一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体

摘要

本发明公开了一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体。该高抗TuMV的RNA，是具有下述核苷酸序列之一：1）序列表中的SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；2）与1）限定的RNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的RNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。本发明的RNA和编码该RNA的RNAi载体，可用来增强植物对TuMV或草铵膦除草剂的抗性，同时也为高抗TuMV转基因植物的培育奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明属于植物抗病毒基因工程领域，具体涉及一种高抗TuMV的RNA和编码该 RNA的RNAi载体。

背景技术

芜菁花叶病毒(Turnip Mosaic Virus,TuMV)属马铃薯Y病毒科（Potyviridae）、 马铃薯Y病毒属（Potyviruse）。TuMV寄主范围十分广泛，能够侵染43科156属318 种植物。TuMV是危害十字花科作物最为严重的病毒。感染病毒后的作物还容易感染霜 霉病和软腐病，造成复合侵染，直接影响到产量和商品价值。

油菜是我国主要的油料作物，芜菁花叶病毒病是油菜的重要病害之一。在我国长 江中下游，油菜因病毒病减产一般达20-30%，大流行年达50%左右。感病油菜不仅产 量降低，而且产油率和种子萌芽率也明显降低。另据调查我国白菜因TuMV危害平均每 年造成5-10%的产量损失，病害严重的地块几乎绝收。

TuMV主要是靠蚜虫以非持久性的方式传播，至少有89种蚜虫可传播该病毒。而 采用杀虫剂不可能很快杀死全部的蚜虫以阻止病毒的传播，仅靠杀虫剂杀蚜防治病毒 病的效果不明显，还易造成环境污染。因此寻求新的抗病方法成为了一项迫切的任务。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体。

本发明提供的一种RNA，具有下述核苷酸序列之一：

1）序列表中的SEQ ID №.2所示的核苷酸序列；

2）与1）限定的RNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的RNA序列；具 体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的 为98%以上；再具体的为99%以上。

所述具有相同功能具体指具有下述任一功能：

1）增强植物对TuMV的抗性；

2）增强植物对除草剂的抗性。

所述植物具体为拟南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具体为油菜或白菜。

所述增强植物对TuMV的抗性是通过抑制TuMV复制实现的。

所述TuMV具体为TuMV-C4和/或BJ-R01。

所述除草剂具体为草铵膦除草剂。

所述RNA的编码基因也属于本发明的保护范围。

含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌也属于本发明的 保护范围。

所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。

所述重组表达载体为将DNA片段插入出发载体的多克隆位点中得到的；所述DNA片 段为X正向—连接区—X反向；X正向为SEQ ID No.1中第15-360位核苷酸所示，X反向为 X正向的反向互补片段。

具体的，所述出发载体为pBBBast。

所述的重组表达载体中，所述X正向—连接区—X反向片段具有序列表中SEQ ID  №.3所述的第1371-2873位核酸序列。

所述重组表达载体的制备过程具体为：将具有序列表中SEQ ID №.3所述的核酸 序列的双链DNA分子插入植物表达双元载体pBBBast的XmaI单酶切位点，即得重组表 达载体pBBBTu-VPg。

所述插入前，还需在所述pBBBast的XmaI单酶切位点的两个粘性末端各补两个碱 基C。

所述植物表达双元载体pBBBast为将具有序列表中SEQ ID №.4所示核酸序列的 双链DNA分子插入载体pBBR1MCS-2的SspI酶切位点得到的重组质粒。

本发明的另一个目的是提供所述RNA、所述RNA的编码基因、所述含有所述编码 基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌的如下至少一种应用：

1）制备抗TuMV的产品；

2）增强植物对TuMV的抗性；

3）增强植物对草铵膦除草剂的抗性。

所述应用中，所述植物具体为拟南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具体为 油菜或白菜。

所述增强植物对TuMV的抗性是通过抑制TuMV复制实现的。

所述应用中，所述TuMV具体为TuMV-C4和/或BJ-R01。

所述应用中，所述除草剂具体为草铵膦除草剂。

本发明的再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将所述的任一重组表 达载体转入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，具有 如下至少一种性状：1）对TuMV的抗性增强；2）对除草剂的抗性增强。

