一种金纳米棒SPR探针的制备及用于检测其载药释放动力学过程的方法

摘要

本发明公开了一种金纳米棒单颗粒SPR探针的制备方法，以及用该探针来监测纳米载药释放动力学的方法。在含有表面活性剂CTAB的HAuCl

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及介孔硅包覆的金纳米棒单颗粒SPR探针的制备方法，以及利用该探针在监测金纳米棒载药释放动力学的方法。

背景技术

纳米载药系统自从诞生以来就受到人们的广泛关注，在传统研究中，人们常常在体外进行模拟以了解纳米载体药物释放动力学过程。在这一研究过程，人们通常选取的模拟药物需具有一定的荧光特性，并且利用这一特性来了解释放动力学过程。但是，实际下并非所有的抗癌药物都具有荧光特性，这在一定程度上大大限制了人们对于各种药物释放动力学的研究过程，而且体外溶液态的模拟与细胞自身环境仍存在着较大的差距。此外，最近研究者发现纳米载体的引入，由于其自身的生物相容性不同，会造成其具有一定的细胞毒性，可能会对人体带来新的危害，因此，寻求一种新的可用于对各种药物在胞内释放过程的监测方法就成为当前人们的研究热点。

在这种形势之下，表面等离子共振（SPR）效应以其独特的优势开始进入人们的视野中。表面等离子共振（SPR）是金属表面自由电子受到电磁辐射后在金属-介电界面上的集体振荡，共振状态下电磁场的能量被有效地转变为金属表面自由电子的集体振动能。由此发展的等离子共振光子学（Plasmonics）作为纳米光学领域的重要分支，可实现在纳米尺度的观测。由于纳米颗粒的瑞利散射信号对其尺寸、组成、形貌、表面电荷分布及其周围环境的变化响应非常灵敏，借助SPR 暗场光谱显微镜，可以设计出在单分子水平用于监测的SPR光学探针。将SPR光学探针引入到原位监测纳米载体胞内的释放过程、纳米载体的生物毒性以及药物的释放量对细胞的影响等相关研究具有广阔的应用前景。

本发明采用SPR效应原理设计了新型的纳米尺度的小分子探针，采用界面修饰技术将其修饰到玻璃表面，在基于金纳米棒的单颗粒SPR探针上实现纳米尺度的高灵敏和高选择性检测。从而通过药物释放释放过程对SPR探针的影响即可了解纳米载药系统的释放动力学，该方法对于评价多种基于纳米颗粒的药物载体的释放动力学性能，为药物载体研究、剂型开发、肿瘤治疗等纳米生物相关领域的应用提供新的思路。该方法具有机构简单，制备方便，监测灵敏等众多优点，为监测药物释放动力学过程提供了一种新的方法。

发明内容

技术问题：本发明的目的在于提供一种金纳米棒单颗粒SPR探针的制备方法以及使用该探针检测其载药释放动力学过程的方法。

技术方案：本发明的技术方案包括一种金纳米棒单颗粒SPR探针的制备方法以及使用该探针检测其载药释放动力学过程的方法。

本发明的一种金纳米棒SPR探针制备方法包括以下步骤：

步骤1、用晶种生长法合成金纳米棒溶液：

（a）3~5nm金种子溶液的制备：在20mL的样品瓶中，加入10mL，0.001~1mol/L十六烷基三甲基溴化铵表面活性剂；随后加入0.25mL，0.001~1mol/L的HAuCl₄溶液，搅拌混合均匀；紧接着迅速加入0.60mL，0.001~1mol/L冰冷的NaBH₄溶液，剧烈搅拌2秒后，室温下静置2~8小时。

