基于铁氧化物纳米颗粒的用于淋巴系统造影术的MRI对比剂和使用所述MRI对比剂用于使淋巴结成像的方法

摘要

本发明提供了用于淋巴结对比成像的对比剂、使用前述对比剂用于对比增强淋巴系统造影术的方法、以及使用前述对比剂用于诊断淋巴结癌症的方法，所述对比剂包含通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物在水性介质中分散并稳定的铁氧化物纳米颗粒。使用这样的贻贝粘附蛋白模拟共聚物修饰铁氧化物的表面并使其在水中很好地分散以制备胶体溶液，其进而形成包含所述胶体溶液的对比剂。本发明的对比剂没有毒性并且容易被摄取到淋巴结，从而表现出优良的对比成像效应。本发明的对比剂可用于诊断转移癌。

说明书

技术领域

本发明涉及用于对比增强淋巴系统造影术（contrast enhanced  lymphography）的对比剂（contrast agent）以及使用所述对比剂用于对 比增强淋巴系统造影术的方法，所述对比剂包含通过贻贝粘附蛋白模拟共 聚物（mussel adhesive protein-mimetic copolymer）在水性介质中分散并 稳定的铁氧化物纳米颗粒。更特别地，所述贻贝粘附蛋白模拟共聚物是聚 乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4-二羟基苯丙氨酸)（PEI-接枝 -(PEG;PDOPA)）。接枝聚合物由两部分构成，一部分包含接枝有对水性 介质具有亲和力的基于聚乙二醇之生物相容性聚合物的聚乙烯亚胺（有时 缩写为“聚乙二醇接枝的聚乙烯亚胺”），并且另一部分是对纳米颗粒表面 具有亲和力的聚3,4-二羟基苯丙氨酸（PDOPA）。本发明涉及用于对比增 强淋巴系统造影术的对比剂，其包含通过以下方法制备的胶体溶液：使用 前述的贻贝粘附蛋白模拟共聚物修饰铁氧化物颗粒的表面，然后将所述颗 粒分散在水中。本发明涉及使用所述对比剂用于对比增强淋巴系统造影术 的方法。

背景技术

纳米颗粒有着广泛的应用，例如纳米电子会聚技术（nano-electronic  convergence technology）、体内成像技术、医学应用等。具体地，超顺磁 性铁氧化物纳米颗粒广泛用于多种生物医学应用，包括例如磁共振成像 （“MRI”）对比剂、细胞疗法、体温过高、药物递送、细胞分离、核酸制 备等。

在生物医学应用中对于应用来说的最重要的要求主要是确保高品质 纳米颗粒，并且还允许纳米颗粒在水性介质中具有优良的分散性和稳定 性。本文中，高品质纳米颗粒可意指具有以下特征的纳米颗粒：(i)粒径 均一性，(ii)粒径容易控制，(iii)颗粒结晶度，(iv)控制颗粒形态的可能 性等。

但是，在本领域中商业可得的纳米颗粒大多数在水性体系中合成或者 可通过在气相中合成得到。由前述方法产生的纳米颗粒难以制备形状均一 的颗粒并且一般显示出低的结晶度。另外，难以制造大小均一的纳米颗粒 并且难以控制粒径。

最近，已进行了许多研究来开发用于在有机体系中制备金属氧化物纳 米颗粒的新方法，所述金属氧化物纳米颗粒与根据相关领域在水性体系中 合成的纳米颗粒相比具有相对高的品质（即均一的大小和有利的结晶度）。

同样地，在纳米颗粒于有机溶剂中合成的情况下，纳米颗粒的均一性 和大小控制有时可通过在合成期间使用有机添加剂使所述纳米颗粒稳定 来实现。在这一点上，因为纳米颗粒的表面状况受疏水有机添加剂影响， 所以金属氧化物纳米颗粒可容易地分散在疏水有机溶剂中。但是，当将它 们与水混合时，它们没有足够的稳定性。

对于在有机溶剂中制备的这样的纳米颗粒，纳米颗粒表面的疏水性质 可阻碍纳米颗粒在水中的稳定分散，从而引起用于生物医学应用中的问 题。因此，为了将纳米颗粒用于前述应用，需要开发生物相容性分散稳定 剂，其改良（或修饰）纳米颗粒表面以具有亲水性质并且确保合适条件使 其在水性介质中均匀分散。此外，还需要开发使用前述生物相容性分散稳 定剂制备的纳米颗粒胶体溶液，其中所述分散状态在水性体系中稳定维 持。

在根据相关领域的技术将纳米颗粒分散在水性体系中的方法中，目前 在Journal of American Chemical Society,2005,127,4990中公开了使用二 氧化硅薄层。根据前述文章，将聚氧乙烯壬基苯基醚引入环己烷溶液中并 与所述环己烷溶液混合以形成微胶束乳滴（micro-micelle emulsion  drop）。接着，诱导四乙基原硅酸盐（TEOS）的溶胶-凝胶反应（sol-gel  reaction），用二氧化硅层包被纳米颗粒后分散在水中。以上文件描述了用 亲水二氧化硅层包被纳米颗粒外侧以使纳米颗粒分散在水中的方法，其中 所述纳米颗粒在有机溶剂中制备。在这种情况下，使用微乳剂的二氧化硅 包被方法引起了这样的问题：因为仅一次的待包被纳米颗粒的量非常少， 所以在单次过程中制造的水性体系中纳米颗粒分散体的量也大大降低。而 且，微乳剂的条件根据在单次过程中制造的纳米颗粒胶体的量或聚氧乙烯 壬基苯基醚的量而改变。因此，难以精细地调节二氧化硅层的期望厚度， 难以实现包被颗粒的均一性，这是因为二氧化硅层中所含纳米颗粒的数目 被改变。在纳米颗粒由二氧化硅层稳定的情况下，相关领域中的前述技术 引起了这样的问题：二氧化硅表面上的硅烷官能团不足够稳定而是彼此反 应，因此，包被有二氧化硅并且分散在水中的纳米颗粒发生组合并随时间 凝聚。结果，难以确保分散体经长时间的储存稳定性。

