从马蔺子种皮中分离马蔺子甲素和马蔺子乙素的方法

摘要

本发明公开了一种从马蔺子种皮中分离马蔺子甲素和乙素的方法。该方法，包括如下步骤：1)将马蔺子种皮粉碎后与萃取剂混合进行亚临界流体萃取，得到萃取物；2)将步骤1)所得萃取物进行减压蒸发，收集萃取液；3)将步骤2)所得萃取液溶于石油醚后上样于硅胶柱进行洗脱，收集洗脱液，得到马蔺子素粗品；4)将马蔺子素粗品经高速逆流色谱分离，两相溶剂系统由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水组成，收集相应流分，浓缩，冷冻结晶，得马蔺子甲素和乙素。本发明使用亚临界流体萃取技术和高速逆流色谱分离技术，具有萃取效率高、分离时间短、溶剂消耗少、化合物纯度高、生产成本低等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从马蔺子种皮中分离马蔺子甲素和马蔺子乙素的方法。

背景技术

马蔺(Iris lactea Pall.var.chinensis(Fisch.)Koidz.)，亦称马莲、马兰、蓝紫草、 兰花草等，是鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属(Iris L.)多年生草本宿根植物。马蔺自然分 布于我国东北、华北、西北等地，以草原区分布较为普遍。马蔺子味甘，性平，凉血 止血，清热利湿。近代民间有用作口服避孕药和治疗功能性子宫出血、黄疸型肝炎及 宫颈癌等疾病。现代药理学研究表明，马蔺子有明显抑癌作用，主要活性成分为种皮 中的马蔺子素，马蔺子素现已经开发为肿瘤放射增敏剂(吴寿金，杨企铮.马蔺子化学 成分的研究[J].化学学报，1980，38(2):156-161.吴寿金，张丽，杨秀肾，等.马蔺子化 学成分的研究Ⅱ.马蔺子乙素和马蔺子丙素的分离及其化学结构的研究[J].化学学报， 1981，39(8):767-770.张永生.马蔺子的生态生物性特征与生药鉴定[J].中国药事， 1986，17(1):28-30.)。药效学实验证明，马蔺子素对人宫颈癌Hela细胞、CHO细胞、 鼻咽癌和头颈肿瘤原发灶等，在乏氧条件下均有显著的放射增敏作用(李德华.一种 新型肿瘤放射增敏药“安卡”(马蔺子素)[J].中国肿瘤临床，1996，26(2):153-154.王燕， 王乐，姚默，等.马蔺药学研究概况[J].宁夏农林科技，2012，53(07):69-70.张力，毛达 志，张恩罴，等.马蔺子素胶囊放射增敏的临床研究[J].癌症，1999，18(1):52-55.李德 华，郝小阁，张淑坤，等.马蔺子甲素的抗癌作用[J].中国药理学报，1981，2(2): 131-132.蔡蓝，符立梧，潘启超.马蔺子甲素诱导鼻咽癌细胞凋亡的研究[J].广东药 学，2000，10(1):6-7.李德华，郝小阁，张淑坤，等.马蔺子甲素的抗癌作用和毒性[J]. 中国药理学报，1981，2(2):131-133.)。

亚临界萃取是利用亚临界流体作为萃取剂，在密闭、无氧、低压的容器内，依据 有机物相似相溶原理，通过萃取物料与萃取剂在浸泡过程中的分子扩散过程，达到固 体物料中的成分完全转移到液态的萃取剂中，再通过减压蒸发的过程将萃取剂与目的 产物分离，最终得到目的产物的一种新型萃取与分离技术。亚临界流体萃取相比于其 他分离方法，具有无毒、无害、环保等优点，可以保留提取物的生物活性，而且产能 大、可工业化大规模生产，节能、运行成本低。

高速逆流色谱是一种基于液-液多级逆流萃取建立的色谱体系，不使用固相载体作 为固定相，而是使用液相载体作为固定相，利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力， 使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相为固定相，利用恒流泵连续泵入流 动相，随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的大小被依次洗 脱。高速逆流色谱克服了使用固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等不 足，适用于天然产物的分离。

目前马蔺子素的提取方法主要是有机溶剂提取，比如用石油醚、乙醚、乙酸乙酯 等作为提取溶剂，加热回流提取。马蔺子素的分离纯化主要是通过柱色谱实现。但是 通过亚临界萃取结合高速逆流色谱快速分离制备马蔺子甲素和乙素的还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从马蔺子种皮中分离马蔺子甲素和乙素的方法。