（b）金纳米棒的生长：在烧杯中加入40mL，1 0.001~1mol/L十六烷基三甲基溴化铵溶液；2.0mL，0.001~1mol/L HAuCl₄溶液和10μL~1000μL，0.001~1mol/L AgNO₃溶液，缓慢搅拌混合均匀；随之加入10μL~1000μL，1mol/L盐酸，调节pH 为酸性；之后加入10μL~1000μL，0.001~1mol/L抗坏血酸弱还原剂，搅拌均匀后，加入0.001~1mL上述步骤中制备的稀释1~20倍的3~5nm金种子溶液，搅拌1~10分钟后，室温下静置6小时；

（c）金纳米棒的纯化：将上述得到的金纳米棒进行离心纯化，首先，用低速进行离心，弃掉下层的大颗粒，然后将上清液进行高速离心，离心两次，留下层沉淀，最后，加入超纯水至原来体积；

步骤2、介孔硅包覆的金纳米棒的制备：

取上述离心纯化过的金纳米棒溶液10mL放入20mL的样品瓶中，放入磁子进行快速搅拌，加入0.001~1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为碱性；随后，加入1~100μL，含硅酸四乙酯1%~80%的乙醇溶液，每隔10~40分钟加一次，共3次，室温下，快速搅拌24小时；最后将得到的纳米颗粒溶液进行，离心纯化。得到介孔硅包覆的金纳米棒溶液，即金纳米棒SPR探针。

本发明的检测金纳米棒SPR探针载药释放动力学过程的方法包括以下步骤：

步骤1、介孔硅包覆金纳米棒颗粒在ITO玻璃上的固定：

将ITO玻璃片按顺序浸入洗洁精、丙酮、乙醇、超纯水溶液中进行超声一段时间1~5h后，取出后用N₂吹干储存备用；取权利要求1制备的金纳米棒溶液1~100μL，按比例1:1000~5000稀释后，放入ITO玻璃片，浸泡一定的时间1~30min后，用N₂吹干，即完成在ITO玻璃片上固定介孔硅包覆金纳米棒颗粒的过程；

步骤2、在ITO玻璃片上负载上抗癌药物：将固定介孔硅包覆金纳米棒颗粒的ITO玻璃片放入浓度为1~1000μg/mL的抗癌药物溶液中，避光在摇床上以一定的速度1~1000r/min摇动约24h，随后用N₂吹干；

步骤3、将ITO玻璃片置于载物台上，滴上同等浓度的抗癌药物溶液，用暗场显微镜拍摄载药时单颗粒的散射光谱；随后，吸走药物溶液，滴加同体积的水溶液，用暗场显微镜拍摄药物在金纳米棒颗粒上随时间变化的的脱附过程；

步骤4、在常规释放过程的监测：将一定浓度1~20μg/mL的权利要求1制备的金纳米棒溶液同抗癌药物混合，在暗场下搅拌24h；随后离心处理，将下层沉淀稀释放置透析袋中，在清水中透析，连续搅拌，每隔一段时间30~60min取出样品测紫外光谱，并立即用同体积的清水补充；

步骤5、在细胞中实时监测金纳米棒载药释放动力学过程：将与肿瘤细胞共培养的培养基中加入一定浓度1~20μg/mL的含负载抗癌药物介孔硅包覆的金纳米棒溶液，培养12~48h后，用PBS溶液冲洗细胞，去除培养基并置于PBS溶液中，在暗场显微镜下观察进入细胞中的金纳米棒在脱附过程中随时间的光谱变化。

本发明的介孔硅包覆的金纳米棒单颗粒SPR探针，它具有良好的监测性能，可结合SPR技术在监测纳米载体释放动力学方面有很好的效用。该SPR探针为介孔硅修饰的金纳米棒SPR探针，其结构是：介孔硅包裹着金纳米棒，吸附一定的抗癌药物，当抗癌药物脱附时则SPR光谱蓝移。

