毛樱桃中苯丙蔗糖酯苷类化合物及其制备方法和用途

摘要

本发明属于医药技术领域,涉及樱桃中苯丙蔗糖酯苷类化合物及其制备方法，所述5个新的具有抗肿瘤活性苯丙蔗糖酯苷类化合物3-对香豆酰基-1,4,6'-三乙酰基蔗糖，3-对香豆酰基-2',3',6'-三乙酰基蔗糖，3-对香豆酰基-1,4',6'-三乙酰基蔗糖，3-对香豆酰基-3',4',6'-三乙酰基蔗糖，3-阿魏酰基-1,2',6'-三乙酰基蔗糖，五种化合物对MCF-7人乳腺癌细胞系、A-549人非小细胞性肺癌细胞、HeLa子宫颈癌细胞系、HT-29人结肠腺癌细胞系均有较好的抑制作用，有望用于制备抗肿瘤药物。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域,涉及樱桃中苯丙蔗糖酯苷类化合物及其制备方法，本发明还涉及该类新化合物在抗肿瘤生物活性方面的用途。 

背景技术

肿瘤是目前危害人类健康最严重的疾病之一，据WHO统计，肿瘤已成为人类健康头号杀手。传统的化学药物治疗和手术、放疗等结合，虽成功的提高了多种恶性肿瘤的治愈率，但由于较强的副作用以及耐药性，使得寻找新的治疗肿瘤的药物刻不容缓。许多天然植物具有活血化瘀、清热解毒、扶正固本等功效而发挥抗肿瘤作用，可作用于肿瘤发生、发展的多个环节，具有多靶点、多环节、多效应的特点。其在抑制杀伤肿瘤细胞、改善症状与体征以及减轻放化疗不良反应、延长患者生存期等方面发挥重要作用。同时其具有提高机体免疫力，不易产生耐药性等特点，其抗肿瘤活性已得到国际公认，因此，从祖国医药宝库中寻找疗效确切的抗肿瘤天然药物，明确其药效物质基础，进而开发出高效低毒的新药，成为中医药领域多年研究的焦点。 

蔷薇科植物毛樱桃（Prunus tomentosa）为广泛分布于中国北方的灌木植物，其药用历史悠久，其中毛樱桃叶温胃，健脾，止血，解毒，可治胃寒食积，腹泻，吐血，疮毒。有文献在樱桃属中报道分离到苯丙糖苷类化合物，许多苯丙糖苷类化合物具有很好抗肿瘤效果，而且毒副作用作用低，但此类化合物在植物中作为一种次级代谢产物其含量很低。但毛樱桃分布广泛，价格低廉且生存能力强，可作为大规模培育的具有潜在开发价值的药用植物来源。因此从毛樱桃中寻找抗癌活性好的活性化合物具有技术及经济基础。 

发明内容

本发明的目的旨在从毛樱桃叶中寻找新的抗肿瘤前体药物，提供该苯丙蔗糖酯苷类化合物的提取、制备方法，并且研究它们的抗肿瘤生物活性和医药用途。本发明的另一个目的在于提供该类化合物的结构鉴定方法。 

本发明所述5个新的具有抗肿瘤活性苯丙蔗糖酯苷类化合物3-对香豆酰基-1,4,6'-三乙酰基蔗糖，3-对香豆酰基-2',3',6'-三乙酰基蔗糖，3-对香豆酰基-1,4',6'-三乙酰基蔗糖，3-对香豆酰基-3',4',6'-三乙酰基蔗糖，3-阿魏酰基-1,2',6'-三乙酰基蔗糖，其结构如下所示： 

