治疗感染性疾病的肺部给药的抗感染分子微粒制剂

摘要

本发明涉及一种可生物降解的，可吸入的微粒制剂，该微粒制剂包括一种通过链霉菌种微生物发酵得到的式I化合物（PMO626271/MTCC5447），如PCT申请出版物WO2011027290中描述的，和用于给药的可生物降解的脂，其中，药（式I化合物）与脂的比例为1:15到1:25。本发明还涉及制备制剂的方法和通过给药治疗有效量的制剂到需要它们的哺乳动物治疗肺结核、多药耐药结核病（MDRTB）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的肺炎和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）肺炎的方法。本发明进一步涉及给药微粒制剂到需要它们的哺乳动物的方法，其中，制剂通过吸入或气管内灌注肺部给药而给药。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可生物降解的，可吸入的微粒制剂，该微粒制剂包括一种 通过链霉菌种微生物发酵得到的化合物（PM0626271/MTCC5447），如PCT申请 出版物WO2011027290中描述的，以下简称为式I化合物，和用于给药的可生 物降解的脂，其中，药（式I化合物）与脂的比例为1:15到1:25。本发明还涉 及通过给药治疗有效量的制剂到需要它们的哺乳动物来治疗肺结核、多药耐药 结核病（MDRTB）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的肺炎和甲氧西林敏 感的金黄色葡萄球菌（MSSA）肺炎的方法。本发明还涉及使用微粒制剂治疗肺 结核、MDRTB、MRSA肺炎和MSSA肺炎。

背景技术

结核病可以影响身体的任何器官，其可以以几种不同的形式表现，但主要 感染部位是肺。影响肺部的结核病被称为肺结核。肺结核是结核病的最主要形 式（Tuberculosis，2005,85,227-234）。现有的治疗肺结核的化疗方案包括长达 四个月的一线抗结核病药物的联合用药（异烟肼，利福平，乙胺丁醇，和/或吡 嗪酰胺），紧随两个月的使用异烟肼，利福平，和/或乙胺丁醇的治疗，但是取决 于结核病的种类，治疗可进一步延长一段时间从9个月至2年不等。现有的化 疗方案以口服给药每天一次的形式给出，与差的血浆半衰期相关联（International  Journal of Pharmaceutics，2004,276，41-49）和过多的剂量相关的不良反应（Journal of Antimicrobial Chemotherapy，200454,761-766）。这些不良反应是由于不良的 生物分布曲线。此外，在有关的口服给药的药物，已观察到，只有一小部分的 药物到达作用部位即肺，并在几个小时内被清除（Tuberculosis，2005,85, 227-234）。上述问题患者的依从性差有关，而且导致了耐多药结核病（multidrug  resistant tuberculosis，MDRTB）的发展。

MDRTB是结核病的一种形式，至少耐两种最好的抗结核药物：异烟肼和利 福平（Multidrug resistant tuberculosis fact sheet，Center for Disease Control，2008）。 MDRTB通过第二线抗结核药物治疗，如氟喹诺酮类，氨基糖苷类抗生素如丁胺 卡那霉素，卡那霉素，卷曲霉素，对氨基水杨酸，氨硫脲（Treatment of drug resistant  tuberculosis，fact sheet，Center for Disease Control，2007）。第二线抗结核药物与 剂量相关的副作用和在肺部生物利用度差有关，它不利于疾病的根除。

类比结核病问题，在治疗MRSA和MSSA肺炎，也遇到了药物的生物利用 度差和较高剂量引起的不良反应的问题。MRSA导致医院性肺炎和与呼吸机相 关性肺炎与高死亡率相关联（International Journal of Antimicrobial Agents，2007, 30,19-24），上述治疗不彻底的原因。

用于治疗MRSA肺炎的第一线药物包括万古霉素和利奈唑胺。万古霉素， 治疗MRSA肺炎的首选药物，与肺组织中的不理想药代动力学特性相关，其肺 癌浓度，仅有20%的血药浓度（Antimicrob.Agents Chemother.，1999,37, 281-286）。此外，长期给药万古霉素与中毒性肾损害相关，它是一个剂量限制性 因素（Clin.Microbiol Infect.，2006,12,92-95）。利奈唑胺，可被接受用于治疗 MRSA肺炎，展现出良好的口服生物利用度（600mg口服，每日两次给药），但 与胃肠道不良反应，血小板减少症，和可逆的贫血相关（Clinical Infect.Dis.，2003, 37,1609-1616）。在罕见的情况下，利奈唑胺的给药也与视神经和周围神经病变 相关（J Antimivrob.Chemother.，2004,53,1114-1115）。