近些年中，已在Journal of America Chemical Society（2005,127, 4556）中公开了使用由氧化膦和聚乙二醇构成的聚合物使纳米颗粒在水中 分散的方法。更具体地，前述文章描述了纳米颗粒分散方法，其中，在聚 乙二醇与1,2-双(二氯膦基)乙烷反应以合成含有键合在一起之聚乙二醇的 聚合物之后，使聚合物与分散在疏水溶剂中的纳米颗粒经历配体交换反 应，从而使纳米颗粒能够稳定分散并且使所述纳米颗粒在水中均一分散。 所公开的方法使用简单的制备方法并且利用配体交换使纳米颗粒在水中 分散。但是，由于磷原子（P）易于氧化并变为磷酰基，所以包被聚合物 必须在使用氮气或氩气的惰性气氛下合成。另外，由于聚合物是交联状态， 所以引入官能团结合体内的功能配体（例如DNA、RNA、单克隆抗体或 其他功能蛋白）的问题仍然存在。

最近，研究者对将贻贝作为生物粘附剂的潜在来源进行了许多研究。 贻贝产生并分泌功能分化的粘性物质，从而允许贻贝在海洋环境中静止或 固定在水中，所述海洋环境的特征在于盐度、湿度、潮流、湍流、波动等。 贻贝使用由其足部（leg）分泌的纤维束构成的丝（thread）强力地粘附于 水中的物质表面。在每条纤维末端，存在包含防水粘附剂的板状物 （plaque）以允许贻贝粘附于湿的固体表面。这样的丝状蛋白（thread  protein）包含大量的3,4-二羟基苯基-L-丙氨酸（DOPA），它是通过使用 多酚氧化酶使酪氨酸基团羟基化得到的氨基酸。DOPA侧枝（side branch） 上的3,4-二羟基苯基（儿茶酚）可与亲水性表面产生非常强的氢键和/或与 金属离子、金属氧化物（Fe³⁺、Mn³⁺）、半金属（硅）等强力键合。

转移癌的发生明确影响癌症的预后和治疗。转移癌的发生可通过淋巴 结转移的存在与否来确定并且转移性淋巴结癌的发生目前通过外科手术 活检淋巴结来诊断。但是，这是一种有创性方法（invasive method），对 于患者和医师二者都具有很大困难。另一方面，可采用无创性技术（例如 使用CT、MRI、PET等）来检测转移癌的发生，但是导致的问题是癌一 般在其尺寸为5mm或更大时才可被检测到。因此，仍然需要能够无创性 诊断尺寸相对小的转移癌的方法。

已介绍了通过将铁氧化物纳米颗粒注入体内并且使用磁共振成像示 出淋巴结上的铁氧化物沉积物来检测转移癌的方法（MukeshG. Harisinghani,M.D.,JelleBarentsz,M.D.,Ph.D.,PeterF.Hahn,M.D., Ph.D.,WillemM.Deserno,M.D.,ShahinTabatabaei,M.D.,Christine  HulsbergenvandeKaa,M.D.,Ph.D.,JeandelaRosette,M.D.,Ph.D.和 RalphWeissleder,M.D.,Ph.D.,NewEnglandJournalofMedicine2003; 348:2491-2499）。根据所公开的方法，在使用亲水性物质稳定水性体系中 的铁氧化物纳米颗粒之后，将经处理的纳米颗粒引入体内，并且在预定时 间后通过MRI观察带有癌的淋巴结组织以及正常的淋巴结组织。根据所 观察结果之间的不同，可诊断癌症的发生。使用前述方法，AMAGCo. （美国）开发了用于对比增强淋巴系统造影术的MRI对比剂，称为 但是，上述对比剂在体内施用后经常引起不良作用和/ 或具有不良选择性，因此没有被广泛使用。因此，仍然需要开发用于对比 增强淋巴系统造影术的改良的基于铁氧化物之对比剂，其具有优良选择性 且不良作用降低。

发明内容

技术问题

因此，由于克服相关领域中的前述问题的深入且广泛的努力，本发明 人完成了这样的生物相容性分散稳定剂，其可将纳米颗粒表面改良为亲水 状态以使纳米颗粒在水性体系中分散；并且发现了使用所述生物相容性分 散稳定剂（所述稳定剂）可使纳米颗粒能够在水性体系中分散并稳定（“分 散稳定”），从而有效用于生物医学应用。另外，还发现，由本发明生物相 容性分散稳定剂分散并稳定的纳米颗粒可应用于纳米电子融合技术领域 （例如量子点（Q点）发光装置）、生物成像领域（例如MRI对比剂）、 组织工程领域（例如细胞疗法）、生物医学领域（例如体温过高、药物递 送）等。

本发明的一个目的是提供用于对比增强淋巴系统造影术的对比剂，其 包含通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物在水性介质中分散和稳定的铁氧化物 纳米颗粒，其中通过模拟贻贝蛋白的简单方法将多种纳米颗粒的表面改良 为亲水状态，使得纳米颗粒在水性介质中稳定分散，同时使其能够用于生 物医学领域中。

本发明的另一个目的是提供使用前述对比剂用于对比增强淋巴系统 造影术的方法。

本发明的另一个目的是提供使用前述对比剂诊断淋巴结癌症的方法。

问题的解决方案

在一个总的方面中，本发明提供了用于对比增强淋巴系统造影术的对 比剂、使用所述对比剂用于对比增强淋巴系统造影术的方法、以及使用所 述对比剂用于诊断淋巴结癌症的方法，所述对比剂包含通过贻贝粘附蛋白 模拟共聚物在水性介质中分散并稳定的铁氧化物纳米颗粒。更特别地，所 述贻贝粘附蛋白模拟共聚物是聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4-二羟基 苯丙氨酸)（PEI-接枝-(PEG;PDOPA)），其包含接枝有对水性介质具有亲 和力的基于聚乙二醇之生物相容性聚合物的聚乙烯亚胺（有时缩写为“聚 乙二醇接枝的聚乙烯亚胺”）和对纳米颗粒表面具有亲和力的聚3,4-二羟 基苯丙氨酸（PDOPA）。本发明还提供了用于对比增强淋巴系统造影术的 对比剂、使用所述对比剂用于对比增强淋巴系统造影术的方法、以及使用 所述对比剂用于诊断淋巴结癌症的方法，所述对比剂包含通过以下方法制 备的胶体溶液：使用前述贻贝粘附蛋白模拟共聚物修饰铁氧化物颗粒的表 面，然后将所述颗粒分散在水中。

