确定来自于为肉类生产而饲养的单一动物的各种生物材料中含有的至少一些脂肪酸的量的方法

摘要

本发明涉及从数据库确定各种生物材料中含有的至少一些脂肪酸的量的方法，所述生物材料来自于为肉类生产而饲养的单一动物。所述方法可以被用于确定主要的和次要的脂肪酸的量，以及来自于所述单一动物的其它生物材料的脂肪酸含量。

说明书

技术领域

本发明涉及确定各种生物材料中含有的一些脂肪酸的量的方法，所述生物材料来自于为肉类生产而饲养的单一动物。

背景技术

每个我们食用的产品的脂肪（或脂质）的含量是食品包装标签上呈现的现行信息的一部分。

这些脂质由于它们的高热量和饱和脂肪酸含量而长时间遭到拒绝。

约十年来，科学家们一直在提供越来越多的证据证明脂肪酸不应该被拒绝。对于营养学家来说，在人类饮食中的脂肪酸无所谓好坏，只是脂肪酸的过量或缺乏导致许多生理失衡，该生理失衡有助于许多所谓的“生活方式”疾病（心血管疾病、糖尿病、肥胖等）的发生。

目前所有的营养指南都推荐：

a、增加油酸（C18:1n-9）的摄取，

b、增加α亚麻酸（C18:3n-3）、EPA（C20:5n-3）和DHA（C22:6n-3）形式的ω-3的摄取，

c、限制棕榈酸（C16:0）的摄取，

d、限制亚油酸（C18:2n-6）的摄取，

e、降低C18:2n-6/C18:3n-3的比例。

过去十年间已经有许多研究力图优化人类摄取食品中脂肪酸的营养组成以通过以下这些建议促进健康。因此，动物生产模式和它们脂质的脂肪酸中的组成已经超越目标并且确定脂肪酸含量的方法已经被开发。

动物的饮食在确定它们产品的脂肪酸含量中起重要作用（大于遗传学和其它饲养因素）。

因此，为了改善肉、奶或蛋的脂肪酸图谱（profil），必须仔细挑选构成饮食的原材料。在单胃动物中，肉的脂质图谱是其饮食的直接反映。

在反刍动物中，该关联依然存在，但是经瘤胃的生物氢化功能而变得模糊，其使得关联性变得复杂并且取决于瘤胃中消化的相互作用。

知道人类摄取产品的脂肪酸组成除了对人类健康是有用的，考虑构成动物的生物材料的脂肪酸组成对于特征化这些动物的健康状况也是非常有用的。

事实上，通过确认已知量的某种脂肪酸或脂肪酸的比例，非常有可能诊断饮食的营养失衡，并因此诊断发生在中期和长期的代谢疾病。

因此，C18:2n-6和C18:3n-3脂肪酸只能是外源的（即饮食的），因为没有动物能够合成它们。这些重要的脂肪酸也被称为基本脂肪酸，因为它们对于平衡内分泌系统、免疫系统、炎症系统等是重要载体，并且它们的氧化衍生物通常是拮抗剂，这使得营养学家们推荐C18:2n-6/C18:3n-3比例以更好的平衡生物体（无论是人类还是动物）的主要代谢功能。

这就是为什么（例如）通过分析活体动物的血液、皮肤、皮毛或任何其它生物组织可用于检验活体动物中该比例的平衡（其不可避免地与饮食中该比例的平衡相关联），但是反过来通常不知道饮食中该比例的平衡。

这对于专有外源性的脂肪酸是事实，但是也可能对于内源性（或混合来源）的脂肪酸是事实，因为它们的合成受到饮食各种平衡的调节：卡路里摄入量（以糖、淀粉、脂质或复合碳水化合物的形式）、蛋白质、纤维矿物质、维生素。