β内酰胺类药物（如氨苄青霉素合头孢菌素），对MSSA肺炎作为第一线治 疗是非常有效的。虽然万古霉素被认为治疗的下一线，不像β内酰胺类药物在 由MSSA引起的感染中有效。万古霉素通过肾小球过滤从尿中排出，不被代谢。 肺组织渗透万古霉素也比较差（US Respiratory Disease，2006,62-64）。总之，治 疗MRSA/MSSA肺炎有几个缺点，如较差肺的药物的生物利用度，药物的剂量 诱导毒性等。

为了克服目前的标准治疗方案和患者不遵守相关的问题，有必要发展一种 直接到达作用部位的给药系统，有潜力的目标为分枝杆菌居住的肺巨噬细胞和 减少药物相关的全身毒性。

发明内容

本发明涉及一种可生物降解的，可吸入的微粒制剂，该微粒制剂包括通过 链霉菌种（Streptomyces species PM0626271/MTCC5447）微生物发酵得到的式I 化合物（如本文所述），和用于给药的可生物降解性脂，其中，药（式I化合物） 与脂的比例为1:15到1:25。

本发明还涉及制备微粒制剂的方法。

本发明进一步涉及通过给药治疗有效量的微粒制剂到需要它们的哺乳动物 治疗肺结核、MDRTB、MRSA肺炎和MSSA肺炎的方法。

本发明也涉及微粒制剂的给药到需要其的哺乳动物的方法，其中，制剂通 过吸入或气管内灌注肺部给药而给药。

本发明进一步涉及使用微粒制剂治疗肺结核、MDRTB、MRSA肺炎和MSSA 肺炎，该微粒制剂包括式I化合物和用于给药的可生物降解性脂，其中药（式I 化合物）与脂的比例为1:15到1:25。

本发明进一步涉及使用微粒制剂制造治疗肺结核、MDRTB、MRSA肺炎和 MSSA肺炎的药物，该微粒制剂包括式I化合物和用于给药的可生物降解性脂， 其中药（式I化合物）与脂的比例为1:15到1:25。

具体实施方式

在详细描述现有的发明之前，必须理解本发明并不限于特定的实施例。也 应当理解的是，这里所使用的术语只是用于描述特定实施例的目的，没有限制 意图。

正如在本说明书和权利要求书中使用的，单数形式“一个”，“一个”和“该” 包括复数，除非上下文清楚地另有说明。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有相同的含义，如一个 在本发明所属技术领域的普通技术人员所理解。

定义

包封率：包封率是药物相关联的和物理包埋在微粒制剂相对在溶液中的初 始总药物量的比例。

药：一种药物被定义为用于疾病的诊断、治疗、救济、治疗或预防疾病或 打算影响身体的结构或功能中使用的任何物质。本文所用的式I化合物是一种药 物。

质量平衡：质量平衡（也称为物质平衡）是一个应用质量守恒来分析物理 系统。通过计算进入和离开系统的物质，质量流能被确认，这可能是未知的， 或没有这个技术就难以衡量。

渗透压：渗透压用于衡量溶质浓度，定义为每千克溶剂溶质的渗摩（mOsm） 数量（mosmol/kg或mOsm/kg）。

相变：相变是一个热力学系统从物质的一相或状态转变到另外一个。热力 学系统的一相和物质状态具有基本上一致的物理特性。在给定介质相变期间介 质的某些特性改变，经常不连续，作为一些外部条件的结果，例如温度、压强 和其它。在相变发生时测量外部条件，被称为相变点。

雾化：雾化是气雾剂的产物-含微小颗粒的细雾或喷雾。

喷雾疗法：喷雾疗法涉及将液体药物转化成更快作用吸入的雾气的过程。 喷雾疗法用于治疗呼吸系统疾病，如哮喘或囊性纤维化。雾化器有效地输送药 物直接进入人的呼吸道，因此能快速到达肺部。雾化器的一个非限制性示例是 一台配备压缩机的机器和一个吹嘴或面罩。

粒径：粒径是一个引进的概念用于比较固体粒子与液态粒子（液滴）的尺 寸。对于液滴和气溶胶，术语如“气动直径”和“质量中值空气动力学直径” （MMAD）被使用。这些定义在下面给出。