下文中，将更详细地描述本发明。

用于本发明的贻贝粘附蛋白模拟共聚物是聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二 醇;聚3,4-二羟基苯丙氨酸)（PEI-接枝-(PEG;PDOPA)），其包含接枝有对 水性介质具有亲和力的基于聚乙二醇之生物相容性聚合物的聚乙烯亚胺 （有时缩写为“聚乙二醇接枝的聚乙烯亚胺”）和对纳米颗粒表面具有亲 和力的聚3,4-二羟基苯丙氨酸（PDOPA），并且包含贻贝粘附氨基酸，即 3,4-二羟基苯丙氨酸（DOPA）。

为了制备聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4-二羟基苯丙氨酸)，首先 使聚乙二醇和聚乙烯亚胺通过共价键组合以形成聚乙烯亚胺-接枝-聚乙 二醇。将所形成的产物用作生物相容性大分子引发剂（macro-initiator）。

本文使用的聚乙二醇可以是数均分子量为300至50,000并且在其末 端具有羟基或羧基的聚乙二醇。根据本发明的一个实施方案，所述聚乙二 醇是在一端具有甲氧基并且在另一端取代有羧基的甲氧基聚乙二醇羧酸。

本文使用的聚乙烯亚胺可以是没有毒性的支化聚乙烯亚胺，其数均分 子量为100至10,100，优选100至2,000。如果支化聚乙烯亚胺的数均分 子量小于100，则本发明所产生的共聚物不能与因此有用的生理活性物质 合适地组合。另一方面，当数均分子量为10,100或更大时，可导致上述 物质难以通过肾脏从身体中排泄出来。因此，本发明优选使用数均分子量 在前述范围中的聚乙烯亚胺。

用于本发明的聚3,4-二羟基苯丙氨酸（PDOPA）可以是具有3,4-二羟 基苯丙氨酸（DOPA）作为单体的缩合聚合物。重复单元通过酰胺键连接。 重复单元的数目范围为1至100。聚3,4-二羟基苯丙氨酸（PDOPA）可使 用以下多种偶联方法通过固相合成和液相合成来聚合：碳化二亚胺介导的 反应、对称酸酐法、混合酸酐法、活性酯法、叠氮化物法、酰氯法和N- 羧酸酐（N-carboxyanhydride）法。提供前文所述的这样的实例方法以清 楚理解聚3,4-二羟基苯丙氨酸（PDOPA）。但是，聚3,4-二羟基苯丙氨酸 （PDOPA）不限于通过上述方法合成的聚合物。用于本发明的聚3,4-二 羟基苯丙氨酸（PDOPA）可通过前文所述的几种方法制备，优选通过N- 羧酸酐法制备。

用于本发明的聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4-二羟基苯丙氨酸)可 包含：由以下结构(A)表示的聚乙二醇单元、由以下结构(B)表示的聚乙烯 亚胺单元和由以下结构(C)表示的聚3,4-二羟基苯丙氨酸（PDOPA）。

其中a的范围是2至1200。

其中A是支化的聚乙烯亚胺并且x的范围是1至100。

其中d的范围是1至100。

上述聚乙烯亚胺单元(B)可特别地由以下结构表示。

其中b和c的范围各自独立为1至100，优选1至30。

用于本发明的聚3,4-二羟基苯丙氨酸（PDOPA）由3,4-二羟基苯丙氨 酸（DOPA）的N-羧酸酐（NCA）合成，其中DOPA是贻贝粘附氨基酸 之一并且优选地是选自L-DOPA（L-3,4-二羟基苯丙氨酸）和D-DOPA （D-3,4-二羟基苯丙氨酸）的至少一种。PDOPA可选自：由L-DOPA（L-3,4- 二羟基苯丙氨酸）的N-羧酸酐（NCA）合成的L-PDOPA、由D-DOPA （D-3,4-二羟基苯丙氨酸）的N-羧酸酐（NCA）合成的D-PDOPA和由 L,D-DOPA（L,D-3,4-二羟基苯丙氨酸，L-DOPA和D-DOPA的混合物） 的N-羧酸酐（NCA）合成的L,D-PDOPA。

贻贝粘附蛋白模拟共聚物（即，聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4- 二羟基苯丙氨酸)）可通过以下操作制备：

(a)使作为亲水聚合物的聚乙二醇与聚乙烯亚胺通过共价键合而组 合，从而形成聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇；(b)在保护3,4-二羟基苯丙氨 酸（DOPA）的羟基之后，在三光气催化剂存在下合成3,4-二羟基苯丙氨 酸N-羧酸酐（DOPA-NCA）；以及(c)使操作(a)中制备的聚乙烯亚胺-接 枝-聚乙二醇与操作(b)中合成的3,4-二羟基苯丙氨酸N-羧酸酐 （DOPA-NCA）在有机溶剂中反应，从而制备聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二 醇;聚3,4-二羟基苯丙氨酸)。

操作(a)是制备用于制造贻贝粘附蛋白模拟共聚物的生物相容性大分 子引发剂的方法。在操作(a)中，聚乙二醇与聚乙烯亚胺的共价键合可使 用二环己基碳二亚胺（DCC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）实施或者另外 使用六亚甲基二异氰酸酯（HMDI）实施。在这里，DCC和NHS使具有 甲氧基和羧基末端二者的聚乙二醇中的羧基活化，从而与聚乙烯亚胺的伯 胺反应，因此形成肽共价键。或者，HMDI使具有甲氧基末端的聚乙二醇 的羟基活化并且用来使其与聚乙烯亚胺的伯胺键合。由HMDI活化的聚 乙二醇与聚乙烯亚胺之间的共价键合可包括在前述两种聚合物之间形成 共价键的任何反应。在本发明的一个实施方案中，在将经DCC/NHS活化 的聚乙二醇和聚乙烯亚胺分别溶解于氯仿之后，将聚乙二醇溶液逐滴添加 到聚乙烯亚胺溶液中，从而使这两种聚合物能够共价键合。在完成反应之 后，将反应溶液浓缩并在乙醚中沉淀以产生其中聚乙二醇和聚乙烯亚胺共 价键合的聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇。经DCC/NHS活化的聚乙二醇的结 构以及经活化的聚乙二醇和支化型聚乙烯亚胺（PEI）的共价键结构如下 举例说明：

[其中，a的范围是2至1200。]

<活化聚乙二醇（PEG-NHS）>

[其中，a的范围是2至1200。]

<聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇（PEI-接枝-PEG）>

可使用选自贻贝粘附氨基酸（即，L-DOPA（L-3,4-二羟基苯丙氨酸） 和D-DOPA（D-3,4-二羟基苯丙氨酸））的至少一种作为原料并且通过相 关领域已知的制备氨基酸N-羧酸酐（NCA）的任何方法来执行操作(b)中 3,4-二羟基苯丙氨酸N-羧酸酐（DOPA-NCA）的合成。优选地，在三光 气催化剂存在下通过使贻贝粘附氨基酸（D-DOPA或L-DOPA或 L,D-DOPA）在适当溶剂中反应来制备前述物质（NCA）。

根据本发明的一个实施方案，如下举例说明，使用乙酸酐以及盐酸将 DOPA溶解于乙酸，然后乙酰化L-DOPA的羟基以合成(AC)₂-DOPA，同 时保护羟基。其后，使用三光气在由四氢呋喃（THF）构成的有机溶剂中 合成了DOPA的N-羧酸酐（NCA）[见下]。

<3,4-二羟基苯丙氨酸N-羧酸酐（DOPA-NCA）的反应方案>

操作(c)中聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4-二羟基苯丙氨酸)的制备 可通过操作(a)中形成的聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇和操作(b)中合成的 3,4-二羟基苯丙氨酸N-羧酸酐（DOPA-NCA）在有机溶剂中的多点引发 （multi-initiation）使它们能够聚合来执行。共聚物中的聚DOPA通过使 用作为多点引发剂的存在于聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇中的伯胺诱导3,4- 二羟基苯丙氨酸N-羧酸酐（DOPA-NCA）的聚合来合成。根据前述方法， 所合成的聚3,4-二羟基苯丙氨酸（PDOPA）与聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇 组合产生最终产物，即聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4-二羟基苯丙氨 酸)。

在操作(c)中，通过调节用作生物模拟缀合物位点的3,4-二羟基苯丙氨 酸N-羧酸酐（DOPA-NCA）的添加量，本发明的共聚物可具有受控的键 合能力和疏水性质（“疏水性”）。优选地，聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇与3,4- 二羟基苯丙氨酸N-羧酸酐（DOPA-NCA）的相对摩尔比的范围是1:1至 1:50。如果所述摩尔比超出上述范围，则可引起贻贝粘附蛋白模拟共聚物 的疏水性增加或其键合能力降低的问题。

用于操作(c)的有机溶剂可包括选自二甲亚砜（DMSO）、四氢呋喃 （THF）和氯仿（ClCH₃）的至少一种。

在操作(c)中完成聚合后，可进一步包括操作(d)，其是用于使聚3,4- 二羟基苯丙氨酸（PDOPA）的保护性羟基脱保护的方法。根据本发明的 一个实施方案，在完成聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4-二羟基苯丙氨 酸)的聚合之后，将产物分散在二甲基甲酰胺（DMF）中。其后，通过向 其中添加适当量的哌啶，可使经乙酰基保护的DOPA的羟基去乙酰化， 进而产生由以下结构表示的聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4-二羟基苯 丙氨酸)：

[其中a的范围是2至1200，并且d和d’的范围各自独立为1至100。]

<聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4-二羟基苯丙氨酸)（PEI-接枝 -(PEG;PDOPA)）>

用于本发明的聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4-二羟基苯丙氨酸)可 以是生物相容性的支化型分散稳定剂，其包含贻贝粘附蛋白模拟生物相容 性聚合物并包含聚3,4-二羟基苯丙氨酸，并且可用于在水性介质中分散并 稳定纳米颗粒。

这样的纳米颗粒可包括金属、金属氧化物、金属合金、有机聚合物和 /或无机聚合物，并且大小为100nm或更小。更特别地，其选自以下的至 少一种：铁氧化物、铁酸钴（CoFe₂O₄）、铁酸锰（MnFe₂O₄）、铁-铂合 金（Fe-Pt合金）、钴-铂合金（Co-Pt合金）、钴（Co）、硒化镉（CdSe）、 碲化镉（CdTe）、硒化镉/硫化锌核/壳（CdSe/ZnS核/壳）、硒化镉/硒化 锌核/壳（CdSe/ZnSe核/壳）、硒化镉/硫化镉核/壳（CdSe/CdS核/壳）、 碲化镉/硫化锌核/壳（CdTe/ZnS核/壳）、碲化镉/硒化锌核/壳（CdTe/ZnSe 核/壳）、碲化镉/硫化镉核/壳（CdTe/CdS核/壳）、碲化镉/硒化镉核/壳 （CdTe/CdSe核/壳）、硫化锌（ZnS）、硫化镉（CdS）、砷化铟（InAs）、 磷化铟（InP）、砷化铟/磷化铟核/壳（InAs/InP核/壳）、砷化铟/硒化镉 核/壳（InAs/CdSe核/壳）、砷化铟/硫化锌核/壳（InAs/ZnS核/壳）、砷 化铟/硒化锌核/壳（InAs/ZnSe核/壳）、磷化铟/硒化镉核/壳（InP/CdSe 核/壳）、磷化铟/硫化锌核/壳（InP/ZnS核/壳）、磷化铟/硒化锌核/壳 （InP/ZnSe核/壳）、金（Au）、钯（Pd）、铂（Pt）、聚苯乙烯和聚四 氟乙烯（Teflon）。

铁氧化物可包括FeO、Fe₃O₄（磁铁矿）、α-Fe₂O₃、β-Fe₂O₃、γ-Fe₂O₃（磁赤铁矿）、ε-Fe₂O₃、Fe(OH)₂、Fe(OH)₃、α-FeOOH、β-FeOOH、 γ-FeOOH、δ-FeOOH、Fe₅HO₈·H₂O、5Fe₂O₃·H₂O、FeOOH·0.4H₂O、 Fe₈O₈(OH)₆(SO)·nH₂O、Fe₁₆O₁₆(OH·SO₄)_12-13·10-12H₂O等。更优选地，使 用Fe₃O₄（磁铁矿）、γ-Fe₂O₃（磁赤铁矿）或Fe₃O₄（磁铁矿）与γ-Fe₂O₃（磁赤铁矿）的混合物。

用于本发明的铁氧化物的核直径的范围可以是1至25nm。可通过透 射电子显微镜（TEM）观察铁氧化物的核直径。如果铁氧化物的核直径 小于1nm，则MRT2对比效应降低。相反地，当铁氧化物的核直径超过 25nm时，化合物显示出亚铁磁性质并且不能用于MRI。