饮食的卡路里含量将决定脂肪组织脂肪酸的合成和脂解作用，因此可以修改该组织的脂肪酸图谱。

与含有大约20种主要的不同脂肪酸的植物油不同，动物脂肪，尤其是反刍动物的脂肪由相当大量的不同脂肪酸构成。

已知有将近400种不同脂肪酸。根据许多参数：种类、个异性、季节、年龄和尤其是饮食，这些酸的相对比例变化极大。

典型地，将脂肪酸分组为通过以下脂肪酸的例子阐明的家族：

a、短链饱和脂肪酸（C4:0、C6:0、C8:0、C10:0）；

b、中链饱和脂肪酸：月桂酸（C12:0）和肉豆蔻酸（C14:0）；

c、长链饱和脂肪酸：棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）；

d、顺式或反式单不饱和酸：油酸（C18:1顺式9）、十八碳烯酸（C18:1反式11）；

e、共轭脂肪酸：瘤胃酸（C18:2顺式9反式:11）；

f、奇数支链脂肪酸；

g、ω3家族多不饱和脂肪酸：α亚麻酸（C18:3n-3）、十二碳五烯酸（C20:5n-3）、二十二碳六烯酸（C22:6n-3）；

h、ω6家族多不饱和脂肪酸：亚油酸（C18:2n-6）、花生四烯酸（C20:4n-6）。

一方面，动物产品的脂肪酸组成中的大的种类和宽的分布，和另一方面，来自于肉类或肉制品的动物脂肪摄取的定量重要性，使得评估为肉类生产而饲养的动物产品脂质的营养质量是非常重要的。

因此，畜牧生产者希望改善脂质和肉类和肉制品的营养质量。农场自身正在寻求诊断分布于动物的饮食脂肪的平衡的工具以通过动物更好的表现和更好的健康状况优化他们产品的经济盈利性。

考虑到生产者和消费者的双重热爱，能够迅速、可靠和可负担地评估死亡动物中的肉类和肉制品的脂质组成，以及评估可以从活体动物得到（通过直接分析或取样）的生物材料，对于预测肉类和肉制品中获得的脂肪酸图谱是非常有用的。事实上，对于给定的饮食，通过在屠宰动物之前的几小时、几天或几个月提早得知血液、皮肤和皮毛的组成，能够预测肉类和肉制品的脂质质量（在饮食是随时间稳定的情况下）。因此，例如，如果通过皮毛分析肉类中诊断的ω3的量不足以符合根据规范的定性目标，那么可以考虑改变动物的饮食的建议以达到所期望的目的。

发明内容

因此，本发明涉及一种从数据库确定来自于为肉类生产而饲养的同一动物的各种生物材料中含有的至少一些脂肪酸的量的方法，在所述库里脂肪酸组成或脂肪酸图谱已经被预先确定，对于来自于同一类型动物的参考材料，通过气相色谱法被确定，然后测量和记录相应的红外吸收光谱或相应的拉曼散射，所述方法包含下述步骤：

a/通过数学模型确定该参考材料样品的校准公式，所述校准公式对应于通过光谱法的脂肪酸或脂肪酸总和的确定；

b/鉴于其使用待分析的新样品，验证前述步骤的所述校准公式的使用，因为，对于一系列所谓的与生物参考材料相同性质的“验证”样品，通过气相色谱法和光谱学获得的被考虑的脂肪酸含量或脂肪酸总和之间的相关系数r²至少等于0.7；

c/使与参考材料相同性质的待分析的新样品经受光辐射以获得吸收光谱，并使用前述经验证的校准公式以推导出图谱，即，所谓的“主要”脂肪酸含量，即那些相关系数r²至少等于0.7的脂肪酸，