气动直径：单位密度球体的直径具有与问题粒子相同的终端沉降速度。它 被用来预测在呼吸道哪里这种颗粒将沉积。

质量中值空气动力学直径：气动直径的几何平均值。50%粒子重量将小于 MMAD，50%将大于。

在粒径测量试验中，悬浮液包含不计其数的在运动中的不同大小的颗粒。 当粒径机分析这些粒子，它形成粒子分布曲线，覆盖从最小粒子开始的整个粒 子大小范围，可能是1nm到最大，可能是100微米。在粒径分布曲线中，粒子 累积频率被计算。D₁₀是指该特定的粒径，其中10%的悬浮液中的颗粒具有小于 或等于特定粒径的直径。

D₅₀:与D₁₀相类似，D₅₀是制剂中50%粒子分布的截止直径，是指特定的粒 径，其中，50%悬浮液中的粒子具有小于或等于该特定粒径的直径。

D₉₀:D₉₀是制剂中90%粒子分布的截止直径，是指特定的粒径，其中，90% 悬浮液中的粒子具有小于或等于该特定粒径的直径。

包埋药物保留雾化：在雾化过程中，由于雾化器施加的力导致一些脂质体 破裂，药物吸出制剂被保留在雾化杯本身。在雾化过程没有吸取出制剂的药物 是实际雾化中制剂药物保留量并被指定为“包埋药物保留”。在雾化过程中丢失/ 吸取的药物从雾化杯恢复。雾化杯被合适溶液洗涤（在这种情况下甲醇），保留 在杯中的药物通过HPLC或LC-MS定量。

液晶相：它是物质观察到的一个独特相，介于晶体（固体）和各向同性（液 体）状态之间。

波纹凝胶相：它是一种介于液体结晶相和凝胶相之间的亚稳态。

气管内滴注：它是一种给药方法，其中，通过气管内管给药或经皮注射进 入气管进行肺部给药。

通气支持：在医学上，机械通气是一种机械协助或代替自主呼吸的方法。 这是通过连接受疾病折磨病人的气管内管到呼吸机实现的，它为上述目的而设 计。呼吸机通过改变患者的气道压力，通过气管或气管切开管工作。包括MRSA 肺炎的暴发性肺炎患者经受气管切开术，以便它们的组织氧化得以维持。

可生物降解的脂：可生物降解的脂指的是在体内（在人体内）或通过酶的 作用或通过先天发生的生物过程进行化学降解的脂，其中，脂质分子被分解成 其基本构成成分。

治疗有效量：治疗有效量是指在体内条件下治疗和消除感兴趣的感染性生 物体的足够量的药物。在微粒制剂中的治疗量的式I化合物在1%至5%（重量/ 重量）的范围内。

非侵入性的治疗方法：非侵入性的治疗方法是指个人气管切开术前雾化吸 入或气管内滴注的方法。该过程是无痛的，并不需要额外的医疗干预措施，该 措施包括麻醉剂给药以减轻疼痛或其相关部件。

本发明涉及一种微粒制剂，其包含式I的化合物和用于给药的生物可降解性 脂，其中，药物（式I化合物）与脂的比为1:15至1:25，该制剂是一种可生物 降解和可吸入的制剂。

根据本发明的一个方面，式I化合物构成1%至5%（重量/重量）的制剂。

式I化合物的结构由以下结构式表示：

微生物，可被用于生产式I化合物是链霉菌属种的菌株（PM0626271/MTCC 5447），以下简称为培养菌编号PM0626271，从在南极地区尔马赫绿洲 （Schirmacher oasis）采集的土壤样品分离得到。编号PM0626271的培养菌已交 存微生物菌种保藏中心（MTCC），微生物技术研究所，39-A部门，昌迪加尔 160036，印度，一个世界知识产权组织（WIPO）公认的国际保存管理局（IDA）， 并具有登记编号MTCC5447。

化合物能被编号PM0626271的培养菌生产，其突变体和变异，包括步骤： 在一种营养基中，在浸没需氧条件下生长编号PM0626271的培养菌，该营养基 含有一个或多个源的碳和一个或多个源的氮和任选的营养无机盐和/或痕量元 素；从培养液中分离式I的化合物；使用在本领域中通常使用的纯化程序纯化式 I的化合物。

除了本文所描述的特定微生物，应该理解的是该微生物的突变体，如由使 用化学或物理诱变剂产生，包括X-射线和紫外线射线等，生物体的基因构成已 通过分子生物学技术被修改，也可以用来培养产生的化合物。