所述对TuMV的抗性增强是通过抑制TuMV复制实现的。

所述方法中，所述TuMV具体为TuMV-C4和/或BJ-R01。

所述方法中，所述除草剂具体为草铵膦除草剂。

所述方法中，所述目的植物具体为拟南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具 体为油菜或白菜。

附图说明

图1为中间载体的酶切验证结果，其中M为分子量标记；泳道1为pHannibal-VPg 载体的酶切结果；泳道2为连入反向片段pHannibal-VPg(-)载体的酶切结果；泳道3 为pHannibal空载体的酶切结果。

图2为载体pBBBTu-VPg的结构示意图。

图3为植物表达载体pBBBTu-VPg的MluI酶切检测结果图，其中M为分子量标 记；泳道1为pBBBTu-VPg载体的酶切结果。

图4为T₁代苗喷洒草铵膦除草剂后结果，存活的为除草剂抗性株。

图5为部分转基因T₁代苗PCR鉴定结果图，其中泳道M为分子量标记；泳道1 为对照col-0的结果；泳道2-8为除草剂筛选出的转基因T₁代苗的结果。

图6为不同转基因高抗株系接种TuMV-C4后的图片，其中col代表野生型col-0 的结果。

图7为不同转基因高抗株系接种TuMV-C4后种子收获时的图片，其中col代表野 生型col-0的结果。

图8为不同转基因高抗株系接种TuMV-C4后的病情指数统计结果，其中col代表 野生型col-0的结果，#01,#04,#12,#14,#15,#18,#42分别代表7个转基因高 抗株系的结果。

图9为转基因高抗株系#04和#42接种BJ-R01后的图片，其中col代表野生型 col-0的结果。

图10为TuMV-C4接种拟南芥后，RT-PCR检测TuMV外壳蛋白基因在转基因拟南芥 中的表达，其中图a为TuMV-CP片段的扩增结果图，图a中泳道1为阴性对照结果， 泳道M为分子量标记，泳道2为对照Col-0的结果，泳道3-9依次为转基因高抗株系 #01,#04,#12,#14,#15,#18,#42的结果；图b为内参Sand基因的扩增结果图， 图b中泳道M为分子量标记，泳道1为阴性对照结果，泳道2为对照Col-0的结果， 泳道3-9依次为转基因高抗株系#01,#04,#12,#14,#15,#18,#42的结果。

图11为TuMV-C4接种拟南芥后，荧光定量PCR分析结果，其中col代表野生型 col-0的结果，#01,#04,#12,#14,#15,#18,#42分别代7个转基因高抗株系的结 果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、材料

本实验所用野生型拟南芥Col-0购自Arabidopsis Biological Resource Center。

北京地区芜菁花叶病毒TuMV主要的流行强致病株系TuMV-C4获自中国农业科学院 蔬菜花卉所；参考文献：冯兰香、徐玲、刘佳、钮心格、李秀生，北京地区大白菜芜 菁花叶病毒株系的鉴定，中国蔬菜，1988，4:11-13；公众可从北京农业生物技术研 究中心获得该株系。

TuMV萝卜强致病株系BJ-R01为发明人从田间采集并保存。参考文献“叶艳英、 曾钢、闫晓红、马荣才、吴才君、姚磊，江西农业大学学报，2012，34(2):264－269”。 公众可从北京农业生物技术研究中心获得。

大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株购自Tiangen公司，产品目录号为CB101；

农杆菌（Agrobacterium tumefacieus）GV3101（pMP90），参考文献：Koncz,C.and  Schell,J.(1986)The promoter of TL-DNA gene5controls the tissue-specific  expression of chimeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary  vector.Mol.Gen.Genet.204,383–396。公众可从北京农业生物技术研究中心获 得该菌株。