附图说明

图1本发明主要环节的示意图。

图2采用本发明制备的金纳米棒AuNRs和介孔硅包覆的金纳米棒AuNRs@SiO₂的紫外光谱图。

图3采用本发明制备的金纳米棒AuNRs和介孔硅包覆的金纳米棒AuNRs@SiO₂的透射电镜照片。

图4采用本发明制备的基于金纳米棒单颗粒SPR探针监测药物释放过程的瑞利散射光谱随时间的变化图。

图5采用本发明制备的基于金纳米棒单颗粒SPR探针监测纳米载药系统释放动力学过程。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面将结合实施例和附图来进一步阐述本发明。本实施例以本发明的技术为基础实施，给出了详细的实施方式和操作步骤，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

该SPR探针为介孔硅修饰的金纳米棒SPR探针，其结构是：介孔硅包裹着金纳米棒，吸附一定的抗癌药物，当抗癌药物脱附时则SPR光谱蓝移。其具体结构如图1所示：1为金纳米棒；2为介孔硅包覆的金纳米棒；3为负载完药物的介孔包覆的金纳米棒；4为药物脱附完成后的介孔硅包覆的金纳米棒。

实施例

1、金纳米棒的合成

(a) 金种子的制备：在20mL的样品瓶中加入10mL，0.1mol/L十六烷基三甲基溴化铵溶液，随后加入0.25mL，0.01mol/L的氯金酸溶液，搅拌均匀后，快速加入0.6mL 0.01mol/L冰冷的硼氢化钠。室温下，待使用前静置至少2h。

(b) 金纳米棒的生长：在烧杯中加入40mL，0.1mol/L 十六烷基三甲基溴化铵溶液、2.0mL，0.01mol/LHAuCl₄ 和150μL，0.01mol/L AgNO₃溶液，缓慢搅拌混合均匀。随之加入盐酸，调节pH 为1~2。之后加入弱还原剂—抗坏血酸（0.32mL，0.01mol/L），搅拌均匀后，加入0.15mL（a）中制备的稀释5倍的3~5nm金种子溶液。搅拌若干时间后，室 温下静置6小时。金纳米棒进行离心纯化后，加入超纯水，得到一定浓度的金纳米棒溶液。

2、介孔硅包覆的金纳米棒的制备：取上述离心纯化过的金纳米棒溶液10mL放入20mL的样品瓶中，放入磁子进行快速搅拌，加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为10~11。随后，加入5μL的硅酸四乙酯的乙醇溶液（其中硅酸四乙酯：乙醇=0.2），每隔一段时间加一次，共3次，室温下，快速搅拌24小时。最后，将得到的纳米颗粒溶液进行，离心纯化得到一定浓度的介孔硅包覆的金纳米棒溶液。

如图2所示为本发明制备的金纳米棒AuNRs和介孔硅包覆的金纳米棒AuNRs@SiO₂的紫外光谱图。从图中可以看出金纳米棒在包覆完介孔硅之后纵向等离子吸收发生了一定的红移。

如图3所示为本发明制备的金纳米棒AuNRs和介孔硅包覆的金纳米棒AuNRs@SiO₂的透射电镜照片。左图可以看出制备的金纳米棒形貌均一，右图则表明介孔硅在金纳米棒上有很好的包覆，厚度约为15nm。

3、介孔硅包覆金纳米棒颗粒在玻璃上的固定和后续处理

 (a) 负载纳米颗粒的玻璃片的处理过程：将分割好的具有一定长宽的ITO玻璃按一定的顺序浸入丙酮、乙醇、超纯水溶液中进行超声一段时间后，取出后用N2吹干储存备用。

 (b) 介孔硅包覆金纳米棒颗粒在处理后的玻璃片上的固定：取上述制备的纳米颗粒一定体积，按一定比例1:5000稀释后，放入处理过的玻璃片，浸泡一定的时间后，用N2吹干，即完成固定过程。

 (c) 固定纳米颗粒的玻璃片的后续处理：将上一步制得的玻璃片放入浓度为20μg/mL的抗癌药物溶液中，避光在摇床上以一定的速度摇动约24h，待到观察释放过程时再将玻璃片取出。

