一种用于监测漆酶构象变化的免标记紫外吸收光谱法

摘要

本发明公开了一种用于监测漆酶构象变化的免标记紫外吸收光谱法。首先将3-叠氮-7-羟基香豆素与漆酶一起加入到九种不同浓度的尿素溶液中，经充分反应后再用紫外光谱仪在400~700nm范围内采集上述含有3-叠氮-7-羟基香豆素、漆酶和尿素的混合溶液的吸收光谱，最后绘制漆酶在不同尿素浓度条件下的紫外吸收光谱变化趋势图，根据该紫外吸收光谱变化趋势图就能监测漆酶构象变化。本发明在操作过程中仅需要将漆酶、3-叠氮-7-羟基香豆素在尿素溶液中进行简单混合，不需要任何的标记过程就能达到监测漆酶构象变化的目的，大大降低了操作的复杂性，减少了监测时间。此外，本发明用于对漆酶构象变化的监测取得了较为满意的结果，显示出高效、专一、及时、简单的优势。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，尤其是涉及一种用于监测漆酶构象变化的免标记紫外吸收光谱法。

背景技术

漆酶（EC 1.10.3.2）主要分布在大部分植物和真菌中。由于漆酶能有效催化大量有机和无机化合物，将化合物中分子氧还原为水，例如酚类化合物和有机胺类，因此被广泛用于免疫检测、生物传感、染料的合成和脱色等领域。此外，漆酶还是一种多铜蛋白，包括4个铜离子，可分为三类：分别为分布在三区的I型铜（Cu1），以及分布在一区与三区交界处的II型铜（Cu2）和III型铜（Cu3a and Cu3b）。在漆酶结构中，这些铜离子均与组氨酸和色氨酸相结合，共同作为漆酶的催化中心。

在生理条件下，许多蛋白质都以本身自然折叠的形式存在，其中氢键在蛋白质折叠过程中发挥着举足轻重的作用。如果将蛋白质进行加热，或暴露在酸性、碱性环境，或与变性剂如尿素、盐酸胍和乙醇等物质相混合时，都容易使蛋白质中的氢键发生断裂，引起蛋白质产生去折叠作用，导致蛋白质构象发生变化，例如三维结构坍塌，成为一维或者二维结构。为了更好地了解蛋白质功能与它的序列、构象之间的关系，研究者们提出很多监测方法用于研究蛋白质的折叠和去折叠状态、以及构象变化过程等，例如荧光法、圆二色谱法、毛细管电泳法、质谱法、电化学法、近红外光谱法等。紫外吸收光谱法由于成本低、操作简单、选择性高而受到广泛关注，但是目前采用紫外吸收光谱法对蛋白质构象变化进行监测的报道非常少。因此，开发一种简单、高效的免标记紫外吸收光谱法去监测蛋白质的构象变化是十分必要的。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种方法简单、成本低、特异性好的用于监测漆酶构象变化的免标记紫外吸收光谱法，该方法在操作过程中仅需要将漆酶、3-叠氮-7-羟基香豆素在尿素溶液中进行简单混合，不需要任何的标记过程，从而大大降低了操作的复杂性，减少了监测时间。

本发明的目的是按照如下方式实现的：

一种用于监测漆酶构象变化的免标记紫外吸收光谱法，特征是：具体步骤如下：

（1）按照参考文献（Sivakumar, K.; Xie, F.; Cash, B. M. et al., A Fluorogenic 1,3-Dipolar Cycloaddition Reaction of 3-Azidocoumarins and Acetylenes. Org. Lett., 2004, 6, 4603-4606.）所示的方法，采用二羟基苯甲醛、N-乙酰甘氨酸和叠氮化钠制备3-叠氮-7-羟基香豆素；

（2）将5.0 μL 10 mg/mL的漆酶和5.0 μL 0.25 mM 3-叠氮-7-羟基香豆素分别加入至九种不同浓度且均为190 μL的尿素溶液中，九种尿素溶液的具体浓度分别为0.0 M、1.0 M、2.0 M、3.0 M、4.0 M、5.0 M、6.0 M、7.0 M、8.0 M，在4 ^oC下培育1.0小时，混合后搅拌均匀，促使尿素对漆酶产生变性作用，引起漆酶构象变化；

（3）在步骤（2）反应结束后，采用紫外光谱仪在400~700 nm范围内分别采集步骤（2）中九种反应后的尿素溶液的吸收光谱；

（4）根据九种尿素溶液的尿素浓度和紫外吸收强度，绘制漆酶在不同尿素浓度条件下的紫外吸收光谱变化趋势图，根据该紫外吸收光谱变化趋势图就能监测漆酶构象变化。

在步骤（2）中，尿素溶液是由尿素溶解在乙酸缓冲液中配制而成，并将pH值调制为6.0。

3-叠氮-7-羟基香豆素的叠氮基团是一个给电子基团，导致该化合物的紫外吸收较弱。但是3-叠氮-7-羟基香豆素与漆酶相混合时，漆酶中与铜位点产生配位作用的组氨酸易于和叠氮基团中的氮原子通过氢键作用进行结合，形成叠氮香豆素--漆酶这种新型配合物，这就降低了3-叠氮-7-羟基香豆素中叠氮基团的给电子能力，叠氮香豆素--漆酶具有产生较强的紫外吸收能力。然而漆酶在尿素溶液中易产生变性作用，漆酶的三维结构遭到破坏，尿素以更强的结合力与组氨酸相结合，破坏叠氮香豆素--漆酶配合物的结构，使上述步骤（2）中含有3-叠氮-7-羟基香豆素、漆酶和尿素的混合溶液中紫外吸收强度随着变性强度的增加而逐渐减小，达到监测漆酶构象变化的目的。

