一株大肠杆菌菌株以及将菌株灭活得到的奶牛乳房炎疫苗

摘要

本发明公开了一株大肠杆菌菌株以及将菌株灭活得到的奶牛乳房炎疫苗。本发明提供的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）EBMO9，简称菌株EBMO9，保藏号为CGMCC No.8532。本发明还保护所述菌株EBMO9在制备奶牛乳房炎疫苗中的应用。本发明还保护一种奶牛乳房炎疫苗，其活性成分为灭活后的菌株EBMO9。本发明为安全、高效、全面有效预防大肠杆菌感染性奶牛乳房炎提供了有力保证，将是奶牛大肠杆菌乳房炎疫苗发展的新里程碑。

说明书

技术领域

本发明涉及一株大肠杆菌菌株以及将菌株灭活得到的奶牛乳房炎疫苗。

背景技术

奶牛乳房炎（Bovine Mastitis）是危害畜牧业发展、食品安全的重大传染病，特别是近年来，随着环境的改变、抗生素的滥用，产生了多种耐药菌甚至出现了超级细菌，由细菌感染引发的奶牛乳房炎发病率和死亡率逐年攀升，严重危害了畜牧业发展和食品安全，进而危害了人类健康。因奶牛乳房炎造成的经济损失，美国每年达30亿美元、英国4亿美元，我国35亿元以上。奶牛乳房炎分为临床型和隐性型。临床型的症状为：乳区发热、肿痛，泌乳量减少，乳清性状发生改变，细菌数增多、体细胞增加，重者并发多器官衰竭甚至死亡。隐性型没有特异的临床表现，通过体细胞、产奶量及质量检测才能检出，但奶牛罹患率比临床型高得多，造成病原微生物的进一步播散，在一定条件下会转化成临床型，实际损失比临床型高得多。

引发奶牛乳房炎的病原菌均达140余种。据临床流行病学资料显示，我国奶牛乳房炎的病原菌以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌为主，占细菌感染的91.4%，其中大肠杆菌占30%。基于O抗原大肠杆菌可分为多个血清型，奶牛乳房炎可能由一种血清型的大肠杆菌引起的，也可能是由多个血清型的大肠杆菌的混合物引起的。

发明内容

本发明的目的是提供一株大肠杆菌菌株以及将菌株灭活得到的奶牛乳房炎疫苗。

本发明提供的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）EBMO9，简称菌株EBMO9，已于2013年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8532。

本发明还保护所述菌株EBMO9在制备奶牛乳房炎疫苗中的应用。所述奶牛乳房炎为大肠杆菌引起的奶牛乳房炎。所述大肠杆菌具体可为所述菌株EBMO9、大肠杆菌重组工程菌株X-10、大肠杆菌重组工程菌株X-89、大肠杆菌重组工程菌株X-326、大肠杆菌重组工程菌株X-2138、大肠杆菌重组工程菌株X-2555、大肠杆菌ATCC31617、大肠杆菌ATCC55235、大肠杆菌ATCC43895或大肠杆菌ATCC25922。

本发明还保护一种奶牛乳房炎疫苗，其活性成分为灭活后的菌株EBMO9。

所述“灭活后的菌株EBMO9”可通过将所述菌株EBMO9进行甲醛灭活得到。所述“灭活后的菌株EBMO9”具体通过如下方法得到：取菌株EBMO9，用PBS缓冲液重悬，然后加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％（体积比）,37℃、150rpm振荡孵育36-48h，离心（离心参数具体可为：5000r/min,20min）收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，得到“灭活后的菌株EBMO9”（含1×10¹⁰个细菌/mL）。

所述疫苗还可包括佐剂。所述佐剂可为SP01佐剂、SP02佐剂、铝佐剂或白花油佐剂。

所述SP01佐剂具体如下：溶剂为水，含2g/100mL角鲨烯、0.1g/100mL聚氧乙烯蓖麻油和0.1g/100mL聚醚多元醇。

所述SP02佐剂具体如下：溶剂为水，含2g/100mL角鲨烯、0.1g/100mL聚氧乙烯蓖麻油、0.1g/100mL聚醚多元醇和10μg/100ml细菌鞭毛。

所述铝佐剂具体可为氢氧化铝或磷酸铝。

所述疫苗具体可为如下疫苗-Ⅰ、疫苗-Ⅱ、疫苗-Ⅲ、疫苗-Ⅳ、疫苗-Ⅴ或疫苗-Ⅵ：

疫苗-Ⅰ：取菌株EBMO9，用PBS缓冲液重悬，然后加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％（体积比）,37℃、150rpm振荡孵育36-48h，离心（离心参数具体可为：5000r/min,20min）收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，得到疫苗-Ⅰ（含1×10¹⁰个细菌/mL）；

疫苗-Ⅱ：取所述疫苗-Ⅰ，加入氢氧化铝并使其浓度为0.5mg/ml，得到疫苗-Ⅱ；

疫苗-Ⅲ：取所述疫苗-Ⅰ，加入磷酸铝并使其浓度为0.5mg/ml，得到疫苗-Ⅲ；

疫苗-Ⅳ：取菌株EBMO9，用PBS缓冲液重悬，然后加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％（体积比）,37℃、150rpm振荡孵育36-48h，离心（离心参数具体可为：5000r/min,20min）收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用1体积份灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，然后加入1体积份SP01佐剂，得到疫苗-Ⅳ（含1×10¹⁰个细菌/mL）；