用于分离和培养编号PM0626271培养菌的介质和/或营养培养基，它产生式 I化合物，优选含有碳，氮和营养无机盐来源。碳源是例如，淀粉、葡萄糖、蔗 糖、糊精、果糖、糖蜜、甘油、乳糖或半乳糖中的一个或多个。优选的碳源是 可溶性淀粉和葡萄糖。氮的来源为，例如，大豆粉、花生粉、酵母提取物、牛 肉提取物、蛋白胨、麦芽提取物、玉米浆、明胶或酪蛋白氨基酸中的一个或多 个。优选的氮源是蛋白胨和酵母提取物。营养无机盐是，例如，氯化钠、氯化 钾、氯化钙、氯化镁、氯化铁、氯化锶、氯化钴、溴化钾、氟化钠、磷酸氢钠、 磷酸氢钾、磷酸氢二钾磷酸盐、磷酸镁、碳酸钙、碳酸氢钠、硅酸钠、硝酸铵、 硝酸钾、硫酸亚铁、硫酸钠、硫酸铵、硫酸镁、硫酸铁、柠檬酸、硼酸或微量 盐溶液，如硫酸铜、氯化锰或硫酸锌中的一种或多种。碳酸钙、氯化钠、氯化 镁是优选的营养无机盐。

编号PM0626271培养菌的保养可能在温度范围为22℃到36℃，pH范围大 约7.5到8.0下进行。典型的，编号PM0626271培养菌在温度范围为25℃到27℃， pH范围大约7.4到7.8下进行保养。生长良好的培养菌可能会被以4°C～8°C保 存在冰箱中。

编号PM0626271培养菌的种子培养菌的养殖可能在温度范围为25℃至 36℃，pH范围大约7.5至8.0下进行66小时到75小时200rmp（转数每分钟） 到280rmp旋转条件下进行。典型的，编号PM0626271培养菌种子在29℃至31℃， pH7.4至7.8，72小时230rmp至250rmp条件下培养。

生产式I化合物可能通过培养编号PM0626271培养菌通过发酵进行，发酵 条件为：温度范围26℃至36℃，pH大约6.5至8.5，24小时到96小时60rmp 至140rmp旋转和100lpm（升每分钟）到200lpm通风。典型的，编号PM0626271 培养菌在30℃至32℃，pH7.4到7.8，40小时到96小时90rpm旋转，110lpm通 风下培养。

化合物的发酵和生产的进展可以通过高效液相色谱法（HPLC），通过测定 培养液对葡萄球菌和/或肠球菌种的生物活性，通过公知的微生物琼脂平板扩散 测定法检测。优选培养菌是金黄色葡萄球菌E710，这是耐甲氧西林和文献报道 的β-内酰胺类抗生素的菌种，和耐万古霉素的屎肠球菌R2（VRE）。在所得到 的培养液中，化合物可以存在于培养滤液中以及在细胞块中，并且可以使用已 知的分离技术，如溶剂萃取，柱色谱法分离。式Ⅰ化合物可以从培养物滤液中 回收，通过用与水不混溶的溶剂，如石油醚，二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，乙 醚，丁醇，在约5至9的pH值的提取，或通过疏水性相互作用色谱法，使用聚 合树脂如（Mitsubishi Chemical Industries Limited,Japan)，“离 子交换树脂(Rohm and Haas Industries U.S.A.）和活性炭，或在pH为5 至9通过离子交换层析。活性材料可以从细胞块回收，通过由与水混溶的溶剂 如甲醇、丙酮、乙腈、n-丙醇、或异丙醇的萃取，或由与水不混溶的溶剂，如石 油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或丁醇的萃取。另一个选择是用选自石油醚、 二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、乙腈、n-丙醇、异丙醇或丁醇的溶剂 提取整个培养液。典型的，活性物质是从整个培养液用乙酸乙酯萃取。提取物 的浓缩和冷冻干燥给出活性的粗材料。式Ⅰ化合物可以通过分馏从粗材料中回 收，使用以下任何技术：正相色谱法（使用氧化铝或硅胶作为固定相和洗脱液， 如石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、氯仿、甲醇，或它们的组合）；反相色 谱法（使用反相硅胶，如二甲基十八烷基甲硅烷硅胶（RP-18）或二甲基八烷基 甲硅烷硅胶（RP-8）作为固定相；和洗脱剂，例如水，缓冲液[例如磷酸盐、乙 酸盐、柠檬酸盐（pH为2至8）]，和有机溶剂（例如甲醇、乙腈、丙酮、四氢 呋喃，或这些溶剂的组合））；凝胶渗透色谱法（使用树脂，如交联葡聚糖（Pharmacia Chemical Industries,Sweden），TSK凝胶TOYOPEARL HW （TosoHaas,Tosoh Corporation,Japan），在溶剂如甲醇，氯仿，丙酮，乙酸乙酯， 乙酸，或它们的组合，或和G-25在水中）；或通过逆流色谱法 （使用一个由两种或多种溶剂构成的两相洗脱剂系统，例如水、甲醇、乙醇、 异丙醇、正丙醇、四氢呋喃、丙酮、乙腈、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、石油 醚、苯和甲苯）。这些技术可以被反复使用，单独或组合使用。一个典型的方法 是用硅胶正相色谱法。