本发明是将3-叠氮-7-羟基香豆素与漆酶一起加入到九种不同浓度的尿素溶液中，经充分反应后再用紫外光谱仪在400~700 nm范围内采集上述含有3-叠氮-7-羟基香豆素、漆酶和尿素的混合溶液的吸收光谱，最后绘制漆酶在不同尿素浓度条件下的紫外吸收光谱变化趋势图，根据该紫外吸收光谱变化趋势图就能监测漆酶构象变化。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明在操作过程中仅需要将漆酶、3-叠氮-7-羟基香豆素在尿素溶液中进行简单混合，不需要任何的标记过程就能达到监测漆酶构象变化的目的，大大降低了操作的复杂性，减少了监测时间。

（2）本发明用于对漆酶构象变化的监测取得了较为满意的结果，显示出高效、专一、及时、简单的优势。

（3）本发明采用简单的紫外光谱仪采集数据，具有操作简便、灵敏、成本低的优势。

附图说明：

图1为本发明的用于监测漆酶构象变化的免标记紫外吸收光谱法的原理示意图；

图2中的A为本发明的紫外吸收光谱图，尿素浓度从a至i分别为0.0 M、1.0 M、2.0 M、3.0 M、4.0 M、5.0 M、6.0 M、7.0 M、8.0 M；B为波长在493 nm处的吸收强度与尿素浓度之间的变化关系。漆酶的浓度为250 μg/mL（步骤（2）中为10 mg/mL，在加入的体积为5.0 μL到含有5.0 μL 3-叠氮-7-羟基香豆素和190 μL尿素溶液中，折算混合溶液中漆酶浓度为250 μg/mL）。

图3为采用不同方法监测漆酶构象变化的去折叠率与漆酶活性之间的关系：a为漆酶在不同尿素浓度中的活性变化；b为采用本发明所述的免标记紫外吸收光谱法对漆酶构象变化的监测；c为采用传统圆二色谱（CD）法对漆酶构象变化的监测。

具体实施方式：

下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。

为了更好地理解本发明的内容，下面通过具体的实施例来进一步说明本发明的技术方案，具体包括合成、性质测定等。这些实施方式只是对本发明的说明，并不限制本发明。

一种用于监测漆酶构象变化的免标记紫外吸收光谱法，具体步骤如下：

1. 制备3-叠氮-7羟基香豆素化合物：分别称取1.38 g 2,4-二羟基苯甲醛和1.12 g N-乙酰甘氨酸至50 mL无水乙酸钠中，并超声溶解，然后回流搅拌4.0小时，反应完成后，所得混合物倒入冰水中，得到黄色沉淀，过滤取黄色沉淀，并用冰水清洗沉淀物，然后再在30 mL盐酸和乙醇的混合液（2：1）中回流1小时，反应完成后，采用冰浴将上述溶液冷却，并用20 mL冰水稀释上述溶液；加入20 mmol亚硝酸钠，搅拌10分钟后，再加入30 mmol 叠氮化钠，搅拌20分钟。经过滤，减压干燥后得到的棕色固体为3-叠氮-7羟基香豆素化合物：(0.97 g, 47.8%). ¹H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 6.76 (d, J = 2.13 Hz, 1 H), 6.80 (dd, J = 8.47 Hz, J = 2.28 Hz, 1 H), 7.48 (d, J = 8.54 Hz, 1 H), 7.61 (s, 1 H), 5.23 (s, 1 H). IR (KBr, cm^-1): 3159 (s), 2117 (vs), 1688 (s), 1617 (m), 1310 (s). MS (EIS) m/z: calculated for C₉H₅N₃O_3: 203.0, found 202.5 ([M]^-); 238.1 ([M+ Cl] ^-)。

2. 先将尿素溶解在乙酸缓冲液中，配制出九种不同浓度的尿素溶液，九种尿素溶液的具体浓度分别为0.0 M、1.0 M、2.0 M、3.0 M、4.0 M、5.0 M、6.0 M、7.0 M、8.0 M，并将pH值调制为6.0；再将5.0 μL 10 mg/mL的漆酶、5.0 μL 0.25 mM 3-叠氮-7-羟基香豆素分别加入至上述九种不同浓度且均为190 μL的尿素溶液中，然后在4 ^oC下保持1.0小时，混合后搅拌均匀，促使尿素对漆酶产生变性作用，引起漆酶构象变化。

3. 在步骤（2）反应结束后，采用紫外光谱仪在400~700 nm范围内分别采集步骤（2）中九种反应后的尿素溶液的吸收光谱； 

4. 根据九种尿素溶液的尿素浓度和紫外吸收强度，绘制漆酶在不同尿素浓度条件下的紫外吸收光谱变化趋势图，根据该紫外吸收光谱变化趋势图就能监测漆酶构象变化。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。