所述方法特征在于还包括至少一个下述步骤：

d/利用统计学预测方程，从如前述步骤中确定的“主要”图谱，确定图谱，即，所谓的“次要”脂肪酸含量，即那些相关系数r²小于0.7的脂肪酸，所述统计学预测方程或者具有相关系数r²，该相关系数r²至少大于通过光谱学测定的所谓的“次要”脂肪酸的值与通过气相色谱法获得的值之间所确定的相关系数r²，所述统计学预测方程或者具有用气相色谱法获得的至少等于0.7的相关系数；

e/利用具有用气相色谱法获得的至少等于0.7的相关系数的统计学预测方程，从步骤c/和/或d/获得的图谱，确定来自于同一动物的至少另一种材料的脂肪酸含量。

优选地，在步骤b/、c/、d/和e/中，r²至少等于0.8，优选至少等于0.9。

此外，根据其它有利的、非限定性的特征：

-所述生物材料是流体；

-所述生物材料是血液；

-所述生物材料是固体；

-所述生物材料选自皮毛、鳞、羽毛、皮肤、脂肪、肉或内脏；

-所述动物选自牛、羊、家禽、猪、兔子和鱼。

具体实施方式

通过阅读以下的说明，本发明其它的优点和特征将变得清晰。

I-确定脂质、肉类和肉制品的脂肪酸组成的模型

a、简介

目前，通过参考方法：气相色谱法（CPG）确定脂质产品的脂肪酸图谱。由于流动气相和固定相之间的平衡，其用于分离气态混合物。按照时间顺序地，所述方法依赖于：

1、提取脂肪的步骤，

2、脂肪酸甲酯的制备，

3、通过气相色谱法分析这些脂肪酸甲酯。

然而，该方法是缓慢（一至三周，取决于实验室）和昂贵的（每次分析大约100欧元至200欧元）。对于那些希望增加他们的研究和产品开发或希望对于获得的肉类进行质量监控或平衡饮食的畜牧生产者来说，这是一个相当大的障碍。

因此，在可靠性但是更快、更廉价方面，我们考虑到一种等价的令人感兴趣的方法：通过红外光谱或拉曼光谱分析，与预测方程相匹配。

提出的方法由3个步骤组成：

前两个步骤由迅速、可靠地和尽可能完整地获得来自于同一动物的给定组织的脂肪酸图谱构成。

第三步允许迅速、可靠地和尽可能完整地，并且可能在不同的时间（只要饮食没有改变）获得来自于同一动物的许多组织的脂肪酸图谱。

b、方法的描述

步骤1：部分确定脂质组成（从大量存在的主要脂肪酸）

-从饲养动物的一种或多种瘠瘦组织（肉类）或脂肪（覆盖脂肪、肌间脂肪），然后屠杀用于肉类生产（猪、牛、羊、家禽、鱼等）

-从生长或养肥的动物的一种或多种组织（皮肤、皮毛等）或生物材料（血液、尿液、粪便、乳汁等）。

通过迅速的和可能无入侵的红外或拉曼光谱方法，从市售可得的测量设备或者甚至是某些对于每个专门应用创造的设备而确定，所述每个专门应用对于增加的实用性、稳健性、成本、响应性等可能是必须进行的（例如，在猪、牛、家禽等的屠宰线上，或在它们的表皮上）。

在创建了一个大的和典型的样品数据库后（其中，一方面，通过参考方法（CPG）已经确定了脂肪酸图谱的组成，另一方面，从适当的（但是改进的）测量设备已经获得了光吸收光谱），通过参考方法获得被考虑的每一个脂肪酸的红外或拉曼校准。

每一个校准特征在于一定程度的可靠性。大量存在的脂肪酸或脂肪酸家族（例如饱和脂肪酸）越多（主要脂肪酸，例如棕榈酸、油酸、硬脂酸等），该可靠性越高。

反过来，为了通过光谱学快速和可靠地获得小量的脂肪酸（所谓的次要脂肪酸，例如α亚麻酸、ω3），为了获得完全的脂肪酸图谱，第二个步骤是必要的。

步骤2：通过数学预测方程确定次要脂肪酸

来自于同一组织的脂肪酸有时彼此具有很好的相关性。

因此，从通过红外或拉曼光谱学获得的主要脂肪酸，能够通过预测方程（线性的或其它的）计算小量的所谓的次要脂肪酸的量。由于通过计算评估的第二个方法比第一个方法提供更好的结果可靠性，因此其是值得使用的。