通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物、聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4- 二羟基苯丙氨酸)而在水性介质中稳定的每一颗铁氧化物纳米颗粒的水 动力学直径（hydrodynamic diameter）范围可以为3至100nm。水动力 学直径可在将纳米颗粒分散于水中时通过动态光散射（DLS）来测量。当 水动力学直径小于3nm时，引入体内并且亲水的铁氧化物纳米颗粒可容 易地于在淋巴结上沉积之前从身体排泄出来。另一方面，如果水动力学直 径超过100nm，则引入体内并且亲水的铁氧化物纳米颗粒在体内可被免 疫系统（巨噬细胞等）过早移除，从而不沉积或极少沉积在淋巴结上。

淋巴结对比成像法可利用在施用用于淋巴结成像的对比剂之前和之 后由淋巴结产生的MRI信号强度的变化或差异，所述对比剂包含通过以 下方法制备的胶体溶液：使用上述贻贝粘附蛋白模拟共聚物修饰铁氧化物 颗粒的表面，然后将所述颗粒分散在水中。可基于T2信号的改变来确定 淋巴结中MRI信号强度的变化。

为了使MRI方法中的对比成像效应最大化，可通过静脉注射、经口 施用等进行用于本发明之对比剂的引入。其中，更优选使用静脉注射使铁 氧化物在淋巴结上的沉积最大化。

在上述的多种纳米颗粒中，在将通过前述贻贝粘附蛋白模拟共聚物分 散并稳定的铁氧化物纳米颗粒用于体内MRI对比成像的情况下，观察淋 巴结中的T2信号衰减率为约80%或更高，从而推断铁氧化物纳米颗粒可 用于诊断淋巴结转移癌。

根据以下详细的描述、附图和权利要求将使其他特征和方面显而易 见。

发明的有利效果

用于本发明的贻贝粘附蛋白模拟共聚物具有通过多点引发聚合形成 的聚3,4-二羟基苯丙氨酸（PDOPA），进而每个分子具有至少一个单元的 DOPA（即多重相互作用配体（multiple interaction ligand，MIL）并且对 亲水性表面表现出高的键合强度。因为上述共聚物具有正电荷，所以它可 向具有负电荷的纳米颗粒表面赋予额外的静电键合力。而且，因为具有亲 水性质的多个聚乙二醇分子与支化型聚乙烯亚胺的分支键合，所以通过亲 水性质和立体效应可实现高水性分散稳定。因此，如本发明所述，通过贻 贝粘附蛋白模拟共聚物在水性介质中分散并稳定的铁氧化物纳米颗粒胶 体——用于对比增强淋巴系统造影术的对比剂（其包含前述共聚物）以及 淋巴结对比成像法可实现优良的体内对比成像效应，从而可用于诊断淋巴 结转移癌。

附图说明

图1举例说明了贻贝粘附蛋白模拟共聚物的化学结构和用于本发明 的纳米颗粒的稳定；

图2举例说明了在制备实施例<1-6>中制备的PEI-接枝 -(PEG;PDOPA₅)的¹H-NMR（DMSO中）的分析结果；

图3举例说明了在制备实施例<1-6>中制备的PEI-接枝 -(PEG;PDOPA₅)的¹H-NMR（CDCl₃中）的分析结果；

图4举例说明了在制备实施例<1-6>中制备的PEI-接枝 -(PEG;PDOPA₁₅)的¹H-NMR（DMSO中）的分析结果；

图5举例说明了在制备实施例<1-6>中制备的PEI-接枝 -(PEG;PDOPA₁₅)的¹H-NMR（CDCl₃中）的分析结果；

图6举例说明了HepG2细胞随实施例1中胶体溶液之铁含量变化的 活力；

图7是示出实施例2中在施用对比剂（PDIE1）之前和之后裸鼠中 T2信号的测量结果的图像；

图8是示出实施例2中在施用另一种对比剂（PDIE2）之前和之后裸 鼠中T2信号的测量结果的图像；

图9是示出实施例2中在施用另一种对比剂（PDIE3）之前和之后裸 鼠中T2信号的测量结果的图像；

图10是示出实施例2中在施用另一种对比剂（PDIE4）之前和之后 裸鼠中T2信号的测量结果的图像；

图11是示出实施例2中在施用对比剂之前和之后的T2信号衰减效 应的图；

图12举例说明了在稳定之前分散的铁氧化物纳米颗粒（a：11nm）， 以及在使用贻贝粘附蛋白模拟共聚物（MIL2）使其稳定后在水中分散的 铁氧化物纳米颗粒胶体（b：11nm）的透射电子显微镜（TEM）图像；

以及通过动态光散射（DLS）装置测量的通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物在 水中稳定分散之各分散铁氧化物纳米颗粒胶体的水动力学直径（c）；

图13举例说明了铁氧化物纳米颗粒和通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物 修饰的铁氧化物纳米颗粒胶体在水中分散并稳定的稳定性随多种pH值和 铁浓度的实验结果，其中水动力学直径（HD）使用DLS装置测量，然后 比较测量结果（MIL0（◆）、MIL1（▲）和MIL2（○））；以及

图14示出了在实施例4中转移癌模型的对比增强淋巴系统造影术的 图像（a：在注射对比剂之前，b：在注射对比剂之后）以及兔转移癌模型 的组织病理学结果（c）。在图14中，标记（+）的部分指根据MRI扫描 被评价为转移癌的淋巴结，标记（-）的部分指根据MRI扫描检查为正常 的淋巴结。

具体实施方式

参照附图根据实施方案的以下描述，本发明的优点、特征和方面将变 得显而易见，其在下文中列出。但是，提供这样的实施方案以更清楚地理 解本发明，并且本发明技术配置的范围不应解释为限制于本文所列的实施 方案。相反地，相关领域普通技术人员可对本发明的主要构思及其性能简 单地作出多种修改和/或改变。

下文中，将参照附图详细地描述示例性实施方案。

L-3,4-二羟基苯丙氨酸（“L-DOPA”）、PEG-OH（5,000Da）、二甲基 甲酰胺（DMF）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N,N’-二环己基碳二亚胺 （DCC）、乙酸酐、冰醋酸、二氯甲烷（MC）和氯仿购买自Sigma Chemical  Company（St.Louis,MO），并且PEI（1,800Da（PEI1,800））购买自 AlfaAesar。将这些材料在真空下40℃干燥48小时后使用。

[制备实施例1]合成贻贝粘附蛋白模拟共聚物

<1-1>活化聚乙二醇

<1-1-1>使用二环己基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（DCC/NHS）

在安装回流冷凝器之后，在250ml烧瓶中将甲氧基聚乙二醇羧基 （PEG-COOH，5000）（10g）溶解于二氯甲烷（CHCl₂）（50ml）中。 然后向其中添加N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（0.52g）和二环己基碳二亚 胺（DCC）（0.74g），然后在室温下反应20小时。通过过滤除去二环己 基脲之后，在乙醚中沉淀该物质，产生活化状态的聚乙二醇（PEG-NHS）。 （产率=87%）

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):4.1(b,-CO-CH₂-CH₂-CH₂- O-),3.5-3.8(m,-CH₂CH₂O-),2.8(b,-CO-CH₂-CH₂-CO-),1.8(b,-CO-CH₂-CH₂-CH₂- CH₂-CH₂-O-),1.2(b,-CO-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-).

