件：将蚕丝加入到溴化锂或氯化钙的水溶液体系中，在30～80℃左右溶解制得浓度为10～50g/L的丝素蛋白溶液；将丝素溶液装入透析袋，在去离子水中透析后过滤，制得丝素水溶液。

（2）丝素膜制备：取丝素溶液通过延流使其平整铺展，在-50～-20℃条件下充分冷冻干燥，得到丝素蛋白膜。

（3）酶促丝素接枝黄酮类化合物：在含酚羟基的黄酮类化合物溶液中添加适量酪氨酸酶，在有氧条件下将丝素蛋白膜在上述溶液中浸渍处理，进行酶促接枝改性。

处理工艺处方及条件：酪氨酸酶相对于丝素膜的用量为1～200U/g丝素蛋白膜，丝素蛋白膜50～200g/L，黄酮类化合物0.5～10g/L，温度20～50℃，pH范围6.0～8.0，处理1～24小时。所述处理时间优选6-12小时。

（4）改性丝素膜后处理：酶促接枝白后丝素膜经2～3次室温水洗，-50～-20℃干燥后得到抗氧化丝素蛋白膜。

所述丝素溶液的制备还可选用不同浓度的溴化锂溶液、溴化锂-乙醇水溶液或氯化钙-乙醇水溶液。

所述酪氨酸酶包括了动物、植物和微生物等不同来源的酶品种。

所述黄酮类化合物均含有不同数量的酚羟基，具体包括黄酮醇、黄烷酮、黄烷酮醇、异黄酮和异黄烷酮等化合物。

本发明利用酪氨酸酶的催化氧化作用，使黄酮类化合物接枝在丝素蛋白表面，与传统化学交联法制备功能型丝素膜相比，本发明具有以下优点：

（1）酶催化效率高，利用酪氨酸酶催化黄酮类化合物与丝素蛋白接枝反应中催化效率高，酶制剂用量较少。

（2）酶处理条件缓和，在低温和近中性条件下进行抗氧化丝素膜的制备，具有能耗低、处理工艺安全的优点，避免了化学交联法反应易造成环境污染、丝素膜生物安全性低等诸多方面的缺陷。

（3）丝素膜性能改善明显，利用酪氨酸酶催化氧化含酚羟基的黄酮类化合物与丝素反应，不但改善了丝素膜的抗氧化性能，增强了丝素膜抗菌性，也提升了膜材料的力学性能。

具体实施方式

采用酪氨酸酶催化黄酮类化合物和丝素蛋白接枝，制备具有较好抗氧化与抗菌性能的丝素膜，具体实施例如下：

实施例1

（1）丝素溶液准备：将脱胶后的家蚕丝加入到溴化锂-乙醇-水（质量比45:45:10）溶液中，在60℃溶解制得50g/L丝素蛋白溶液。将丝素溶液装入透析袋，在去离子水中透析36小时，期间每小时换1次水，透析后过滤得到丝素水溶液。

（2）丝素膜制备：取定量丝素溶液倒入聚四氟乙烯（PTFE）模具中，通过延流成膜，在-50℃条件下充分干燥成膜。

（3）酶促丝素接枝黄酮类化合物：在表没食子儿茶素溶液中添加蘑菇酪氨酸酶，在持续通氧条件下进行丝素蛋白膜改性处理，其中，丝素蛋白膜的用量为100g/L，酪氨酸酶相对于丝素膜的用量为100U/g丝素蛋白膜，表没食子儿茶素2g/L，温度30℃，pH范围6.8，处理6小时。

（4）改性丝素膜后处理：酶促接枝反应后，丝素膜经3次室温水洗，在-50℃条件下干燥，得到抗氧化丝素蛋白膜。

试样1：丝素膜浸渍时仅添加表没食子儿茶素；

试样2：丝素膜经酪氨酸酶、表没食子儿茶素组合处理；

经上述工艺处理后，试样1采用ABTS法测得的丝素膜的抗氧化性为2.4%，采用GB15979-2002测得丝素膜对金黄色葡萄球菌抑菌率为8.0%，丝素膜断裂强度15.5N/cm²；试样2测得的抗氧化性为56.1%，抑菌率为36.6%，丝素膜断裂强度21.0N/cm²。

实施例2

（1）丝素溶液准备：将脱胶后的家蚕丝加入到氯化钙-乙醇-水（摩尔比1:1:7）溶液中，在70℃溶解制得25g/L丝素蛋白溶液。将丝素溶液装入透析袋，在去离子水中透析24h，期间每小时换1次水，透析后过滤得到丝素水溶液。

（2）丝素膜制备：取定量丝素溶液倒入聚四氟乙烯（PTFE）模具中，通过延流使其平整铺展，在-50℃条件下干燥。

（3）酶促丝素接枝黄酮类化合物：在儿茶素溶液中添加酪氨酸酶，在持续通氧条件下进行丝素蛋白膜改性处理，其中，丝素蛋白膜的用量为100g/L，酪氨酸酶相对于丝素膜用量为150U/g丝素，儿茶素2g/L，温度30℃，pH范围7.0，处理12小时。

（4）改性丝素膜后处理：酶促接枝反应后，丝素膜经2次室温水洗后在-50℃条件低温干燥，得到抗菌丝素蛋白膜。

试样3：丝素膜浸渍时仅添加儿茶素处理；

试样4：丝素膜经酪氨酸酶、儿茶素处理；

经上述工艺处理后，采用试样1述及的性能测试方法，测得试样3抗氧化性为4.4%，抑菌率为3.8%，丝素膜断裂强度17.0N/cm²；试样4抗氧化性为49.0%，抑菌率为37.5%，丝素膜断裂强度22.5N/cm²。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。