通过与非脂肪酸的成分（水、脂肪、蛋白质、胶原、盐等）相符合的数学预测方程还可以获得不能够通过红外或拉曼光谱直接充分预测的脂肪酸的另外的评估，因为紧密的相关性将提供可靠的预测方程。

考虑到同一动物中组织组成的数量和可变性，可以考虑第三个步骤以快速的、可能在不同的时间（如果动物的饮食保持稳定）获得不同组织的脂肪酸组成。

步骤3：从来自于同一动物或同一批次的动物的至少一种组织的脂肪酸图谱（根据步骤1和/或2）的知识，确定同一动物，或同一同质生产批次的数个动物的不同组织的脂肪酸组成。

事实上，通过建立允许可靠预测的不同组织间脂肪酸组成的强的关联性，使得知道组织的脂肪酸含量成为可能（例如：通过知道在另一组织（覆盖脂肪）中的相同脂肪酸得知瘦肌肉的脂肪酸含量）。

同样地，对于从一个动物到另一个动物（在同一农场饲养并且接受相同的饮食直至相同的年龄的动物）的脂肪酸组成有轻微改变的非常同质的和标准化的产品，可以从同一批次的一个动物的组织的相同脂肪酸的含量预测另一个动物的一个组织的脂肪酸含量。

最后，还可以从在动物接受稳定饮食的时间起在时间t-h（以小时计）、t-d（以天计）、或t-w（以周计）处，在另一个组织中（例如：血液）的组成的知识，预测在时间t处（例如：屠宰时）给定脂肪酸中组织（例如：肉类）的成分。

因此，通过使用用于确定产品的脂肪酸的迅速的测试方法，与脂肪酸之间（或者甚至是从非脂肪酸的成分，但该成分能通过光谱学很好的预测并且与被考虑的脂肪酸有很好的相关性）的预测方程的应用相结合，或者与给定时间的各部分（覆盖脂肪、肌内脂肪、各种肌肉）之间或不同时间的各部分（血液、毛发、皮肤）之间的预测方程的应用相结合，或者与同质生产批次的动物之间的预测方程的应用相结合，或者最后与烹饪过程或者其它过程开始和结束之间的预测方程的应用相结合，能够：

-容易地得到重要的营养学信息，如饱和的、单不饱和的、多不饱和的棕榈酸（C16:0）、油酸（C18:1n-9）、亚油酸（C18:2n-6）的水平，每一个待考虑的食品的α-亚麻酸（C18:3n-3）、共轭亚油酸（CLA）等，-根据它们脂肪酸中的营养质量建立产品（奶、黄油、奶酪、肉类、火腿、熟食、蛋等）的支付系统，并因此促进优质产品的销售，

-快速和有效地检查来自于肉类生产而饲养的动物的产品，并因此促进在生产者、包装者、处理者和经销商之间具有履行义务和分析控制计划的产品规格的创建

-通过可能增加用于质量改进的因素的研究，来加速获取知识的进程，

-强化高营养质量的产品的促销渠道的创建，

-改善动物饮食平衡，动物健康状况和动物生产体系的经济盈利性。

II-实施例

步骤1：通过光谱学部分确定脂肪酸图谱（红外实施例）

该步骤旨在通过红外测量确定以可靠的和稳健的方式可预测的脂肪酸。该步骤需要开发通过CPG测量的所有脂肪酸的校准。然后将选择通过脂肪酸的最好的校准，并且将通过红外测量可靠地、可预测地限定脂肪酸列表。