<1-1-2>使用六亚甲基二异氰酸酯（HDMI）

在安装回流冷凝器之后，在100ml烧瓶中将甲氧基聚乙二醇 （PEG-OH）（15.23g）溶解于氯仿（CHCl₃）（15ml）中。然后，使用六 亚甲基二异氰酸酯（HMDI）（60ml）处理溶液，然后反应24小时以制 备聚合物。反应完成之后，在石油醚中沉淀聚合物以纯化所述聚合物，并 且在用石油醚（400ml）洗涤三次后，将经洗涤的物质再次溶解于氯仿 （CHCl₃）（20ml）中。之后，在石油醚（500ml）中再次沉淀溶液以纯 化所述物质。前述步骤重复10次，然后在真空下干燥，得到活化状态的 聚乙二醇（产率=80%）。

<1-2>形成聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇（PEI-接枝-PEG）

将实施例<1-1>中得到的活化聚乙二醇（PEG-NHS）（2g）溶解于氯 仿（200ml）中。然后，在将聚乙烯亚胺（AlfaAesar,1800Da,0.5g）溶 解于氯仿（50ml）中之后，向其中逐滴添加聚乙二醇溶液以进行聚乙二 醇与聚乙烯亚胺之间的共价键合反应。在这里，反应进行24小时，并且 在完成反应后，所得产物经真空浓缩器浓缩至30ml的总体积。在此之后， 在乙醚中沉淀所浓缩的物质以得到聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇（PEI-接枝 -PEI）。（产率=85%）¹H NMR(300MHz,D₂O)。测量结果（PEG的-CH₂CH₂O- 在3.5至3.8ppm，PEI的-CH₂CH₂NH-在2.5至3.2ppm）发现PEI-接枝 -PEG的M_n为约41,800Da。推断各PEI-接枝-PEG具有差不多8个（下 文中，称之为PEI₁-接枝-PEG₈）。

¹H NMR(300MHz，D₂O):3.5-3.8(m，-CR₂CH₂O-)，3.3(s，CH₃O-)，2.5-3.2(m，-CR₂CH₂NH-).

<1-3>保护DOPA氨基酸的羟基

将L-DOPA（3g）悬于冰醋酸（100ml）中，然后在室温下用盐酸 的干燥气体换气（purge）5小时。添加乙酸酐（3ml）并在室温下反应1 小时30分钟之后，再添加3ml乙酸酐并使反应在60℃油浴中进行30分 钟。在真空浓缩器中浓缩反应产物并且通过添加乙醇除去未反应的乙酸 酐。其后，在乙醚中沉淀剩余产物以得到具有受经保护的羟基的DOPA 氨基酸（DOPA(Ac)₂）（产率=80%）

¹HNMR(300MHz,D₂O). 6.7-6.9(m,-C₆H₃(OH)₂),4.0(m,C₆H₃(OH)₂-CH₂-CH(N-)-C(O)N-),3.2(m,C₆H₃(OH)₂-CH₂-CH-),2.4(s,CH₃(CO)-).

<1-4>合成DOPA氨基酸N-羧酸酐（DOPA-NCA）

将实施例<1-3>中合成的具有经保护的羟基的0.5gDOPA氨基酸以 及0.5g三光气分散在THF（50ml）中并在60℃油浴中反应。接着，将 反应产物在己烷（800ml）中沉淀，溶解于THF（50ml）并再在己烷中 沉淀。前述步骤重复三次。纯化之后，使用真空干燥器干燥产物，得到 DOPAN-羧酸酐（DOPA(AC₂)-NCA）。（产率=65%）

¹HNMR(300MHz,DMSO):6.2-6.9(m,-C₆H₃(OH)₂),4.3(t,-NHCHCO- ),3.7(m,C₆H₃(OH)₂-CH₂-CH(N-)-C(O)N-),3.3(m,C₆H₃(OH)₂-CH₂-CH-),2.4(s,CH₃(CO)-).

<1-5>合成聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4-二羟基苯丙氨酸) （PEI-接枝-(PEG;PDOPA)）

使用0.5g不同摩尔比（分别为1:5至1:15）的实施例<1-2>中制备的 聚乙烯亚胺-接枝-聚乙二醇（PEI-接枝-PEG）和实施例<1-4>中制备的 DOPAN-羧酸酐（DOPA(AC₂)-NCA）并在THF溶剂中反应，从而合成 聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4-二羟基苯丙氨酸)（产率，摩尔比 1:5=85%，摩尔比1:15=87%）。

<1-6>使聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4-二羟基苯丙氨酸)脱保护

在将0.5g实施例<1-5>中合成的聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4- 二羟基苯丙氨酸)溶解于DMF（30ml）中之后，向其中添加8ml哌啶。 反应15分钟后，在乙醚中沉淀反应产物以得到其中使DOPA的经保护之 羟基脱保护的聚乙烯亚胺-接枝-(聚乙二醇;聚3,4-二羟基苯丙氨酸)。（产 率，摩尔比1:5=80%[图2和图3]，摩尔比1:15=81%[图4和图5]）。

下表1示出本发明的贻贝粘附蛋白模拟共聚物的结构及其特征的测 定结果，其中已通过¹H-NMR和紫外可见光谱并使用荧光标记测定了聚 合共聚物的结构及其特征。

表1

贻贝粘附蛋白模拟共聚物的结构和特征分析

[制备实施例2]制备通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物稳定的铁氧化物（Fe₃O₄）纳米颗粒