本发明所述新的苯丙蔗糖酯苷类化合物的提取、制备方法如下： 

取干燥的毛樱桃叶8～10kg用40～70L50%～80%的乙醇回流提取2～5次，每次1～3小时，合并提取液浓缩得浸膏1～1.5kg，将浸膏与2～4L水混悬后，分别采用石油醚，乙酸乙酯进行萃取，石油醚：混悬液体积比为0.6:1～1:1.5，乙酸乙酯：混悬液体积比为0.6:1～1:1.5。将乙酸乙酯萃取液浓缩得浸膏100～140g。浸膏采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统（三氯甲烷-甲醇系统）50:1～1:1逐渐洗脱，共收集15～25个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为A1～A4(50:1洗脱液为A1，30:1～10:1合并为A2，8:1～2:1合并为A3，1:1洗脱液为A4)，A2(69～90g)通过CHP20柱色谱除去部分色素后得B1(59～79g)，B1经聚酰胺柱色谱以二氯甲烷-甲醇（或其它极性相近溶剂系统，例三氯甲烷-甲醇系统）系统100:1～1:1梯度洗脱，共得10～20个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合并为C1～C3（100:1～50:1合并为C1，30:1～10:1合并为C2，5:1～1:1合并为C3）。C1经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1～1:1梯度洗脱得到20～50个馏分，通过硅胶薄层板层析检识合并为19部分D1～D19。利用HPLC法以乙腈-水为流动相在D7-D10中制备得到化合物1-5（3-桂皮酰基-1,4,6'-三乙酰基蔗糖，3-桂皮酰基-2',3',6'-三乙酰基蔗糖，3-桂皮酰基-1,4',6'-三乙酰基蔗糖，3-桂皮酰基-3',4',6'-三乙酰基蔗糖，3-阿魏酰基-1,2',6'-三乙酰基蔗糖）。 

本发明所述新的苯丙蔗糖酯苷类化合物具有较好的抗肿瘤活性。活性试验方法如下： 

1.实验材料 

1.1受试品：化合物 

1.2实验细胞株及来源MAC-7、A549、Hela、HT-29 

2.实验方法 

2.1药物处理 

药物的溶解 

化合物1-5均为粉末状，使用DMSO溶解。配成浓度为100mmol/L的母液，储存于－20℃。临用时用相应的培养液将其稀释为10mmol/L、1mmol/L、100μmol/L进行实验。DMSO配置的样品进行实验时，DMSO的终浓度为1‰。文献报道5-fluorouracil具有抗肿瘤活性且结构与待测化合物类似，因此选取5-fluorouracil作为阳性对照药，浓度分别为10mmol/L、1mmol/L、100μmol/L。 

给药处理 

取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度,接种于96孔板内，100μL/well，培养于37℃，5%CO₂的培养箱内。培养24h后，将药物稀释为10mmol/L，1mmol/L，100μmol/L三个浓度，10μL/well，作用48h。分设空白组、给药组，每组设5个复孔。 

2.2MTT法的测定方法 

药物作用48h后，将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育4h，吸除培养液后每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，完全溶解后使用酶标仪于490nm测定其光密度OD值。最后以空白组OD值为100%，计算各组细胞抑制率。 

2.3.统计方法 

全部资料采用SPSS（13.0）统计软件包进行检验分析。各组数据用均值±标准误 （Mean±S.E.）表示，采用One-Way ANOVA评价整体性差异，并进行Dunnett或Dunnett’sT3检验进行组间比较。 

3.实验结果 

表1化合物对肿瘤细胞的IC₅₀(μM/L) 

由上述实验结果可看本发明所涉药物作用48h之后，5种化合物对四种细胞株均具有一定杀伤作用。其中化合物1的作用最为明显。化合物5对MCF-7和A549的作用比较明显,化合物3对A549和Hela的作用较强。 

本发明所涉苯丙蔗糖酯苷类新化合物，对MCF-7人乳腺癌细胞系、A-549人非小细胞性肺癌细胞、HeLa子宫颈癌细胞系、HT-29人结肠腺癌细胞系等，可用于开发抗肿瘤、抗癌类药物，尤其针对临床化疗阶段药物。 