疫苗-Ⅴ：取菌株EBMO9，用PBS缓冲液重悬，然后加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％（体积比）,37℃、150rpm振荡孵育36-48h，离心（离心参数具体可为：5000r/min,20min）收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用1体积份灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，然后加入1体积份SP02佐剂，得到疫苗-Ⅴ（含1×10¹⁰个细菌/mL）；

疫苗-Ⅵ：取菌株EBMO9，用PBS缓冲液重悬，然后加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％（体积比）,37℃、150rpm振荡孵育36-48h，离心（离心参数具体可为：5000r/min,20min）收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用1体积份灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，然后加入1体积份白花油佐剂，得到疫苗-Ⅵ（含1×10¹⁰个细菌/mL）。

所述疫苗的剂型可为皮下注射剂型、乳头管注射剂型或肌肉注射剂型。

所述奶牛乳房炎为大肠杆菌引起的奶牛乳房炎。所述大肠杆菌具体可为所述菌株EBMO9、大肠杆菌重组工程菌株X-10、大肠杆菌重组工程菌株X-89、大肠杆菌重组工程菌株X-326、大肠杆菌重组工程菌株X-2138、大肠杆菌重组工程菌株X-2555、大肠杆菌ATCC31617、大肠杆菌ATCC55235、大肠杆菌ATCC43895或大肠杆菌ATCC25922。

以上任一所述奶牛具体可为中国荷斯坦奶牛。

对于奶牛乳房炎来说，最理想的防控手段为通过接种疫苗，其目的就是增强机体免疫应答反应，特别是乳腺组织的免疫应答反应来阻止、中和、杀灭外界进入的病原微生物，但由于乳房本身的生理特点给有效免疫力的产生带来了了一系列特殊的挑战。第一，乳腺中的牛奶会稀释抗感染的嗜中性粒细胞的浓度，而且牛奶中的一些成分，像脂肪和酪蛋白能降低抗感染嗜中性粒细胞的杀菌能力。第二，奶牛饲养有大量可引起乳房炎的微生物的环境中，而且奶汁本身给病原菌生长提供了温床。因此，使奶牛乳腺产生有效的免疫力，降低乳房炎的发生率，需要攻克的难题较多，给奶牛乳房炎疫苗研发提出比其它传染病疫苗更高的要求。

疫苗是通过增强机体免疫系统的功能从而使机体获得天然的抗病能力，并且疫苗具有安全、稳定、有效等特点，因此研制安全、有效的奶牛乳房炎疫苗成为防控乳房炎的必由选择。研发适宜本国流行代表菌株和环境的疫苗势在必行。大肠杆菌是引起急性和亚急性乳房炎的主要环境病原菌，种型繁多，重要抗原有O、K、H3种，且多数有荚膜、菌毛等。为了防止不同种型细菌感染，疫苗要么含大量的不同抗原，要么只含不同细菌共有的保护性抗原。本发明中，把变异较大的大肠杆菌寡糖侧链缺失而使其共同核心抗原暴露在外，刺激产生的免疫球蛋白能够抵抗革兰氏阴性菌的核心抗原，对种类繁多的大肠杆菌均产生保护。

本发明提供的疫苗具有高效、通用、安全、稳定、剂型多样等优点，本发明为安全、高效、全面有效预防大肠杆菌感染性奶牛乳房炎提供了有力保证，将是奶牛大肠杆菌乳房炎疫苗发展的新里程碑。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的PBS缓冲液，如无特殊说明均为pH7.2、0.01M的无热源PBS缓冲液。

大肠杆菌重组工程菌株X-10、大肠杆菌重组工程菌株X-89、大肠杆菌重组工程菌株X-326、大肠杆菌重组工程菌株X-2138和大肠杆菌重组工程菌株X-2555均记载于如下文献：奶牛大肠杆菌乳房炎灭活疫苗及其制备方法（申请号：201010550056.6；申请公开号CN101991846A）。

角鲨烯：购于SIGMA公司，目录号为442785。聚氧乙烯蓖麻油（密度1.05g/ml at25℃，粘度850cP）：购于SIGMA公司，目录号为C5135。聚醚多元醇（密度1.05g/mlat25℃，粘度850cP）：购于SIGMA公司，目录号为435449。SP01佐剂：溶剂为水，含2g/100mL角鲨烯、0.1g/100mL聚氧乙烯蓖麻油和0.1g/100mL聚醚多元醇。SP02佐剂：溶剂为水，含2g/100mL角鲨烯、0.1g/100mL聚氧乙烯蓖麻油、0.1g/100mL聚醚多元醇和10μg/100ml细菌鞭毛。白花油佐剂：购自法国Esso公司，批号122735。Balb/C小鼠：购自军事医学科学院实验动物中心。奶牛（中国荷斯坦奶牛）：购于内蒙古赤峰丰裕奶牛养殖场。