RNAi载体pHannibal公众可从CSIRO（http://www.csiro.au/pi）获得；参考文 献：Wesley S V,Helliwell C A,Smith N A.Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants[J].The Plant Journal, 2001,27(6):581-590。

高保真酶Fast pfu DNA Polymerase、Easy Taq酶和分子量标记购自全式金公司。 质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。 M-MLV反转录酶、定量PCR试剂、限制性内切酶和Klenow Fragment补平酶购自TaKaRa 公司。dNTP、dGTP和dCTP购自Promega公司。

实施例1、RNAi载体的制备

（一）VPg基因保守片段的制备

根据TuMV株系的保守性，选取VPg基因的第152-497位核苷酸序列共346bp的 保守片段为RNA干扰靶标。

提取TuMV-C4菌株的总RNA，并反转录为cDNA，以该cDNA为模板，以下述序列（下 划线部分为酶切位点EcoRI、XbaI和KpnI、ClaI）为引物，用高保真酶Fastpfu DNA  Polymerase进行PCR扩增：

VPg F5’-cggaattctctagaGTATCGGACACAAAAACAGGAAGT-3’；

VPg R5’-ggggtaccatcgatCTCAGTTCGTTTTCTCGCTCTGGG-3’。

PCR扩增程序：94℃ 5min；94℃ 45s，52℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 延伸7min。扩增的目的条带回收。

PCR产物经琼脂糖电泳纯化后回收。所得PCR产物经测序证明核酸序列正确，其 核酸序列具有序列表中SEQ ID №.1所示的核酸序列，其编码的RNA的具有序列表中 SEQ ID №.2所示的核酸序列。

（二）RNAi载体的构建

1、中间载体pHannibal-VPg的制备

1）制备过程

用ClaI和XbaI分别双酶切pHannibal载体和上述制备的PCR产物。酶切后经纯 化回收约5803bp的载体骨架片段和约355bp的PCR产物片段，4℃连接过夜。连接产 物经热击转化大肠杆菌DH5α。挑取克隆，提取质粒并用PstI酶切验证，获得含反向 片段的中间载体pHannibal-VPg(-)。

用KpnI和EcoRI分别双酶切上述制备的PCR产物和连入反向片段的 pHannibal-VPg(-)中间载体。酶切产物经纯化后回收约6148bp载体骨架片段和约368 bp的PCR产物片段，4℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取克隆，提取质 粒并用XbaI酶切验证，获得同时含反向和正向片段的中间载体pHannibal-VPg。

2）所构建载体的酶切验证过程

用XbaI和EcoRI分别双酶切pHannibal空载体、连入反向片段的pHannibal-VPg(-) 和pHannibal-VPg中间载体，酶切后电泳检测，进行验证实验。实验结果见图1。图1 结果显示：pHannibal空载体经双酶切后产生5001bp和823bp两条片段， pHannibal-VPg(-)经双酶切后产生5001bp和1157bp两条片段，pHannibal-VPg经双 酶切后产生5001bp、1509bp和6bp三条片段。酶切及电泳结果表明，中间载体 pHannibal-VPg构建正确。

2、植物表达载体pBBBTu-VPg的制备

1)制备过程

pHannibal的RNAi发卡结构两端各含有1个NotI酶切位点。用NotI酶切含发卡 结构的中间载体pHannibal-VPg，同一酶切体系中再用Klenow酶和dGTP在酶切片段 的两个粘性末端各补两个碱基G，产物于1%琼脂糖凝胶电泳纯化，胶回收含发卡结构 的3656bp的片段备用。经测序，所述含发卡结构的3656bp的片段具有序列表中SEQ  ID №.3所述的核苷酸序列，所述发卡结构片段具有序列表中SEQ ID №.3所述的第 1371-2873位核酸序列。