4、复合等离子探针用于常规释放过程监测：

将一定浓度的介孔硅包覆的金纳米棒颗粒与抗癌药物按一定的比例（10:1~2:1）混合，在黑暗环境下搅拌24 h后离心处理，移走上清液，加入2 mL左右的清水后置于透析袋中，在10~100 mL清水中透析，保持不停搅拌，每隔一段时间取出样品测试紫外吸收光谱以监测释放动力学过程，在此过程中，移出溶液后迅速补充等体积的清水，以保持监测过程中溶液体积不变。

5、纳米等离子芯片监测药物释放动力学过程：

将上述制好的玻璃片载物台上，接着在玻璃片上滴上同浓度的抗癌药物溶液，对暗场显微镜进行设置参数，调焦等，拍摄载药时单颗粒的散射光谱；随后，吸走药物溶液，滴加同体积的水溶液，拍摄药物在纳米颗粒上的脱附过程。观察过程为2 h,在0.5 h和1.5 h时补充水溶液以补充挥发的水，在1 h时将玻璃片上溶液吸走替换为同体积的新鲜水溶液。

6、复合等离子探针直接监测细胞内释放过程：

将含肿瘤细胞的培养基中加入一定浓度的含负载抗癌药物介孔硅包覆的金纳米棒新鲜介质，经过一段时间后，用PBS溶液冲洗细胞，去除培养基并置于PBS溶液中，在暗场显微镜下观察金纳米棒在脱附过程中随时间的光谱变化。其中，细胞的培养条件为：37℃含5% CO₂的环境下置于经修饰的培养基中培养，其中加入一定浓度的热灭活的胎牛血清和抗生素，生长过夜。

如图4所示为本发明制备的基于金纳米棒单颗粒SPR探针监测药物释放过程的瑞利散射光谱随时间的变化图。从图中可以看出在释放过程中，金纳米棒单颗粒SPR探针的瑞利散射光谱随时间发生一定的蓝移，符合释放过程的机理。

如图5所示为本发明制备的基于金纳米棒单颗粒SPR探针监测纳米载药系统释放动力学过程。从图中可以看出本探针对释放动力学过程有较好的监测能力，在刚开始药物快速释放到环境中，随后逐渐放缓趋近一定值。

表1为2h时间段内各性能参数：

时间/min散射峰值/nm蓝移量/nm0700.29505698.0302.2658697.4122.88312697.0013.29415697.0013.29425697.0013.29430696.7953.535697.2073.08840697.0013.29445696.7953.550697.0013.29455696.7953.560696.5893.70665694.7355.5680694.3235.97295694.3235.972100694.3235.972105694.5295.766110694.3235.972115694.5295.766120694.5295.766

由表1可知，基于介孔包覆的单颗粒金纳米棒SPR探针可以有效监测药物的释放过程，具有简便高效的特点。

    该核壳结构所形成的探针既可以用于常规释放过程的监测，也可以作为等离子芯片实现单颗粒上药物释放的监测，与此同时，它还能够对细胞内药物释放过程进行有效的监测，新颖高效。该核壳结构形成的复合等离子探针可以在溶液态下模拟监测药物的宏观释放过程。除此之外，该核壳结构还可以通过固定在预处理的玻璃表面形成单颗粒SPR探针芯片，由于金纳米棒的表面等离子共振（SPR）效应，以及纳米颗粒的瑞利散射信号对其尺寸、组成、形貌、表面电荷分布及其周围环境的变化的灵敏响应，通过加入抗癌药物与去除抗癌药物即实现单颗粒借助SPR 暗场光谱显微镜对纳米药物载药系统释放动力学的有效监测。该SPR探针在监测药物在介孔硅中的脱附过程中散射光谱会由于外部环境的变化产生一定的蓝移，该探针的散射峰位于600~700nm。此方法具有简便高效等优点，在此基础上，利用该探针也可以实现对细胞内药物释放的监测过程。