本发明提供的从马蔺子种皮中分离马蔺子甲素和马蔺子乙素的方法，包括如下步 骤：

1)将马蔺子种皮粉碎后与萃取剂混合进行亚临界流体萃取，得到萃取物；

2)将步骤1)所得萃取物进行减压蒸发，收集萃取液；

3)将步骤2)所得萃取液溶于石油醚后上样于硅胶柱进行洗脱，收集洗脱液，得 到马蔺子素粗品；

4)用高速逆流色谱法对步骤3)所得马蔺子素粗品进行分离，依次得到流分I和 II；

其中，所述流分I中含有马蔺子甲素；所述流分II中含有马蔺子乙素；

所述高速逆流色谱法中的固定相和流动相按照如下方法制备：将正己烷、乙酸乙 酯、甲醇和水混匀后静置分层，分别收集上层溶剂和下层溶剂，分别进行超声，以上 层溶剂为固定相，下层溶剂为流动相；

所述正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为8～10∶4～6∶4～8∶1～3；具体 为9∶5∶6∶2、9∶6∶6∶1、8∶6∶4∶1、8-9∶5-6∶4-6∶1-2；

所述上样溶液为将步骤3)所得马蔺子素粗品溶于所述流动相而得。

上述方法的步骤1)粉碎步骤中，粉碎后的目数为40-60目，具体为40目；

在粉碎步骤之前，可先将马蔺子用纯水清洗、阴干再脱皮；

所述萃取剂选自正丙烷、正丁烷、异丁烷、二甲醚和1，1，1，2-四氟乙烷中的至少一 种；

粉碎后的所述马蔺子种皮与萃取剂的用量比为1g∶10-20mL，具体为1g∶15mL；

所述步骤1)萃取步骤中，萃取的次数为1-3次，具体为2次；每次萃取的时间 均为30-90min，具体为40-60min；

温度为15-35℃，具体为20℃；

压力为1.0-1.5MPa；

萃取剂的流量为100-200L/h，具体为150L/h。

所述步骤2)减压蒸发步骤中，分离压力为0.5～1.5MPa，具体为1.0MPa；

分离温度为20～45℃，具体为25-30℃。

所述步骤3)洗脱步骤中，洗脱剂为由石油醚和乙酸乙酯组成的混合液；

所用硅胶柱中，硅胶的目数为200-300目；

所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为5∶1-3，具体为5∶1.5-2；

洗脱速度为20-30ml/min，具体为25ml/min；

洗脱温度为20-25℃，具体为25℃；

洗脱剂的用量为所用硅胶柱体积的2-4倍，具体为3倍；

所述硅胶柱的直径为6-8cm，具体为6cm；高为100-120cm，具体为120cm。

所述步骤4)分离步骤包括：向高速逆流色谱仪的分离管中泵入所述固定相，保 持分离管温度为25～35℃，以850～900rpm的转速正转30-50min后泵入所述流动相， 待体系平衡后，泵入所述上样溶液。

所述步骤4)中，上样溶液的流速为1.5-3mL/min，具体为2mL/min；

所述马蔺子素粗品与流动相的用量比为100-300mg∶10mL，具体为150mg∶10mL；

所述分离步骤中，检测波长为270nm。

流分I和流分II的出峰时间依次为90-140min和160-200min。

上述马蔺子甲素和马蔺子乙素的结构依次如下所示：

本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明通过使用亚临界流体技术，有效降 低了生产成本，缩短了提取分离时间，减少了工艺过程中溶剂消的耗量及能耗，萃取 效率高，环保，无污染，不破坏马蔺子素的结构和活性；高速逆流色谱具有进样量大、 分离能力强、分离时间短、溶剂消耗少、无可逆吸附等优点。综上，两种技术的联用 可实现大规模、工业化、连续性制备高纯度的马蔺子甲素和乙素。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所 述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而 得。

下述实施例所用仪器与试剂均如下所示：

TBE-300B高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司)；HBP5002泵(上海同 田生物技术有限公司)；DC-0506低温恒温槽(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)； TBD-2000检测器(上海同田生物技术有限公司)；N2000色谱数据工作站(智达信息 工程有限公司)；Agilent1260高效液相色谱仪(安捷伦公司)；YU50-1.5型亚临界萃 取装置(甘肃省轻工科学研究院，萃取釜溶剂50L，设定最高压力为1.5MPa)；RE52-98 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

所有应用于亚临界萃取、柱色谱及高速逆流色谱的有机溶剂均为分析纯。

应用于HPLC的有机溶剂为色谱纯。

下述实施例中，检测马蔺子甲素和乙素纯度所用方法为利用HPLC通过面积归一 化法得到，计算公式为：目标化合物纯度％＝目标化合物峰面积/总峰面积*100％

实施例1、

1)将挑选除杂质后的马蔺子用纯水清洗、阴干、脱皮，粉碎至40目，得到马蔺 子种皮原料；

将所得马蔺子种皮原料与萃取剂异丁烷按照1g∶15mL的比例投入到亚临界流体 萃取装置的萃取釜中，在萃取温度15℃、萃取压力1.5MPa、萃取流量为150L/h的条 件下，萃取2次，每次萃取时间均为60min，得到萃取物；