植物表达双元载体pBBBast可为将具有序列表中SEQ ID №.4所示核酸序列的双 链DNA分子插入载体pBBR1MCS-2的SspI酶切位点，取代质粒pBBR1MCS-2的SspI酶 切位点之间的小片段得到的重组质粒。

质粒pBBR1MCS-2公众可以从北京农业生物技术研究中心获得；参考文献：Kovach  ME,Elzer PH,Hill DS,Robertson GT,Farris MA,Roop RM2nd,Peterson KM.Four  new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying  different antibiotic-resistance cassettes.Gene.1995Dec1;166(1):175-6。

用XmaI单酶切植物表达双元载体pBBBast，再用Klenow酶和dCTP在两个粘性末 端各补两个碱基C，产物于1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收载体片段6559bp，再与上述 制备的含发卡结构的3656bp片段4℃连接过夜，即得植物表达RNAi质粒pBBBTu-VPg， 其结构示意图见图2。

2)所构建载体的酶切验证过程

将上述制备的植物表达载体pBBBTu-VPg进行MluI酶切检测。pBBBast载体本身 有一个MluI酶切位点，连接上述含发卡结构的片段的CaMV启动子上另有一个MluI 酶切位点，酶切后显示2条带的为阳性克隆。根据酶切条带大小可判断插入是顺时针 正向连接或逆时针反向连接。正向连接酶切条带为3721bp和6494bp，反向连接条 带为542bp和9673bp条带。MluI酶切检测结果见图3。图3结果表明针对VPg基因 保守片段的RNAi结构已经连入植物表达双元载体pBBBast的XmaI酶切位点中，并且 为正向连接。

实施例2、高抗TuMV的RNA及编码该RNA的RNAi载体的功能验证

（一）拟南芥的遗传转化及阳性苗的筛选

利用电击法将pBBBTu-VPg载体转入农杆菌GV3101(pMP90)中，采用农杆菌介导的 花序浸渍法侵染拟南芥。将收获的拟南芥T₀代种子播种于盛有营养土的培养托盘中， 置于22℃（昼）/18℃（夜），光照周期为16h（光）/8h（暗）的人工气候室。待幼 苗长出两片子叶后喷洒用水按体积数稀释500倍草铵膦除草剂（所述草铵膦除草剂为 市场购买的商品化的除草剂，其中草铵膦浓度为200mg/L）筛选阳性苗。

经喷洒2-3次草铵膦除草剂筛选后，非转基因苗不能继续生长，逐渐枯黄死亡； 而转基因苗长势茁壮，叶片保持绿色，T₁代苗喷洒草铵膦除草剂后的结果见图4，共 获得60株T₁代除草剂抗性植株。随机抽取48株抗性苗的叶片，用小量快速法提取植 物基因组DNA。用上述引物VPg F和VPg R进行PCR扩增检测，反应条件为：94℃5min； 94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃延伸7min。PCR产物在1%琼脂糖 凝胶上进行电泳检测，扩增出目的基因片段374bp的为转基因阳性苗。检测结果显示 全部为阳性苗。部分幼苗的PCR鉴定结果见图5。

选取鉴定为阳性苗的转基因T1代苗自交留种，T₂代随机抽取32个株系播种，幼 苗喷洒2-3次用水按体积数稀释500倍草铵膦除草剂（所述草铵膦除草剂为市场购买 的商品化的除草剂，其中草铵膦浓度为200mg/L）后统计存活/死亡比。有17个株系 分离比约为3:1，初步确认为单拷贝株系，并单株自交收种子。后代继续筛选不分离 株系即为纯合株系。

（二）转基因植株的抗病鉴定

随机抽取13个纯合株系进行抗病鉴定。将纯合株系、野生型Col-0和转空载体拟 南芥同时进行播种，待幼苗长至8-10片莲座叶时期摩擦接种TuMV的TuMV-C4或BJ-R01 毒株。接种液按病叶重／磷酸缓冲液体积（pH=7.0）约1g/10mL比例配制。每个纯 合株系接种8-12株，每株接种两片较大叶片。以非转基因野生型拟南芥Col-0和转空 载体拟南芥作为对照接种。接种几分钟后立即用清水冲洗叶片。在人工气候室中网罩 隔离观察，20天后进行抗病鉴定及病情指数统计。

