一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的SCAR引物及其方法

摘要

本发明公开了一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的SCAR引物及其方法，提取混淆品植物的基因组DNA，将样品的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，其SCAR-PCR扩增体系为：25μL体系中含有Mg

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的方法。

背景技术

金龙胆草为菊科白酒草属植物苦蒿ConyzabliniiLévl.的干燥地上部分，分布于云南 中、南部，四川攀西地区及贵州部分地区。系70年代四川省发掘的民间草药，具有清 热化痰，止咳平喘，解毒利湿，凉血止血的功效，近年来的研究更报道其具有一定的抗 肿瘤活性，应用前景广阔。

金龙胆草的民间俗称为“苦蒿”，但名为“苦蒿”的植物却不止一种，且部分植物 在形态与化学成分上与金龙胆草相近，使得收购药材时很难识别混淆品，影响金龙胆草 的品质。中草药传统的鉴定方法主要是性状或组织显微鉴别，以及有效成分含量的指纹 图谱区分道地产品，这些方法各有优缺点或局限性，且需时较长。随着分子遗传标记技 术的发展，利用分子手段进行药用植物的遗传分析，可以使鉴别过程不受样品形态、外 部条件变化、发育时期、次生代谢物含量等因素的影响，更客观、可靠得提供准确鉴别。

RAPD技术是建立在PCR基础之上的一种DNA分子标记之一，可通过多个不同的 随机引物给出覆盖整个基因组的多态性信息。因其具有快速、简便、高效、周期短等特 点，近年来，在遗传育种及遗传多样性等方面都得到了广泛的运用，尤其在寻找不同样 品间DNA的差异上被广泛应用。SCAR分子标记，即序列特异扩增区域标记，是以RAPD 技术为基础的一种新型分子标记，在对RAPD特异扩增条带测序的基础上，设计一对特 异引物，并利用此引物对基因组DNA进行PCR扩增，以检测样品是否为混淆品。此方法 简单，稳定，重复性好，且带型简单，可直观利用“有或无”条带观测实验结果，因此， SCAR标记已逐渐成为分子遗传育种、植物品系鉴定的首选技术。

传统鉴定技术主要以性状或显微、化学鉴别为主，存在一定的局限性，无法准确 区分化学成分相近，外观形态相似的金龙胆草及其混淆品。金龙胆草在外形上与白酒草 属植物白酒草，蒿属植物艾草相似，同时由于民间俗名均为“苦蒿”，也易与青蒿混淆。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用SCAR技术鉴别金 龙胆草及其混淆品的方法。

本发明的技术方案如下：

一种利用SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的SCAR引物，所述SCAR引物包括引 物SC1和引物SC2，引物SC1和引物SC2序列如序列表SEQIDNO：3和SEQIDNO： 4所示。

所述SCAR引物鉴别金龙胆草及其混淆品的方法，包括以下步骤：提取混淆品植物 的基因组DNA，将样品的基因组DNA进行SCAR-PCR扩增，其SCAR-PCR扩增体系为： 25μL体系中含有Mg²⁺2.5mmol/L，dNTPs4.5mmol/L，引物SC1、引物SC2各1.5μ mol/L，DNA模板60ng，Taq酶1.5U；扩增程序为：94℃预变性4min，然后进行40 个循环：94℃变性1min、36℃复性1min、72℃延伸2min，循环结束后72℃延伸 10min，4℃保存；扩增结果有目的条带的即为金龙胆草真品。

本发明针对金龙胆草DNA序列的特异性，建立了金龙胆草基因组DNA的RAPD指纹 图谱，成功获得一个特异SCAR标记，应用这个标记，可以根据凝结电泳判定样品是否 为混淆品，方法更为客观易行，时间短、准确性高，重复性好。

附图说明

图1：18个金龙胆草样品的基因组DNA凝胶电泳图；

图2：H37的RAPD特异扩增图谱；

图3：SCAR转化后的金龙胆草特异扩增图谱；

图4：左起为marker，1-3分别为白酒草、青蒿和艾草的RAPD扩增谱图

图5：左起为marker，1-4分别为白酒草、青蒿、艾草和金龙胆草的SCAR扩增 谱图

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

本发明涉及到的SCAR技术鉴别金龙胆草及其混淆品的方法，具体包括以下步骤：

1、采用改良的SDS法提取18个不同地区采集的金龙胆草基因组DNA（图1），方法 为取约0.15g新鲜叶片（干样取三分之一重）置于研钵中以液氮快速研磨为粉末，将 粉末快速转移至1.5mLEppendorf管中，加入800μL提取缓冲液（1.4%SDS，100mmol/L Tris-Hcl，50mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl，临用前加入0.1%14.4mol/Lβ-巯基 乙醇及2%PVP），65℃水浴40min至溶液变为土黄色，加入150μlKAc，充分混匀， 冰浴30min以沉淀蛋白质；室温下12000r/min离心15min，上清液加入200μl氯 仿/异戊醇（24:1）混匀，12000r/min离心10min，反复操作2-3次；上清液加入0.6 倍体积异丙醇（-20℃预冷），-20℃冷却30min；离心5min收集沉淀。用1%的琼 脂糖凝胶电泳检测DNA分子量，以λDNA/HindIII为Maker，核酸蛋白仪（Bio-Rad公 司）测定DNA浓度和蛋白质残留。

表1供试实验材料

2、进行RAPD扩增以及检测，RPAD反应体系由本实验室预先优化的方法进行， 即：25μL体系中含有Mg²⁺2.5mmol/L，dNTPs4.5mmol/L，Primer3.5μmol/L，DNA 模板60ng，Taq酶1.5U。PCR扩增在Bio-RadS1000ThermalCyclerPCR仪上进行。 扩增程序为94℃预变性4min，然后进行40个循环：94℃变性1min、36℃复性1min、 72℃延伸2min，循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。结果共从100个随机引物 (10bp)中筛选出能在18个样品均扩增出特异条带（SEQIDNO：1）的随机引物H37（图 2），引物H37序列为AGCGCCATTG（SEQIDNO：2），再利用H37扩增出的特异条带 进行克隆、测序，并以测序获得的序列结果设计SCAR引物SC1（SEQIDNO：3）和SC2 （SEQIDNO：4）。

3、根据以上设计合成的SCAR引物，转化为稳定的SCAR标记（见图3），具体步骤 为：将18份不同产地的金龙胆草药材以其基因组DNA为模板进行PCR扩增，其SCAR-PCR 扩增体系为：25μL体系中含有Mg²⁺2.5mmol/L，dNTPs4.5mmol/L，引物SC1、SC2 各1.5μmol/L，DNA模板60ng，Taq酶1.5U。扩增程序为：94℃预变性4min， 然后进行40个循环：94℃变性1min、36℃复性1min、72℃延伸2min，循环结束 后72℃延伸10min，4℃保存。

4、提取混淆品植物的基因组DNA，本实验采用的易混淆药用植物分别为白酒草属 白酒草、蒿属青蒿和艾草。将此三种样品的基因组DNA以引物H37进行RAPD扩增， 显示DNA有丰富扩增条带；然后再进行SCAR-PCR扩增，扩增体系和程序与步骤3中 一致。结果（图4、图5）显示扩增无目的条带，本结果能用以鉴别混淆品与金龙胆草。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。