本发明制备方法简单，重现性好，提取纯度高。获得的化合物具有较好的抗肿瘤活性作用。 

附图说明

图1为1的¹H-NMR。 

图2为1的¹³C-NMR。 

图3为1的HSQC。 

图4为1的HMBC。 

图5为2的¹H-NMR。 

图6为2的¹³C-NMR。 

图7为2的HSBC。 

图8为3的¹H-NMR。 

图9为3的¹³C-NMR。 

图10为3的HMBC。 

图11为4的¹H-NMR。 

图12为4的¹³C-NMR。 

图13为4的HMBC。 

图14为5的¹H-NMR。 

图15为5的¹³C-NMR。 

图16为5的HMBC。 

具体实施方式

制备实施例1 

取干燥的毛樱桃叶9.5kg用60L70%的乙醇回流提取三次，每次两小时，合并提取液浓缩得浸膏1.2kg，将浸膏与3L水混悬后，分别用石油醚：混悬液=1:1和乙酸乙酯：混悬液=1:1萃取。将乙酸乙酯萃取液浓缩得浸膏120g。浸膏采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1逐渐洗脱，每500ml为一馏分，共收集21个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为4份A1～A4(50:1洗脱液为A1，30:1～10:1合并为A2，8:1～2:1合并为A3，1:1洗脱液为A4)，其中A2为主要馏分，重量为75g，A2通过CHP20柱色谱以90%甲醇-水（或乙醇-水）除去部分色素后得B1(69g)，B1经聚酰胺柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、1:1梯度洗脱，共得17个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合并为3部分C1～C3（100:1～50:1合并为C1，30:1～10:1合并为C2，5:1～1:1合并为C3），其中C232g，主要为黄酮类化合物，C1为18g，C3为19g。C1经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1梯度洗脱得到43个馏分，通过硅胶薄层板层析检识合并为19部分D1～D19。 

从D7中以乙腈-水系统23:77在液相色谱柱中制得化合物1，在D8中以乙腈-水系统20:80在液相色谱柱中制得化合物2，在D9中以乙腈-水系统21:79在液相色谱柱中制得化合物3和4，在D10中以乙腈-水系统21:79在液相色谱柱中制得化合物5。 

制备实施例2 

取干燥的毛樱桃叶9kg用60L65%的乙醇回流提取三次，每次三小时，合并提取液浓缩得浸膏1.3kg，将浸膏与3.5L水混悬后，分别用石油醚：混悬液=1:1和乙酸乙酯：混悬液=1:1萃取。将乙酸乙酯萃取液浓缩得浸膏130g。浸膏采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1逐渐洗脱，每500ml为一馏分，共收集21个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为4份A1～A4(50:1洗脱液为A1，30:1～10:1合并为A2，8:1～2:1合并为A3，1:1洗脱液为A4)，其中A2为主要馏分，重量为84g，A2通过CHP20柱色谱以90%甲醇-水（或乙醇-水）除去部分色素后得B1(75g)，B1经聚酰胺柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、1:1梯度洗脱，共得21个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合并为3部分C1～C3（100:1～50:1合并为C1，30:1～10:1合并为C2，5:1～1:1合并为C3），其中C239g，主要为黄酮类化合物，C1为19g，C3为17g。C1经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1梯度洗脱得到40个馏分，通过硅胶薄层板层析检识合并为22部分D1～D22。 

从D8中以乙腈-水系统24:76在液相色谱柱中制得化合物1，在D8中以乙腈-水系统19:81在液相色谱柱中制得化合物2，在D9中以乙腈-水系统21:79在液相色谱柱中制得化合物3和4，在D10中以乙腈-水系统20:80在液相色谱柱中制得化合物5。 

制备实施例3 

取干燥的毛樱桃叶8.5kg用55L70%的乙醇回流提取三次，每次二小时，合并提取液浓缩得浸膏1.1kg，将浸膏与3.0L水混悬后，分别用石油醚：混悬液=1:1和乙酸乙酯：混悬液=1:1萃取将乙酸乙酯萃取液浓缩得浸膏110g。浸膏采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、1:1逐渐洗脱，每500ml为一馏分，共收集18个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为4份A1～A4（50:1洗脱液为A1，30:1～10:1合并为A2，8:1～2:1合并为A3，1:1洗脱液为A4)，其中A2为主要馏分，重量为79g，A2通过CHP20柱色谱以90%甲醇-水（或乙醇-水）除去部分色素后得B1(71g)，B1经聚酰胺柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、1:1梯度洗脱，共得21个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合并为3部分C1～C3（100:1～50:1合并为C1，30:1～10:1 合并为C2，5:1～1:1合并为C3），其中C235g，主要为黄酮类化合物，C1为19g，C3为17g。C1经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、1:1梯度洗脱得到28个馏分，通过硅胶薄层板层析检识合并为20部分D1～D20。 

从D7中以乙腈-水系统23:77在液相色谱柱中制得化合物1，在D8中以乙腈-水系统19:81在液相色谱柱中制得化合物2，在D9中以乙腈-水系统20:80在液相色谱柱中制得化合物3和4，在D10中以乙腈-水系统20:80在液相色谱柱中制得化合物5。 