实施例1、重组菌的获得和保藏

一、筛选野生菌

从内蒙古、重庆、广州、黑龙江、兰州、河北、山东等30个省市地的90个中大型奶牛场采集3万份奶牛乳样。奶牛乳样的采集方法：选取出现乳房炎临床症状(或者怀疑为亚临床型乳房炎)的奶牛，先用温水擦洗乳房，再用0.2％新洁尔灭擦洗乳房，最后用70％酒精擦拭乳头，采样者同时用70％酒精擦拭手指消毒，每个乳室先挤去头2-3把奶，以排除污染的杂菌，每头奶牛取乳样至少5mL于无菌乳样杯中。

从乳样中分离纯化大肠杆菌菌株。大肠杆菌的菌落形态特征（37℃，培养24-72h）：（1）TSA培养基平板：可见光滑、湿润、表面有光泽、隆起的圆形乳白色菌落，挑取典型菌落涂片、染色并镜检，呈直杆状，单个或成对；（2）营养肉汤：呈浑浊生长；（3）麦康凯培养基：菌落呈圆形、粉红色、光滑、湿润、表面有光泽、全缘；（4）血琼脂平板（新鲜脱纤维绵羊血）：生长并形成灰白色菌落，无溶血现象。大肠杆菌的生理生化特征：（1）氧化酶试验：阴性；（2）糖发酵试验：能分解葡萄糖、乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、麦芽糖、木糖、棉子糖产酸，不能利用丙二酸盐、枸橼酸盐、山梨醇、侧金盏花醇；（3）甲基红阳性；（4）苯丙氨酸脱氢酶试验：阴性；（5）硫化氢试验：阴性；（6）脲酶试验：阴性；（7）硝酸盐还原反应：阳性；（8）明胶液化反应：阴性；（9）凝固酶反应：阴性；（10）DNA酶试验：阴性；（11）接触酶反应：阳性；（12）革兰氏阴性。大肠杆菌的16Sr RNA的编码基因的保守片段如序列表的序列1所示。将分离得到的大肠杆菌分别进行全基因组测序，全基因组测序结果相同的菌株为同一菌株。一株大肠杆菌存在于27368份乳样中，表明该大肠杆菌为我国的流行优势株，将其命名为菌株66。

将菌株66分别注射给6-8周龄BALB/c小鼠（每只通过腹腔注射3×10⁸CFU）、1.5-2岁家兔（每只通过腹腔注射1×10⁹CFU）和2-5岁奶牛（每只通过乳头管注射600CFU）。观察表征发现：菌株66可使BALB/c小鼠和家兔发病，有些动物甚至在1周内死亡；菌株66可引起奶牛发生乳房炎。分别取发病小鼠的肝脏、发病家兔的肝脏、发病奶牛的乳房，进行病原菌重分离，将重分离得到的菌株进行全基因组测序，均与菌株66的测序结果一致。

二、构建重组菌

1、取菌株66，通过构建自杀致死质粒pCVD442-galE，运用同源重组的方法敲除参与脂多糖合成的galE基因，得到1株重组菌（P0代）。

2、将步骤1得到的重组菌，划线接种至TSA培养基平板，37℃静置培养18-24小时，然后用5g/100ml的脱脂奶粉水溶液冲洗并收集平板上的菌落，分装于冻存管（P1代），-70℃以下保存。

3、取步骤2得到的冻存管，室温解冻，然后接种至TSB培养基，37℃、150rpm振荡培养18-24小时，每100毫升加入5g脱脂奶粉，分装于冻存管（P2代），-70℃以下保存。

4、取步骤3得到的冻存管，室温解冻，然后接种至TSB培养基，37℃、150rpm振荡培养18-24小时，加入等体积甘油，分装于冻存管（P3代），-70℃以下保存。

将该株重组菌命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）EBMO9，简称菌株EBMO9。

P3代菌株EBMO9已于2013年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8532。

实施例2、菌株EBMO9的特性

将实施例1的步骤二的4得到的冻存管室温解冻，将P3代菌株EBMO9进行如下步骤：

一、菌株EBMO9的免疫原性

将P3代菌株EBMO9免疫家兔（单次免疫，每只通过皮下注射5×10⁷CFU/ml，每只注射1毫升），21天后心脏取血，分离血清。通过ELISA检测血清的IgG抗体效价（用PBST缓冲液梯度稀释，得到血清稀释液；将P3代菌株EBMO9作为包被原，包被浓度为1×10⁹个菌/ml；采用羊抗兔IgG酶标二抗；设置阴性对照，即用PBST缓冲液代替血清稀释液；检测450nm的吸光值；吸光值为阴性对照的2.1倍以上判断为阳性），为1：12800。

二、其它对比菌株的免疫原性

将其它菌株（大肠杆菌重组工程菌株X-10、大肠杆菌重组工程菌株X-89、大肠杆菌重组工程菌株X-326、大肠杆菌重组工程菌株X-2138或大肠杆菌重组工程菌株X-2555）代替P3代菌株EBMO9，按照步骤一的方法进行检测（检测哪个菌株的免疫原性即采用哪个菌株作为包被原，其它同步骤一），血清的效价均为1：3200。