将在有机溶剂中合成并用油酸稳定的10mg铁氧化物纳米颗粒 （Fe₃O₄）以及60mg贻贝粘附蛋白模拟共聚物（分别为MIL1和MIL2） 分散在10ml氯仿（CHCl₃）中并在室温下搅动（agitate）30分钟，在蒸 发氯仿（CHCl₃）并向残余物中添加蒸馏水之后，通过200nm针筒过滤 器（MCE针筒过滤器，Fisher Scientific）过滤分散产物。在离心以除去 未反应的稳定剂之后，使用自旋过滤器（spin filter）（Millipore,10K  NMWL,10000xg,10分钟）重复过滤3至5次。将所得产物分散在pH为 7的水性体系（0.01MPBS：磷酸缓冲盐溶液）中。

[实施例1]通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物稳定之铁氧化物（Fe₃O₄）纳米颗粒的胶体溶液中的细胞活力测试

根据制备实施例1和2中提出的方法将具有下表2所示物理性质的使 用贻贝粘附蛋白模拟共聚物稳定的铁氧化物（Fe₃O₄）分散在水中以制备 胶体溶液。

表2

使用贻贝粘附蛋白模拟共聚物稳定的铁氧化物（Fe₃O₄）的胶体溶液

向表2所示的分散稳定的铁氧化物（Fe₃O₄）纳米颗粒中添加PBS粉 末以达到0.01M的浓度。为了确定生物适用性，用HepG2细胞进行MTT 测定。

<1-1>制备样品

在使包含PBS的PD1和PD2分别通过0.2μm无菌针筒过滤器后， 使用电感耦合等离子体原子发射光谱法（inductively coupled  plasma-atomic emission spectroscopy，ICP-AES）测定浓度。分别取得200 μLPD1和PD2的等分试样，将等分试样与200μL培养基（DMEM：达 尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbeco"sModifiedEagles"sMedium）89%， F-12710%，AA：抗生素-抗真菌素1%）混合以制备样品0。 将0.350μL样品0与350μL培养基混合以制备样品1。另外，将350μL 样品1与350μL培养基混合以制备另一种样品，称为样品2。同样地， 将起始浓度稀释至其1/2以分别制备PD1和PD2的九（9）个样品1至9。 而且，样品10是既不含PD1又不含PD2的100%培养基。作为对照，根 据前述步骤分别制备用于PD1和PD2的PBS溶液（参见表3）。

表3

用于细胞活力测试的铁氧化物（Fe₃O₄）胶体样品

<1-2>培养和制备细胞（HepG2）

在通过继代培养使HepG2细胞增殖之后，将细胞装入96孔板中以得 到100,000个细胞/孔。在这里，在这96个孔中，仅使用除板边缘的孔之 外的60个孔。为了将HepG2细胞固定在孔板底部，将这些在37℃孵育 24小时。

<1-3>添加样品

从孵育<1-2>中制备HepG2的孔板中除去培养基。向不含培养基的孔 板的每个孔中分别装入PD1、PD2和对照的100μL各个样品1至10（其 在<1-1>中制备，如表3所示）。在这里，每种样品和对照制备三（3）份。 在装入样品之后，在37℃进行孵育24小时。

<1-4>细胞活力测试（MTT测试）

MTT测试是使用以下原理测定细胞活力的实验：其中基于四唑盐的 黄色MTT试剂通过代谢活化细胞（metabolically activated cell）变为紫 色甲臜晶体。

将用于细胞活力测试的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基 -2H-四氮唑溴化物）试剂溶解于37℃水浴中，1小时后进行测试。向96 孔板的每个孔中引入<1-3>中制备的样品和对照，向其中添加20μL制备 的MTT试剂。在这里，需要特别预防措施以防止测试孔暴露于光。为了 鉴定代谢活化细胞，在添加MTT试剂后将测试孔在37℃孵育4小时。孵 育之后，为了溶解紫色甲臜晶体，将100μL可溶溶液添加到每个孔中并 继续在37℃孵育24小时。孵育之后，使用微板阅读器（Molecular Devices  Co.,Spectra Max190）分别测量550nm和690nm处的光密度，并且由 测量的光密度计算细胞活力。细胞活力可根据以下等式1来计算。

[等式1]

OD_i,550：其中引入样品的孔板No.i在550nm处的光密度。

OD_i,690：其中引入样品的孔板No.i在690nm处的光密度。

ODS_i,550：对照孔板No.i在550nm处的光密度。

ODS_i,690：对照孔板No.i在690nm处的光密度。

图6是举例说明细胞活力测试的结果的图。在细胞活力测试中，允许 误差范围（通常为公差（tolerance））一般是±20%。由本测试的结果可 发现，在待测试的大部分浓度部分中表现出80%或更高的细胞活力。

这样的结果证实通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物稳定的铁氧化物 （Fe₃O₄）纳米颗粒没有细胞毒性并且可在体内安全使用。

[实施例2]测定包含含有通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物稳定之铁氧化物（Fe₃O₄）纳米颗粒的胶体溶液的对比剂的体内MRI性能

根据实施例1中的方法制备包含使用贻贝粘附蛋白模拟共聚物稳定 之铁氧化物（Fe₃O₄）纳米颗粒的胶体溶液。

表4

实施例2的通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物稳定的铁氧化物（Fe₃O₄）纳米 颗粒胶体溶液

如表4所示，将磷酸缓冲盐水（PBS）添加到各胶体溶液中，其中铁 氧化物（Fe₃O₄）纳米颗粒在其中分散并稳定，制备了对比剂。为了评价 制备的对比剂作为MRI对比剂的可用性，将环形线圈（loop coil）用于 MRI诊断装置（Trio3.0T,Simens）以测定体内T2对比成像性能。

用裸鼠（Balb/裸的）进行体内对比成像性能的评价。裸鼠重30g。 麻醉后，将小鼠水平放置在MRI诊断装置中并沿其横截面观察。在注射 对比剂之前和之后24小时对裸鼠的MRI图像进行测量，并且观察注射对 比剂之前和之后的淋巴结并彼此进行比较。将PBS粉末添加到胶体溶液 中以达到0.01M的浓度，从而制备期望的对比剂。通过ICP-AES分析铁 含量并且将小鼠重量考虑在内来计算施用剂量（表4），从而制备总体积 500μL的对比剂。对比剂通过小鼠的尾静脉注射。