制备实施例4 

取干燥的毛樱桃叶9kg用60L75%的乙醇回流提取四次，每次二小时，合并提取液浓缩得浸膏1.2kg，将浸膏与3.5L水混悬后，分别用石油醚：混悬液=1:1和乙酸乙酯：混悬液=1:1萃取。将乙酸乙酯萃取液浓缩得浸膏120g。浸膏采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、1:1逐渐洗脱，每500ml为一馏分，共收集18个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为4份A1～A4（50:1洗脱液为A1，30:1～10:1合并为A2，8:1～2:1合并为A3，1:1洗脱液为A4)，其中A2为主要馏分，重量为81g，A2通过CHP20柱色谱以90%甲醇-水（或乙醇-水）除去部分色素后得B1(73g)，B1经聚酰胺柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、1:1梯度洗脱，共得21个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合并为3部分C1～C3（100:1～50:1合并为C1，30:1～10:1合并为C2，5:1～1:1合并为C3），其中C236g，主要为黄酮类化合物，C1为19g，C3为18g。C1经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1梯度洗脱得到32个馏分，通过硅胶薄层板层析检识合并为21部分D1～D21。 

从D7中以乙腈-水系统24:76在液相色谱柱中制得化合物1，在D8中以乙腈-水系统19:81在液相色谱柱中制得化合物2，在D9中以乙腈-水系统21:79在液相色谱柱中制得化合物3和4，在D10中以乙腈-水系统21:79在液相色谱柱中制得化合物5。 

实验例1： 

淡黄色色无定形粉末（甲醇），易溶于甲醇。高分辨质谱给出准分子离子峰m/z637.1971[M+Na]⁺，结合¹H，¹³C NMR谱，确定分子式为C₂₈H₃₆O₁₇。 

化合物1（3mg）经3ml2N三氟乙酸在密封瓶中110℃放置6h水解，反应液用15ml水稀释后用5ml乙酸乙酯萃取三次并合并，合并液用水再次萃取后将乙酸乙酯合并液旋转蒸发得粉末，粉末用甲醇溶解后用HPLC法与标准品对照显示化合物1水解物中含对香豆酸。反应液萃取后的水层加甲醇后反复旋蒸至中性干燥残渣。残渣用0.06ml吡啶溶解，然后加0.06ml六甲基二硅氮烷和0.02ml三甲基氯硅烷，混合液在60℃搅拌30min。静置后上清液用GC分析，分析结果与标准糖对照显示水解液中含D-葡萄糖和D-果糖。在¹H-NMR中，有七个连氧次甲基信号(δ_H5.47,4.43,4.08,3.39,3.57,3.25,4.12)，三个连氧乙基[δ_H4.14(2H);4.44and4.38;4.54and4.10]，二个烯烃质子[δ_H6.42,(d,J=15.9Hz);7.72(d,J=15.9Hz)]和一个AA'BB'耦合的芳烃信号[δ_H6.81(d,J=8.4Hz,2H),7.52(d,J=8.4Hz,2H)]。通过典型的α,β-不饱和酮耦合数据δc168.4,δc114.3,δc147.9,δ_H6.42,(d,J=15.9Hz)andδ_H7.72(d,J=15.9Hz)及苯环的低场区碳信号δc127.1,δc131.5,δc116.8,δc161.5,δc116.8,δc131.5可知化合物1中含有一个对香豆酰基。根据酸水解及HMBC谱中端基Hδ_H5.39(d,J=3.6Hz)与一端基碳δc93.0相关提示化合物1中含有二糖结构且为α-D-葡萄糖-(1-2)-β-D-果糖结构。 

进一步分析HMBC谱可知蔗糖上H-1(δ_H4.14,2H)、H-4(δ_H4.43)、H-6'(δ_H4.55,δ_H4.10,2H)分别与乙酰基中羰基相关，提示有三个乙酰基分别连接在此三个H上；在HMBC谱中还可以看到蔗糖H-3(δ_H5.47)和对香豆酰基的羰基相关，故化合物1结构可由此确定，命名为3-对香豆酰基-1,4,6'-三乙酰基蔗糖。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属见表2及表3，HMBC如下，相关图谱见附图1-图4。 

表2化合物1-5的¹H NMR数据 

表3化合物1-5的¹³C NMR数据 

实验例2 

淡黄色色无定形粉末（甲醇），易溶于甲醇。高分辨质谱给出准分子离子峰m/z637.1978[M+Na]⁺，结合¹H、¹³C NMR谱，确定分子式为C₂₈H₃₆O₁₇。 