三、菌株EBMO9免疫后得到的血清对大肠杆菌的普适性

将P3代菌株EBMO9免疫家兔（方式同步骤一），21天后心脏取血，分离血清。通过ELISA检测血清的IgG抗体效价（采用待测菌代替P3代菌株EBMO9作为包被原，其它同步骤一）。待测菌分别为：大肠杆菌重组工程菌株X-10、大肠杆菌重组工程菌株X-89、大肠杆菌重组工程菌株X-326、大肠杆菌重组工程菌株X-2138、大肠杆菌重组工程菌株X-2555、大肠杆菌ATCC31617、大肠杆菌ATCC55235、大肠杆菌ATCC43895。血清对各个待测菌的效价均为1：6400。

四、菌株EBMO9的稳定性

取P3代菌株EBMO9，接种至TSB培养基，37℃、150rpm振荡培养18-24小时，得到P4代重组菌。采用上述方法进行连续传代，传至P30代。分别将P3代、P5代、P10代、P15代、P20代、P25代和P30代菌进行全基因组测序，测序结果均一致，表明本发明提供的菌株EBMO9非常稳定。

实施例3、疫苗的制备

将实施例1的步骤二的4得到的冻存管室温解冻，将P3代菌株EBMO9进行如下步骤：

1、取P3代菌株EBMO9，用PBS缓冲液重悬。

2、取步骤1得到的菌液，加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％（体积比）,37℃、150rpm振荡孵育36h（实际应用中36h-48h均可），离心（5000r/min,20min）收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，得到疫苗-Ⅰ（含1×10¹⁰个细菌/mL）。

3、取疫苗-Ⅰ，加入氢氧化铝并使其浓度为0.5mg/ml，得到疫苗-Ⅱ。

4、取疫苗-Ⅰ，加入磷酸铝并使其浓度为0.5mg/ml，得到疫苗-Ⅲ。

5、取步骤1得到的菌液，加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％（体积比）,37℃、150rpm振荡孵育36h（实际应用中36h-48h均可），离心（5000r/min,20min）收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用1体积份灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，然后加入1体积份SP01佐剂，得到疫苗-Ⅳ（含1×10¹⁰个细菌/mL）。

6、取步骤1得到的菌液，加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％（体积比）,37℃、150rpm振荡孵育36h（实际应用中36h-48h均可），离心（5000r/min,20min）收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用1体积份灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，然后加入1体积份SP02佐剂，得到疫苗-Ⅴ（含1×10¹⁰个细菌/mL）。

7、取步骤1得到的菌液，加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％（体积比）,37℃、150rpm振荡孵育36h（实际应用中36h-48h均可），离心（5000r/min,20min）收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用1体积份灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，然后加入1体积份白花油佐剂，得到疫苗-Ⅵ（含1×10¹⁰个细菌/mL）。

将各个疫苗置于2-8℃保存备用。

实施例4、疫苗的效果

一、小鼠实验

6-8周Balb/C小鼠，分成7组，每组10只，分组免疫如下（皮下注射）：

第一组：实验第1天和实验第15天各免疫一次疫苗-Ⅰ，每次免疫0.25毫升；

第二组：实验第1天和实验第15天各免疫一次疫苗-Ⅱ，每次免疫0.25毫升；

第三组：实验第1天和实验第15天各免疫一次疫苗-Ⅲ，每次免疫0.25毫升；

第四组：实验第1天和实验第15天各免疫一次疫苗-Ⅳ，每次免疫0.25毫升；

第五组：实验第1天和实验第15天各免疫一次疫苗-Ⅴ，每次免疫0.25毫升；

第六组：实验第1天和实验第15天各免疫一次疫苗-Ⅵ，每次免疫0.25毫升；

第七组（阴性对照）：实验第1天和实验第15天各免疫一次PBS缓冲液，每次免疫0.25毫升。

实验第29天，尾静脉取血并分离血清。通过ELISA检测血清的IgG抗体效价（用PBST缓冲液梯度稀释，得到血清稀释液；将P3代菌株EBMO9作为包被原，包被浓度为1×10⁹个菌/ml；采用兔抗鼠IgG酶标二抗；检测450nm的吸光值；吸光值为阴性对照的2.1倍以上判断为阳性）。第一组实验动物得到的血清的效价为1:12800，第二组实验动物得到的血清、第三组实验动物得到的血清和第六组实验动物得到的血清的效价均为1:51200，第四组实验动物得到的血清和第五组实验动物得到的血清的效价为1:102400。结果表明：添加佐剂的效果优于不添加佐剂，添加SP01佐剂或SP02佐剂的效果优于添加铝盐佐剂（氢氧化铝或磷酸铝）或白花油佐剂。