病情等级划分：0级完全无症状；1级1-2片未接种叶花叶或发黄，能抽薹；3 级3-4片未接种叶花叶或发黄能抽薹；5级5-6片未接种叶花叶或发黄，影响抽薹； 7级多数叶片花叶或发黄，不能抽薹；9级大部分叶片枯死，植株濒临死亡。

病情指数=100×∑（各级病株数×各级代表值）/(调查总株数×最高级代表值)

抗病接种的部分结果见图6和图7，病情指数统计结果见图8。图6结果显示，接 种TuMV-C4后20天左右，对照野生型Col-0已基本枯萎死亡，转空载体对照结果与 Col-0基本一致，而转基因株系表现出不同的抗性，7个株系（#01,#04,#12,#14,#15, #18,#42）接种后能较好的生长，且后期能够正常结实，表现出对TuMV-C4的高度抗 性。图7结果显示，到种子收获时期接种TuMV-C4的高抗转基因株系可以正常结籽； 而对照Col-0的植株已经全部死亡，无种子可收获。图8结果显示，接种TuMV-C4后， 病情指数统计结果显示高抗株系的抗病性比对照植株Col-0抗性提高约80%，转空载 体对照结果与Col-0基本一致。

高抗转基因株系#04和#42接种BJ-R01后，图9结果显示，对照野生型Col-0发 病显症，而高抗转基因株系#04和#42表现出较好的长势，其对BJ-R01同样具有高度 的抗性。说明本发明对TuMV不同株系的抗性具有一定的广谱性。

高抗转基因株系留种，后代继续进行抗病鉴定。结果显示这些转基因株系对TuMV 的高抗性可以稳定遗传。

（三）半定量和相对定量检测病毒的累积

7个高抗株系#01,#04,#12,#14,#15,#18,#42、对照Col-0及转空载体对照 接种TuMV-C4后约20天，选取各株系未接种叶片用TRIzol法分别提取总RNA，用M-MLV 反转成cDNA。以TuMV外壳蛋白基因的196bp保守片段为检测对象，以拟南芥SAND基 因（AT2G28390）的298bp片段为内参进行半定量和荧光定量分析。

扩增TuMV-CP基因的196bp保守区段的引物序列如下所示：

CP F5’-AAAGCGTAACCAAGACCGACCAT-3’；

CP R5’-TCCATCCAAGCCGAACAAAT-3’。

扩增内参基因SAND基因298bp片段的引物序列如下所示：

SAND F5’-AAGGCAGGAAATCACCAGGTTGTC-3；

SAND R5’-TTAACGCATATGGAAGGGGAAGAC-3’。

RT-PCR反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃  7min。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

荧光定量PCR的反应以稀释40倍的cDNA为模板，SYBR-green I做荧光指示剂， 反应程序采用两步法扩增。扩增条件为：95℃ 30s；95℃ 5s，57℃ 30s，72℃ 30s， 40个循环。每个株系样品进行3次重复实验，取平均值。

半定量检测结果见图10。图10结果显示，在内参基因表达量差不多一致的情况 下，对照Col-0植株体内能检测到大量的病毒累积，转空载体对照结果与Col-0基本 一致，而在高抗转基因株系体内只能检测到微量的病毒。

荧光定量PCR的检测结果见图11。图11结果显示，与半定量的结果一致，在对 照Col-0体内检测到大量的病毒，转空载体对照结果与Col-0基本一致，而7个高抗 株系植物体内几乎检测不到病毒的复制。说明利用VPg基因片段构建的RNAi载体在转 基因植物抗病毒中发挥了重要作用，转基因植株的抗病性显著提高。