化合物2（3mg）经3ml2N三氟乙酸在密封瓶中110℃放置6h水解，反应液用15ml水稀释后用5ml乙酸乙酯萃取三次并合并，合并液用水再次萃取后将乙酸乙酯合并液旋转蒸发得粉末，粉末用甲醇溶解后用HPLC法与标准品对照显示化合物2水解物中含对香豆酸。反应液萃取后的水层加甲醇后反复旋蒸至中性干燥残渣。残渣用0.06ml吡啶溶解，然后加0.06ml六甲基二硅氮烷和0.02ml三甲基氯硅烷，混合液在60℃搅拌30min。静置后上清液用GC分析，分析结果与标准糖对照显示水解液中含D-葡萄糖和D-果糖。在¹H-NMR中，有七个连氧次甲基信号，三个连氧乙基，二个烯烃质子和一个AA'BB'耦合的芳烃信号。通过典型的α,β-不饱和酮耦合数据δc168.3,δc114.6,δc147.6,δ_H6.44,(d,J=15.9Hz)andδ_H7.72(d,J=15.9Hz)及苯环的低场区碳信号δc127.1,δc131.5,δc116.8,δc161.5,δc116.8,δc131.5可知化合物2中含有一个对香豆酰基。根据酸水解及HMBC谱中端基Hδ_H5.56(d,J=3.7Hz)与一端基碳δc92.7相关提示化合物2中含有二糖结构且为α-D-葡萄糖-(1-2)-β-D-果糖结构。 

进一步分析HMBC谱可知蔗糖上H-2'、H-3'、H-6'分别与乙酰基中羰基相关，提示有三个乙酰基分别连接在此三个H上；在HMBC谱中还可以看到蔗糖H-3和对香豆酰基的羰基相关，故化合物2结构可由此确定，命名为3-对香豆酰基-2',3',6'-三乙酰基蔗糖。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属见表2、表3，HMBC如下，相关图谱见附图5-图7。 

实验例3 

淡黄色色无定形粉末（甲醇），易溶于甲醇。高分辨质谱给出准分子离子峰m/z637.1979[M+Na]⁺，结合¹H、¹³C NMR谱，确定分子式为C₂₈H₃₆O₁₇。 

化合物3（3mg）经3ml2N三氟乙酸在密封瓶中110℃放置6h水解，反应液用15ml水稀释后用5ml乙酸乙酯萃取三次并合并，合并液用水再次萃取后将乙酸乙酯合并液旋转蒸发得粉末，粉末用甲醇溶解后用HPLC法与标准品对照显示化合物3水解物中含对香豆酸。反应液萃取后的水层加甲醇后反复旋蒸至中性干燥残渣。残渣用0.06ml吡啶溶解，然后加0.06ml六甲基二硅氮烷和0.02ml三甲基氯硅烷，混合液在60℃搅拌30min。静置后上清液用GC分析，分析结果与标准糖对照显示水解液中含D-葡萄糖和D-果糖。在¹H-NMR中，有七个连氧次甲基信号，三个连氧乙基，二个烯烃质子和一个AA'BB'耦合的芳烃信号。通过典型的α,β-不饱和酮耦合数据δc168.1,δc114.3,δc147.7,δ_H6.40,(d,J=15.9Hz)andδ_H7.72(d,J=15.9Hz)及苯环的低场区碳信号δc127.1,δc131.4,δc116.9,δc161.7,δc116.9,δc131.4可知化合物3中含有一个对香豆酰基。根据酸水解及HMBC谱中端基Hδ_H5.49(d,J=3.6Hz)与一端基碳δc93.1相关提示化合物3中含有二糖结构且为α-D-葡萄糖-(1-2)-β-D-果糖结构。 

进一步分析HMBC谱可知蔗糖上H-1、H-4'、H-6'分别与乙酰基中羰基相关，提示有三个乙酰基分别连接在此三个H上；在HMBC谱中还可以看到蔗糖H-3(δ_H4.43)和对香豆酰基的羰基相关，故化合物3结构可由此确定，命名为3-对香豆酰基-1,4',6'-三乙酰基蔗糖。 其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属见表3，HMBC如下，相关图谱见附图8-图10。 