二、奶牛实验

2-5岁即将进入泌乳期（即产前25d，怀孕8个月20d）的健康奶牛，分成37组，每组100头，分组免疫如下：

第一组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅰ，每次免疫1毫升（乳头管单点注射）；

第二组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅰ，每次免疫5毫升（乳头管单点注射）；

第三组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅱ，每次免疫1毫升（乳头管单点注射）；

第四组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅱ，每次免疫5毫升（乳头管单点注射）；

第五组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅲ，每次免疫1毫升（乳头管单点注射）；

第六组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅲ，每次免疫5毫升（乳头管单点注射）；

第七组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅳ，每次免疫1毫升（乳头管单点注射）；

第八组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅳ，每次免疫5毫升（乳头管单点注射）；

第九组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅴ，每次免疫1毫升（乳头管单点注射）；

第十组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅴ，每次免疫5毫升（乳头管单点注射）；

第十一组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅵ，每次免疫1毫升（乳头管单点注射）；

第十二组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅵ，每次免疫5毫升（乳头管单点注射）；

第十三组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅰ，每次免疫1毫升（颈部双侧皮下注射）；

第十四组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅰ，每次免疫5毫升（颈部双侧皮下注射）；

第十五组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅱ，每次免疫1毫升（颈部双侧皮下注射）；

第十六组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅱ，每次免疫5毫升（颈部双侧皮下注射）；

第十七组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅲ，每次免疫1毫升（颈部双侧皮下注射）；

第十八组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅲ，每次免疫5毫升（颈部双侧皮下注射）；

第十九组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅳ，每次免疫1毫升（颈部双侧皮下注射）；

第二十组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅳ，每次免疫5毫升（颈部双侧皮下注射）；

第二十一组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅴ，每次免疫1毫升（颈部双侧皮下注射）；

第二十二组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅴ，每次免疫5毫升（颈部双侧皮下注射）；

第二十三组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅵ，每次免疫1毫升（颈部双侧皮下注射）；

第二十四组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅵ，每次免疫5毫升（颈部双侧皮下注射）；

第二十五组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅰ，每次免疫1毫升（颈部肌肉单点注射）；

第二十六组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅰ，每次免疫5毫升（颈部肌肉单点注射）；

第二十七组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅱ，每次免疫1毫升（颈部肌肉单点注射）；

第二十八组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅱ，每次免疫5毫升（颈部肌肉单点注射）；

第二十九组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅲ，每次免疫1毫升（颈部肌肉单点注射）；

第三十组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅲ，每次免疫5毫升（颈部肌肉单点注射）；

第三十一组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅳ，每次免疫1毫升（颈部肌肉单点注射）；

第三十二组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅳ，每次免疫5毫升（颈部肌肉单点注射）；

第三十三组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅴ，每次免疫1毫升（颈部肌肉单点注射）；

第三十四组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅴ，每次免疫5毫升（颈部肌肉单点注射）；

第三十五组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅵ，每次免疫1毫升（颈部肌肉单点注射）；

第三十六组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次疫苗-Ⅵ，每次免疫5毫升（颈部肌肉单点注射）；

第三十七组（阴性对照）：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次PBS缓冲液，每次免疫5毫升（颈部双侧皮下注射）。

实验第71天，颈部静脉取血并分离血清。通过ELISA检测血清的IgG抗体效价（用PBST缓冲液梯度稀释，得到血清稀释液；将P3代菌株EBMO9作为包被原，包被浓度为1×10⁹个菌/ml；采用羊抗牛IgG酶标二抗；检测450nm的吸光值；吸光值为阴性对照的2.1倍以上判断为阳性）。实验第71天，取乳清。通过ELISA检测乳清的sIgA抗体效价（用PBST缓冲液梯度稀释，得到乳清稀释液；将P3代菌株EBMO9作为包被原，包被浓度为1×10⁹个菌/ml；采用羊抗牛sIgA酶标二抗；检测450nm的吸光值；吸光值为阴性对照的2.1倍以上判断为阳性）。

第一组实验动物得到的血清的效价为1:51200，第二组实验动物得到的血清的效价为1:102400，第三组实验动物得到的血清、第五组实验动物得到的血清和第十一组实验动物得到的血清的效价均为1:102400，第四组实验动物得到的血清、第六组实验动物得到的血清和第十二组实验动物得到的血清的效价均为1:204800，第七组实验动物得到的血清和第九组实验动物得到的血清的效价均为1:204800，第八组实验动物得到的血清和第十组实验动物得到的血清的效价均为1:409600。

第十三组实验动物得到的血清的效价为1:204800，第十四组实验动物得到的血清的效价为1:409600，第十五组实验动物得到的血清、第十七组实验动物得到的血清和第二十三组实验动物得到的血清的效价均为1:409600，第十六组实验动物得到的血清、第十八组实验动物得到的血清和第二十四组实验动物得到的血清的效价均为1:819200，第十九组实验动物得到的血清和第二十一组实验动物得到的血清的效价均为1:819200，第二十组实验动物得到的血清和第二十二组实验动物得到的血清的效价均为1:1638400。

第二十五组实验动物得到的血清的效价为1:102400，第二十六组实验动物得到的血清的效价为1:204800，第二十七组实验动物得到的血清、第二十九组实验动物得到的血清和第三十五组实验动物得到的血清的效价均为1:204800，第二十八组实验动物得到的血清、第三十组实验动物得到的血清和第三十六组实验动物得到的血清的效价均为1:409600，第三十一组实验动物得到的血清和第三十三组实验动物得到的血清的效价均为1:409600，第三十二组实验动物得到的血清和第三十四组实验动物得到的血清的效价均为1:819200。