使用由SiemensCo.提供的T2Me3d脉冲序列来确定体内T2成像性 能，具体参数如下。

TR（重复时间）=40.0毫秒，TE（回波时间）=22.0毫秒，FOV=49mm ×70mm，矩阵尺寸=256×180，切片厚度=0.6mm，采集数目=6

图7至10部分地举例说明了在前述条件下得到的体内MRI图像。

为了对制备的对比剂的T2衰减效应进行定量，从最高可见的淋巴结 （即，腹股沟淋巴结和肱淋巴结）选择一个横截面并且选择淋巴结的脱色 部分作为ROI（目的区域）。在所选择的部分中，测量信号强度。因为每 当测量MRI图像时得到的MRI图像的总信号强度改变，所以难以基于信 号强度（S：信号强度）的绝对值评价对比成像性能。对于腹股沟淋巴结， 将右后肢肌肉用作对照（N：噪音）。另一方面，对于肱淋巴结，将右爪 肌肉用作对照（N：噪音）。相比于对照，计算信噪比（SNR）。通过比较 使用对比剂之前和之后的SNR值，

计算了T2信号衰减率（ΔR2）。结果通过图11中的图举例说明。以 下等式2是用于计算T2信号衰减率（ΔR2）的方法。

[等式2]

由图7至10可看出施用对比剂之后变暗的裸鼠的淋巴结。表5和6 包括向腹股沟淋巴结和肱淋巴结各自施用对比剂样品之前和之后的信噪 比（SNR）和信号衰减率（ΔR2）。图11举例说明了施用对比剂样品之 前和之后的信噪比（SNR）。发现与施用对比剂之前相比，施用对比剂之 后的信号衰减显著较高。

表5

经对比剂处理的裸鼠腹股沟淋巴结的T2信号

表6

经对比剂处理的裸鼠肱淋巴结的T2信号

[实施例3]测定包含通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物稳定之铁氧化物（Fe₃O₄）纳米颗粒的胶体溶液的稳定性

图12是举例说明在通过MIL2改良之前（a）和在通过MIL2改良之 后（b）铁氧化物（Fe₃O₄）纳米颗粒的TEM照片。

根据图12中的TEM照片，可理解在水中稳定分散的铁氧化物 （Fe₃O₄）与溶解在疏水溶剂中的铁氧化物（Fe₃O₄）纳米颗粒具有基本上 相同的形态和大小。另外，图12还举例说明了各铁氧化物（Fe₃O₄）纳米 颗粒胶体的水动力学直径。铁氧化物（Fe₃O₄）纳米颗粒胶体的水动力学 直径是通过动态光散射（DLS）方法测量的数均水动力学直径并且观察到 大小均一。

图13举例说明了通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物在水性介质中稳定分 散的铁氧化物（Fe₃O₄）纳米颗粒胶体随多种pH值（a）和铁浓度（b） 的稳定性。在这里，水动力学直径通过DLS在多种pH值和铁浓度下测 量。可确定与未使用贻贝粘附蛋白模拟共聚物的铁氧化物（Fe₃O₄）纳米 颗粒（MIL0（◆））相比，使用贻贝粘附蛋白模拟共聚物在水性介质中稳 定分散的铁氧化物（Fe₃O₄）纳米颗粒胶体（MIL1（▲）、MIL2（○）） 在多种浓度和pH值下相对稳定。

[实施例4]使用包含通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物稳定之铁氧化物（Fe₃O₄）纳米颗粒的胶体溶液的对比剂的转移癌诊断

根据实施例1和2中的方法制备了通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物稳定 的铁氧化物（Fe₃O₄）纳米颗粒的胶体溶液。

表7

实施例4的通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物稳定的铁氧化物（Fe₃O₄） 纳米颗粒的胶体溶液

通过使用注射用盐溶液（0.9%NaCl）稀释表7中的胶体溶液，然后 制备铁浓度为6240ppm并且总体积为5mL的对比剂，同时通过ICP-AES 测定铁浓度并且将兔重量考虑在内计算施用剂量。对比剂经静脉内注射到 兔耳中。为了实验，通过在12只新西兰白兔（New Zealand white rabbit） 的髂淋巴结中表达VX2癌细胞来建立转移癌模型，然后将其用于评价对 比剂的性能。

带有转移癌的兔子重约3kg。麻醉后，将兔水平放置在MRI装置（Trio 3.0T,Simens,膝关节线圈（knee coil））中，然后观察其横截面。在注射 对比剂之前和之后24小时测量兔的MRI图像，观察注射对比剂之前和之 后的髂淋巴结并彼此进行比较。分离每只兔子的髂淋巴结并用苏木精-伊 红染色，用于病理学家检查。

MRI装置的具体参数如下。

TR（重复时间）=6.2毫秒，TE（回波时间）=2.4毫秒，FOV=145mm ×145mm，矩阵尺寸=129×154，切片厚度=6.0mm，采集数目=1

表8

转移癌模型兔的评价结果

表8和图14中示出了转移癌模型兔的评价结果。表8示出12只兔转 移癌模型的带有转移癌的淋巴结数目和正常的淋巴结数目。敏感度和特异 性分别为100%。图14示出在注射对比剂之前和之后兔No.002的对比增 强淋巴系统造影术的图像和组织病理学的结果。标记（+）的部分指根据 MRI扫描评价为转移癌的淋巴结，标记（-）的部分指根据MRI扫描检 查为正常的淋巴结。

工业适用性

用于本发明的贻贝粘附蛋白模拟共聚物在分子中具有多个单元的 DOPA。DOPA可与无机纳米颗粒相互作用并且对纳米颗粒表面表现出高 的键合强度。另外，上述共聚物带有正电荷，它可向具有负电荷的纳米颗 粒表面赋予静电键合力。而且，因为具有亲水性质的多个聚乙二醇分子与 聚乙烯亚胺的分支键合，所以通过亲水性质和立体效应可实现高水性分散 稳定。表面上的PEG使得铁氧化物纳米颗粒在身体中长时间循环并因此 许多铁氧化物纳米颗粒可到达淋巴结。为了进行更好的T2MR成像，淋 巴结必须尽可能多地摄取纳米颗粒。所以铁氧化物纳米颗粒在身体中长时 间循环是至关重要的。包含通过贻贝粘附蛋白模拟共聚物改良的铁氧化物 纳米颗粒的对比剂似乎被更多地摄取，并因此显示更暗的正常淋巴结和更 暗的转移淋巴结。

总之，作为用于对比增强淋巴系统造影术的对比剂，通过贻贝粘附蛋 白模拟共聚物改良的铁氧化物纳米颗粒有很大潜力用于检测淋巴结转移 癌。