该例证依赖于通过设备在猪肋骨上获得的数据，其具有以下特征：

-使用的光谱获得模式为传递（穿过样品的红外光谱）。

-使用的光谱范围从780延伸至2500nm。

在该例证中，使用“Unscrambler”软件开发用于确定校准的数学模型。

以下描述的方法学可以被扩展到被考虑的所有组织和光谱设备。

a)红外光谱的获得和参考分析（脂肪酸图谱）

在猪肋骨的70个研磨样品上获得光谱测量，所述猪接受具有不同含量C18:3n-3的饮食。

在这些测量的同时，通过气相色谱法（参考方法）确定用于获得光谱图谱的这些相同组织样品的脂肪酸图谱。

b)数据库的构建

对于每一个样品采集每一个点的值（由其IR光谱和其脂肪酸图谱构成）创建数据库，如下所阐明。

数据库的结构允许通过IR获得的光谱图谱和通过CPG获得的脂肪酸图谱之间的关系的统计学研究。

c)校准的构建

从该数据库，使用不同的统计学方法以确认从红外光谱可靠地和精确地可预测的脂肪酸。

在该例证中，通过MSC（多元散射校正）方法标准化光谱的采集。这种转化限制彼此的光谱的分散。可以使用其它红外信号的数学预处理。预处理的选择（一阶导数，二阶导数、MSC等）可以明显地影响校准质量。因此，有必要通过专用软件选择最优的数学预处理。

对于IR光谱的每一个点，通过偏最小二乘回归法（PLS1）计算每一种脂肪酸的回归系数。

将IR光谱的每一个点乘以相应的回归系数。然后这些乘积的总和对应于依据红外光谱考虑的预测的脂肪酸值。

d)内部验证

通过交叉验证法评估该模型。

在该方法中，将用于校准的样品数据集分为n个子集。用n-1个子集完成校准，最后一个子集作为用于验证的数据集。有多少个子集就重复该方法多少次。该方法验证所述模型并测试其预测能力。

e)校准质量的评估

从回归相关系数（R²）和均方预测误差（RMSEP）评估预测质量。

下表1总结了对于评估预测模型质量所必需的质量标准。因此，其能够可靠地限定存在于下表中的所有脂肪酸。在该研究阶段，只有n-6/n-3比例似乎可能难于预测。然而，可以创建更大的，具有很好的生产模式代表性的数据库以证实这些可靠性水平。

f)外部验证

然后，通过使用没有被用于开发校准的样品测试稳健性，即之前确定的方程（或预测模型）的有效性。关键是确定在这些样品上通过模型预测的值和被考虑和通过CPG测定的脂肪酸的实际值之间的差异。偏差越小，模型就越稳健。可以仅用校准完成该步骤，该校准已经从充分提供的本领域实践的代表性数据库被开发。

g)结论：

根据第一步骤，从一种类型的组织或肉类的样品的红外测量，能够列出可以被可靠地、精确地和稳健地定量的脂肪酸。

在猪肋骨的情况下，通过样品的红外光谱的获得（即，对于该样品相关系数在0.7以上，优选0.8）脂肪酸可以被列为可以测量的，其为：饱和的和单不饱和脂肪酸（C16:0）的总和，ω6和ω3脂肪酸（C18:2n-6和C18:3n-3）的总和。

该列表是不详尽的并且可以随着新的数据的增加而逐渐被改变（通过增加或减少脂肪酸），这可以扩展数据库以获得更好的被考虑的生产的代表。

对于其它不能通过红外预测的脂肪酸，即其中相关系数没有超过0.7或优选0.8的脂肪酸，可以从与之前通过红外确定的脂肪酸的相关性和预测性的统计学研究确定它们的含量。

步骤2：在相同组织中通过数学预测方程确定次要脂肪酸

从用于创建光谱学校准的数据库和/或理想地代表被考虑的生产的数据库，该步骤强调统计相关性并且通过可以通过光谱学测量的它们的脂肪酸含量建立不能够通过光谱学测量的脂肪酸的预测方程。

表2至5中呈现的结果是在猪肋骨上获得的。表2和3分别显示以总脂肪酸的%表示的脂肪酸之间的相关性和预测性，表4和5分别显示以mg/100g组织表示的脂肪酸之间的相关性和预测性。