第一组实验动物得到的乳清的效价为1:51200，第二组实验动物得到的乳清的效价为1:102400，第三组实验动物得到的乳清、第五组实验动物得到的乳清和第十一组实验动物得到的乳清的效价均为1:102400，第四组实验动物得到的乳清、第六组实验动物得到的乳清和第十二组实验动物得到的乳清的效价均为1:204800，第七组实验动物得到的乳清和第九组实验动物得到的乳清的效价均为1:204800，第八组实验动物得到的乳清和第十组实验动物得到的乳清的效价均为1:409600。

第十三组实验动物得到的乳清的效价为1:25600，第十四组实验动物得到的乳清的效价为1:51200，第十五组实验动物得到的乳清、第十七组实验动物得到的乳清和第二十三组实验动物得到的乳清的效价均为1:51200，第十六组实验动物得到的乳清、第十八组实验动物得到的乳清和第二十四组实验动物得到的乳清的效价均为1:102400，第十九组实验动物得到的乳清和第二十一组实验动物得到的乳清的效价均为1:102400，第二十组实验动物得到的乳清和第二十二组实验动物得到的乳清的效价均为1:204800。

第二十五组实验动物得到的乳清的效价为1:12800，第二十六组实验动物得到的乳清的效价为1:25600，第二十七组实验动物得到的乳清、第二十九组实验动物得到的乳清和第三十五组实验动物得到的乳清的效价均为1:25600，第二十八组实验动物得到的乳清、第三十组实验动物得到的乳清和第三十六组实验动物得到的乳清的效价均为1:51200，第三十一组实验动物得到的乳清和第三十三组实验动物得到的乳清的效价均为1:51200，第三十二组实验动物得到的乳清和第三十四组实验动物得到的乳清的效价均为1:102400。

实验第71天，取血后，用大肠杆菌ATCC25922进行攻毒（使用乳针将600CFU大肠杆菌注入乳房内），实验第72天-实验第85天为结果评判期。结果评判期中，只要满足如下（a）、（b）、（c）和（d）四项中的两项或两项以上，则判断为乳房炎发病个体：（a）相对阴性对照组的平均体温，体温高1.5-2.5℃；（b）乳清内有凝块和/或血液和/或脓液；（c）奶牛乳房出现红和/或肿和/或发热的症状；（d）相对阴性对照组的平均泌乳量，泌乳量降低。保护率=（该组奶牛总个体数量-该组奶牛乳房炎发病个体数量/该组奶牛总个体数量）×100%。

第一组实验动物的保护率为95%，第二组实验动物的保护率为96%，第三组实验动物、第五组实验动物和第十一组实验动物的保护率均为96%，第四组实验动物、第六组实验动物和第十二组实验动物的保护率均为97%，第七组实验动物和第九组实验动物的保护率均为97%，第八组实验动物和第十组实验动物的保护率均为98%。

第十三组实验动物的保护率为97%，第十四组实验动物的保护率为98%，第十五组实验动物、第十七组实验动物和第二十三组实验动物的保护率均为98%，第十六组实验动物、第十八组实验动物和第二十四组实验动物的保护率均为99%，第十九组实验动物和第二十一组实验动物的保护率均为99%，第二十组实验动物和第二十二组实验动物的保护率均为100%。

第二十五组实验动物的保护率为96%，第二十六组实验动物的保护率为97%，第二十七组实验动物、第二十九组实验动物和第三十五组实验动物的保护率均为97%，第二十八组实验动物、第三十组实验动物和第三十六组实验动物的保护率均为98%，第三十一组实验动物和第三十三组实验动物的保护率均为98%，第三十二组实验动物和第三十四组实验动物的保护率均为99%。

第三十七组实验动物的保护率为0%。

结果表明：添加佐剂的效果优于不添加佐剂，添加SP01佐剂或SP02佐剂的效果优于添加铝盐佐剂（氢氧化铝或磷酸铝）或白花油佐剂；高剂量的效果优于低剂量。

三、长效免疫保护效果（自然发病）

2-5岁即将进入泌乳期（即产前25d，怀孕8个月20d）的健康奶牛，分成37组，每组100只，分组免疫如下：实验第1天、实验第29天、实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)和实验第368天各免疫一次疫苗，免疫分组方式、单次免疫剂量和免疫方式均同步骤二。实验第700天-实验第714天为结果评判1期，实验第1070天-实验第1083天为结果评判2期。结果评判方法同步骤二。

结果评判1期：第一组实验动物的保护率为92%，第二组实验动物的保护率为93%，第三组实验动物、第五组实验动物和第十一组实验动物的保护率均为93%，第四组实验动物、第六组实验动物和第十二组实验动物的保护率均为94%，第七组实验动物和第九组实验动物的保护率均为94%，第八组实验动物和第十组实验动物的保护率均为95%；第十三组实验动物的保护率为94%，第十四组实验动物的保护率为95%，第十五组实验动物、第十七组实验动物和第二十三组实验动物的保护率均为95%，第十六组实验动物、第十八组实验动物和第二十四组实验动物的保护率均为96%，第十九组实验动物和第二十一组实验动物的保护率均为96%，第二十组实验动物和第二十二组实验动物的保护率均为97%；第二十五组实验动物的保护率为93%，第二十六组实验动物的保护率为94%，第二十七组实验动物、第二十九组实验动物和第三十五组实验动物的保护率均为94%，第二十八组实验动物、第三十组实验动物和第三十六组实验动物的保护率均为95%，第三十一组实验动物和第三十三组实验动物的保护率均为95%，第三十二组实验动物和第三十四组实验动物的保护率均为96%；第三十七组实验动物的保护率为45%。