2)将步骤1)所得萃取物进行减压蒸发，在分离压力为1.0MPa、分离温度为30℃ 的条件下将萃取剂和萃取液分离，得到萃取液。

3)将步骤2)所得萃取液溶于石油醚后上样于硅胶柱(硅胶的目数为200-300目)， 用由体积比为5∶2的石油醚和乙酸乙酯组成的混合液进行洗脱，洗脱3个柱体积，洗 脱速度为25ml/min，该硅胶柱的直径为6cm，高为120cm，浓缩，浓缩液放置冷冻 结晶，得到马蔺子素粗品；

4)将由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水组成的两相溶剂系统混匀后静置分层，分 别收集上相溶剂和下相溶剂，以上相为固定相，下相为流动相，向高速逆流色谱仪的 分离管中泵入所述固定相，保持分离管温度为30℃，以850rpm的转速正转30min后 泵入流动相，待体系平衡后，以2ml/min的流速泵入上样溶液进行高速逆流色谱分离， 检测波长为270nm，依次得到流分I和II，流分I和流分II的出峰时间依次为90-140 min和160-200min；对各流分浓缩，浓缩液放置冷冻结晶；其中，流分I中含有马蔺 子甲素；流分II中含有马蔺子乙素；

两相溶剂体系中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为9∶5∶6∶2；

上样溶液为将步骤3)所得马蔺子素粗品150mg溶于10mL流动相而得。

上述流分I和流分II产物的结构确认结果如下所示：

流分I

IR(KBr)σ:2922，2852，1677，1651，1626，1597，1470，1328，1231，1179cm^-1。

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ(ppm):6.48(1H，d，J＝2.1Hz，H-5)，5.87(1H，d，J＝2.4 Hz，H-3)，5.36(2H，m，H-10′，H-11′)，3.81(3H，s，OCH₃)，2.42(2H，dt，J＝1.1，8.1Hz， H-1′)，2.00(4H，m，H-9′，H-12′)，1.50(2H，m)，1.27(20H，brs)，0.88(3H，m，H-17′);¹³C-NMR(400MHz，CD₃OD)δ(ppm):187.8，147.7，133.0，182.3，107.2，159.0;130.1， 130.0，56.4(OCH₃)，31.9，29.1～29.9，28.9，27.9，27.4，22.8，14.3(CH₃)。

流分II

IR(KBr)σ:2917，2851，1687，1656，1598，1470，1327，1233，1178cm^-1。

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ(ppm):6.47(1H，d，J＝1.3Hz，H-5)，5.87(1H，d，J＝2.3 Hz，H-3)，3.81(3H，s，OCH₃)，2.42(2H，dt，J＝1.1，8.1Hz，H-1′)，1.50(2H，m)，1.29 (24H，brs)，0.88(3H，m，H-15′);¹³C-NMR(400MHz，CD₃OD)δ(ppm):187.7，182.1， 158.8，147.6，132.9，107.1，56.3(OCH₃)，31.9，29.2～29.7，28.7，27.9，27.7，22.7，14.1。

由上可知，所得流分I为马蔺子甲素；所得流分II为马蔺子乙素。

经HPLC检测，马蔺子甲素的纯度达到98.87％，马蔺子乙素的纯度达到95.66％。

实施例2

按照实施例1的步骤，仅将反应条件作如下替换：

将步骤1)中的萃取剂替换为1，1，1，2-四氟乙烷，料液比替换为1g∶10mL，萃取 温度替换为20℃，萃取流量替换为100L/h，每次萃取时间均替换为30min；

将步骤2)中的分离压力替换为1.5MPa；

将步骤3)中石油醚和乙酸乙酯的体积比替换为10∶3。

将步骤4)中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为9∶6∶6∶1；

该实施例所得流分I为马蔺子甲素；所得流分II为马蔺子乙素。

经HPLC检测，马蔺子甲素的纯度达到98.87％，马蔺子乙素的纯度达到95.66％。

实施例3

按照实施例1的步骤，仅将反应条件作如下替换：

将步骤1)中的萃取剂替换为二甲醚，萃取压力替换为1.0MPa，每次萃取时间均 替换为40min；

将步骤2)中的分离压力替换为1.5MPa，分离温度替换为25℃；

将步骤3)中石油醚和乙酸乙酯的体积比替换为10∶3；

将步骤4)中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为8∶6∶4∶1；

该实施例所得流分I为马蔺子甲素；所得流分II为马蔺子乙素。

经HPLC检测，马蔺子甲素的纯度达到98.87％，马蔺子乙素的纯度达到95.66％。