实验例4 

淡黄色色无定形粉末（甲醇），易溶于甲醇。高分辨质谱给出准分子离子峰m/z637.1970[M+Na]⁺，结合¹H、¹³C NMR谱，确定分子式为C₂₈H₃₆O₁₇。 

化合物4（3mg）经3ml2N三氟乙酸在密封瓶中110℃放置6h水解，反应液用15ml水稀释后用5ml乙酸乙酯萃取三次并合并，合并液用水再次萃取后将乙酸乙酯合并液旋转蒸发得粉末，粉末用甲醇溶解后用HPLC法与标准品对照显示4水解物中含对香豆酸。反应液萃取后的水层加甲醇后反复旋蒸至中性干燥残渣。残渣用0.06ml吡啶溶解，然后加0.06ml六甲基二硅氮烷和0.02ml三甲基氯硅烷，混合液在60℃搅拌30min。静置后上清液用GC分析，分析结果与标准糖对照显示水解液中含D-葡萄糖和D-果糖。在¹H-NMR中，有七个连氧次甲基信号，三个连氧乙基，二个烯烃质子和一个AA'BB'耦合的芳烃信号。通过典型的α,β-不饱和酮耦合数据δc168.1,δc114.6,δc147.7,δ_H6.42,(d,J=15.9Hz)andδ_H7.74(d,J=15.9Hz)及苯环的低场区碳信号δc127.3,δc131.5,δc116.8,δc161.4,δc116.8,δc131.5可知化合物4中含有一个对香豆酰基。根据酸水解及HMBC谱中端基Hδ_H5.54(d,J=3.6Hz)与端基碳δc92.8相关提示化合物4中含有二糖结构且为α-D-葡萄糖-(1-2)-β-D-果糖结构。 

进一步分析HMBC谱可知蔗糖上H-3'、H-4'、H-6'分别与乙酰基中羰基相关，提示有三个乙酰基分别连接在此三个H上；在HMBC谱中还可以看到蔗糖H-3(δ_H5.40)和对香豆酰基的羰基相关，故化合物4结构可由此确定，命名为3-对香豆酰基-3',4',6'-三乙酰基蔗糖。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属见表3，HMBC如下，相关图谱见附图11-图13。 

实验例5 

淡黄色色无定形粉末（甲醇），易溶于甲醇。高分辨质谱给 出准分子离子峰m/z637.1970[M+Na]⁺，结合¹H、¹³C NMR谱，确定分子式为C₂₉H₃₈O₁₈。 

化合物5（3mg）经3ml2N三氟乙酸在密封瓶中110℃放置6h水解，反应液用15ml水稀释后用5ml乙酸乙酯萃取三次并合并，合并液用水再次萃取后将乙酸乙酯合并液旋转蒸发得粉末，粉末用甲醇溶解后用HPLC法与标准品对照显示化合物5水解物中含对香豆酸。反应液萃取后的水层加甲醇后反复旋蒸至中性干燥残渣。残渣用0.06ml吡啶溶解，然后加0.06ml六甲基二硅氮烷和0.02ml三甲基氯硅烷，混合液在60℃搅拌30min。静置后上清液用GC分析，分析结果与标准糖对照显示水解液中含D-葡萄糖和D-果糖。在¹H-NMR中，有七个连氧次甲基信号，三个连氧乙基，二个烯烃质子和一个ABX耦合的芳烃信号。通过典型的α,β-不饱和酮耦合数据δc168.3,δc114.5,δc148.2,δ_H6.47,(d,J=15.8Hz)andδ_H7.71(d,J=15.8Hz)及苯环的低场区碳信号δc127.6,δc112.0,δc149.4,δc150.9,δc116.5,δc124.5可知化合物5中含有一个阿魏酰基。根据酸水解及HMBC谱中端基Hδ_H5.57(d,J=3.6Hz)与一端基碳δc90.8相关提示化合物5中含有二糖结构且为α-D-葡萄糖-(1-2)-β-D-果糖结构。 

进一步分析HMBC谱可知蔗糖上H-1、H-2'、H-6'分别与乙酰基中羰基相关，提示有三个乙酰基分别连接在此三个H上；在HMBC谱中还可以看到蔗糖H-3(δ_H5.42)和阿魏酰基的羰基相关，故化合物5结构可由此确定。命名为3-阿魏酰基-1,2',6'-三乙酰基蔗糖。其 ¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属见表3，HMBC如下，相关图谱见附图14-图16。