结果评判2期：第一组实验动物的保护率为91%，第二组实验动物的保护率为92%，第三组实验动物、第五组实验动物和第十一组实验动物的保护率均为92%，第四组实验动物、第六组实验动物和第十二组实验动物的保护率均为93%，第七组实验动物和第九组实验动物的保护率均为93%，第八组实验动物和第十组实验动物的保护率均为94%；第十三组实验动物的保护率为93%，第十四组实验动物的保护率为94%，第十五组实验动物、第十七组实验动物和第二十三组实验动物的保护率均为94%，第十六组实验动物、第十八组实验动物和第二十四组实验动物的保护率均为95%，第十九组实验动物和第二十一组实验动物的保护率均为95%，第二十组实验动物和第二十二组实验动物的保护率均为96%；第二十五组实验动物的保护率为92%，第二十六组实验动物的保护率为93%，第二十七组实验动物、第二十九组实验动物和第三十五组实验动物的保护率均为93%，第二十八组实验动物、第三十组实验动物和第三十六组实验动物的保护率均为94%，第三十一组实验动物和第三十三组实验动物的保护率均为94%，第三十二组实验动物和第三十四组实验动物的保护率均为95%；第三十七组实验动物的保护率为40%。

结果表明，本发明提供的疫苗具有长效保护的作用。

实施例5、疫苗的性能

一、疫苗的安全性（无菌、支原体试验）

1、将实施例3制备的各个疫苗分别接种至硫乙醇酸盐培养基（流式），37℃培养3日。

2、吸取步骤1得到的培养物，分别接种至2支TG小管（一支37℃培养，一支置25℃培养）、2支GA斜面（一支37℃培养，一支置25℃培养）和1支GP小管（25℃培养），连续观察7天，均未观察到细菌生长。

3、将实施例3制备的各个疫苗分别接种至TSA培养基（半固态），37℃培养，初代培养21天，次代培养21天，均未观察到支原体生长。

二、溶血性试验

1、取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜血液1ml，分离血细胞。

2、用PBS缓冲液洗涤血细胞，然后用PBS缓冲液制备细胞悬液（血细胞与PBS缓冲液的体积比为2:98）。

3、用PBS缓冲液分别制备实施例3制备的各个疫苗的2倍稀释液、4倍稀释液和8倍稀释液。

4、将1体积份步骤2得到的细胞悬液和1体积份步骤3得到的疫苗稀释液混合，室温静置8小时，然后进行判定（完全溶血：溶液澄明、红色、管底无细胞残留；部分溶血：溶液澄明、红色或棕色、管底有部分红细胞残留；无溶血：红细胞完全沉淀，上层液体颜色澄明）。结果显示：均未发生血球破裂，无溶血现象。

三、急性毒性试验

体重为12～18g Balb/C小鼠：单次腹腔注射实施例3制备的各个疫苗，每只小鼠0.5ml，连续2周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率，14天后处死进行解剖检查；小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，体重呈现增加，未见脏器有病理改变。

体重为8～10kg的Beagle狗：单次肌肉注射实施例3制备的各个疫苗，每只狗15ml，连续2周观察行为、体重和存活率，14天后处死进行解剖检查；狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，体重有所增加，未见脏器有明显的病理改变。

四、过敏试验

体重为250～350g Hartley豚鼠：实验第1天、实验第3天和实验第5天各皮下接种一次实施例3制备的各个疫苗（每次接种0.5ml），实验第26天，耳静脉接种一次实施例3制备的各个疫苗（接种0.5ml），连续3天持续观察动物；豚鼠无死亡，且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。

五、兔热源质试验

体重为2～3kg家兔：测量2次体温，间隔30分钟，要求2次温差不大于0.2℃，家兔2次平均温度38.6-39.5℃。第2次测温后15分钟内，自耳边静脉注入实施例3制备的各个疫苗，注射后每隔30分钟测量体温1次，连测6次，家兔个体升温未超过0.2℃。

六、免疫病理损伤试验

小鼠、家兔和奶牛：免疫实施例3制备的各个疫苗，外周血抗体亚型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性细胞及气管、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏等检测，Th2/Th1免疫应答趋于平衡，没有免疫器官损伤的迹象。

七、疫苗的稳定性

取实施例3制备的各个疫苗，2-8℃放置24个月、37℃放置1个月或25℃放置3个月。

无变色分层等现象，PH值在7.0—7.2之间，电镜观察粒径大小保持一致。

将各个放置处理后的疫苗进行实施例4的步骤二，结果均与实施例2的步骤二的结果一致。

对比例、

一、疫苗的制备

1、取大肠杆菌重组工程菌株X-10，用PBS缓冲液重悬。

2、取1体积份步骤1得到的菌液，加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％（体积比）,37℃、150rpm振荡孵育36h（实际应用中36h-48h均可），离心收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，得到对照疫苗甲（含1×10¹⁰个细菌/mL）。