例如：

如果光谱法允许确定AGMI而不是C18:1n-9，那么，如果AGMI和C18:1n-9之间的相关性是非常显著的（概率P<0.001），则能够通过预测方程确定C18:1n-9。

如果脂肪酸的测定以总脂肪酸的%表示，那么从表2得到的方程为：

C18:1n-9=1.02*AGMI-5.64

更精巧地，还能够通过多元方程预测脂肪酸。例如，完全可能通过以下方程：AGPI LC n-3=AGPI n-3-C18:3n-3来确定长链ω3脂肪酸（AGPI LC n-3），即那些碳原子数大于18的脂肪酸的总和：

表6至9中呈现的结果是在牛肌肉上获得的。表6和7分别显示以总脂肪酸的%表示的脂肪酸之间的相关性和预测性，表8和9分别显示以mg/100g产品表示的脂肪酸之间的相关性和预测性。

其它表格也可以由其它组织以及其它种类的动物构成。

此外，如果光谱法允许确定一些给定组织的脂肪酸（或脂肪酸家族），但是不允许确定在相同动物的其它组织中的这些相同的脂肪酸（例如，其含有较少的绝对值），则所述方法提供第三步骤。

步骤3：从单一组织的脂肪酸图谱预测不同组织的脂肪酸含量

如前，在该步骤，使用从步骤1或步骤2得到方程是个问题，该方程起因于最好相关性用于从给定的脂肪酸在另一组织中的含量确定一种或多种组织的该给定脂肪酸（或脂肪酸家族）。

通过使用由来自于相同动物的不同组织的脂肪酸图谱（通过CPG确定）构成的数据库，创建每一种脂肪酸的组织之间的相关性。

表10和11呈现的结果是在分别来自于猪和牛的不同组织的C18:3n-3上获得的。

例如，在步骤1的最后：

如果在猪背脂上通过光谱学确定C18:3n-3，那么可以通过以下方程：%C18:3SM=0.49x%C18:3背脂+0.11来确定猪半膜肌（SM）C18:3。

如果在小牛的背最长肌上通过光谱学确定C16:0，那么可以通过以下方程：%C16:0侧腹横肌牛排=4.59+0.82x%C16背最长肌来确定侧腹横肌牛排的C16:0。

通过可能加入时间的概念：

如果在第J天在猪血浆上通过光谱学确定C18:3n-3，那么可以通过以下方程：%C18:3猪肋骨=0.58x%C18:3血浆+0.36来确定屠杀时（J+30）猪肋骨的C18:3，条件是饮食没有改变。

例如，在步骤2的最后：

如果通过光谱学以总AG的%计来确定小牛的背最长肌的C16:0，那么可以：

a、通过以下方程：C18:3背最长肌=3.25–0.1x C16:0背最长肌来确定背最长肌的C18:3n-3。

b、通过以下方程：C18:3侧腹横肌牛排=0.22+0.62x C18:3背最长肌来确定侧腹横肌牛排的C18:3n-3。

通过提出的方法，当可靠的预测方程补充在动物（死亡的（覆盖脂肪、内部脂肪、肌内脂肪等）或活的（血液、皮肤、皮毛等））的至少一种组织上进行的光谱学分析时，并且通过方程预测的该组织的脂肪酸较光谱学更加精确时，能够快速地知道任何动物种类的脂肪和肉类以及任何肉制品的营养质量。

表11：牛中组织之间相关性和预测性的实例。对于以总脂肪酸的%和以mg/100g表示的α-亚麻酸（C18:3n-3，ALA）获得的数据。在0.001%阈值所有相关性是显著的。

表12：牛中组织之间相关性和预测性的实例。对于以总脂肪酸的%和以mg/100g表示的棕榈酸（C16:0）获得的数据。在0.001%阈值所有相关性是显著的。