3、取步骤1得到的菌液，加入37-40%甲醛溶液并使甲醛浓度为0.4％（体积比）,37℃、150rpm振荡孵育36h（实际应用中36h-48h均可），离心收集菌体，用灭菌后的PBS缓冲液洗涤菌体，然后用1体积份灭菌后的PBS缓冲液悬浮菌体，然后加入1体积份SP01佐剂，得到对照疫苗乙（含1×10¹⁰个细菌/mL）。

将各个疫苗置于2-8℃保存备用。

二、小鼠实验

6-8周Balb/C小鼠，分成3组，每组10只，分组免疫如下（皮下注射）：

第一组：实验第1天和实验第28天各免疫一次对照疫苗甲，每次免疫0.25毫升；

第二组：实验第1天和实验第28天各免疫一次对照疫苗乙，每次免疫0.25毫升；

第三组（阴性对照）：实验第1天和实验第28天各免疫一次PBS缓冲液，每次免疫0.25毫升。

实验第42天，尾静脉取血并分离血清。通过ELISA检测血清的IgG抗体效价（用PBST缓冲液梯度稀释，得到血清稀释液；将大肠杆菌重组工程菌株X-10作为包被原，包被浓度为1×10⁹个菌/ml；采用兔抗鼠IgG二抗；检测450nm的吸光值；吸光值为阴性对照的2.1倍以上判断为阳性）。第一组实验动物得到的血清的效价为1:6400，第二组实验动物得到的血清的效价为1:12800。

三、奶牛实验

2-5岁即将进入泌乳期（即产前25d，怀孕8个月20d）的健康奶牛，分成五组，每组100头，分组免疫如下：

第一组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次对照疫苗甲，每次免疫1毫升（颈部双侧皮下注射）；

第二组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次对照疫苗甲，每次免疫5毫升（颈部双侧皮下注射）；

第三组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次对照疫苗乙，每次免疫1毫升（颈部双侧皮下注射）；

第四组：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次对照疫苗乙，每次免疫5毫升（颈部双侧皮下注射）；

第五组（阴性对照）：实验第1天、实验第29天和实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)各免疫一次PBS缓冲液，每次免疫5毫升（颈部双侧皮下注射）。

实验第71天，颈部静脉取血并分离血清。通过ELISA检测血清的IgG抗体效价（用PBST缓冲液梯度稀释，得到血清稀释液；将大肠杆菌重组工程菌株X-10作为包被原，包被浓度为1×10⁹个菌/ml；采用羊抗牛二抗；检测450nm的吸光值；吸光值为阴性对照的2.1倍以上判断为阳性）。实验第71天，取乳清。通过ELISA检测乳清的sIgA抗体效价（用PBST缓冲液梯度稀释，得到乳清稀释液；将大肠杆菌重组工程菌株X-10作为包被原，包被浓度为1×10⁹个菌/ml；采用羊抗牛sIgA酶标二抗；检测450nm的吸光值；吸光值为阴性对照的2.1倍以上判断为阳性）。

第一组实验动物得到的血清的效价为1:6400，第二组实验动物得到的血清的效价为1:25600，第三组实验动物得到的血清的效价为1:12800，第四组实验动物得到的血清的效价为1:25600。

第一组实验动物得到的乳清的效价为1:1600，第二组实验动物得到的乳清的效价为1:3200，第三组实验动物得到的乳清的效价为1:3200，第四组实验动物得到的乳清的效价为1:6400。

实验第71天，取血后，用大肠杆菌标准株ATCC25922进行攻毒（使用乳针将600CFU大肠杆菌注入乳房内），实验第72天-实验第85天为结果评判期。结果评判方法同实施例4的步骤二。

第一组实验动物的保护率为90%，第二组实验动物的保护率为91%，第三组实验动物的保护率均为91%，第四组实验动物的保护率均为92%，第五组实验动物的保护率为0%。

四、长效免疫保护效果

2-5岁即将进入泌乳期（即产前25d，怀孕8个月20d）的健康奶牛，分成5组，每组100只，分组免疫如下：实验第1天、实验第29天、实验第57天(即产前25天、产后3天、产后31天)和实验第368天各免疫一次疫苗，免疫分组方式、单次免疫剂量和免疫方式均同步骤三。实验第700天-实验第714天为结果评判1期，实验第1070天-实验第1083天为结果评判2期。结果评判方法同实施例4的步骤二。

结果评判1期：第一组实验动物的保护率为86%，第二组实验动物的保护率为87%，第三组实验动物的保护率为87%，第四组实验动物的保护率均为88%，第五组实验动物的保护率为43%。

结果评判2期：第一组实验动物的保护率为85%，第二组实验动物的保护率为86%，第三组实验动物的保护率为86%，第四组实验动物的保护率为87%，第五组实验动物的保护率为42%。