式Ⅰ和它们的异构体的化合物，可以被转换成它们药学上可接受的盐和衍 生物，类似酯和醚，都是本发明所考虑的。

在制剂中使用的可生物降解的脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC），它是一 种天然存在的内源性肺表面活性剂体系的磷脂。其它非限制性实施例的可用于 与DPPC组合的可生物降解的脂质，包括二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）、DPPE （二棕榈酰磷脂酰乙醇胺）、胆甾醇、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸。在本发明的 另一个方面，该制剂的微粒的大小范围在0.5微米和10微米之间。

在本发明的又一个方面，该制剂的90%的微粒的尺寸小于10微米。

在本发明的又一个方面，该制剂是一种含水的脂质体分散液。

在本发明的一个方面，该制剂的pH值为从6至7。

在另一个方面中，该制剂的渗透压是从300mOsmol/kg到400mOsmol/kg。 在本发明又一个方面中，该制剂的相转变温度是从41°C至43℃。在本发明的另 一个方面，该制剂可以通过使用一个雾化器雾化为质量中值空气动力学直径为1 微米至10微米。

雾化器的类型，可以使用包括但不限于射流的雾化器，超声波雾化器和振 动网状喷雾器。

本发明还涉及用于制备微粒制剂的方法。

在本发明的一个方面，制备该制剂的方法，涉及使用“溶剂蒸镀法”，其中包 括以下步骤：

（a）将式I和DPPC化合物（按1:1至1:20的比例）溶解在3mL到15mL 的氯仿中，得到一溶液。

（b）添加20mL至45mL甲醇到步骤（a）所述的溶液中并充分混合以确保 均匀；

（c）添加20mL至50mL人工肺液（SLF）到步骤（b）的溶液中；

（d）蒸发溶剂；

（e）使用SLF将步骤（d）中得到的体积补充到30mL，在15000G到35000G， 4℃下离心十分钟得到颗粒；

（f）在SLF中重悬步骤（e）中得到的颗粒，得到浓度为0.5mg/mL至10 mg/mL的悬浮液；及

（g）通过0.5μm至5μm的聚碳酸酯过滤器过滤步骤（f）中得到的悬浮液， 以获得形成的均匀粒径的微粒。

这里所用“溶剂蒸发法”是在美国专利4877561中报道的方法的变形。

在本发明的一个实施例中，在制备微粒制剂方法的步骤（a）中，式I的化 合物和DPPC以1:20的比例溶解。

在本发明的另一个实施例中，在制备微粒制剂方法的步骤（a）中，式I的 化合物和DPPC溶解在5至10mL氯仿中，得一溶液。

在本发明的一个实施例中，在制备微粒制剂方法的步骤（b）中，添加30 至40mL的甲醇溶液。

在本发明的另一个实施例中，在制备微粒制剂方法的步骤（c）中，添加25 到35mL的SLF。在本发明的另一个实施例中，在制备微粒制剂方法的步骤（e） 中，离心在20000到30000G下进行。

在本发明的另一个实施例中，在制备微粒制剂方法的步骤（f）中，颗粒在 SLF中重悬，得到浓度为1至5mg/mL的悬浮液。

在本发明的另一个实施例中，在制备微粒制剂方法的步骤（g）中，步骤（f） 中得到的悬浮液经2μm至5μm的聚碳酸酯过滤器过滤。

在本发明的另一个方面，制剂的制备方法是“无溶剂脂质的自组装方法”，其 中包括以下步骤：

（i）添加20mL至45mL的SLF到由式I化合物和二棕榈酰磷脂酰胆碱 （DPPC）组成的混合物中（按1:1到1:20比例）；

（ii）将步骤（i）的混合物在45℃，100rpm至200rpm的转速下旋转一小 时，得到悬浮液;

（iii）在15000G到35000G，4℃下离心步骤（ii）得到的悬浮液10分钟得 到颗粒；

（iv）在SLF中重悬步骤（iii）得到的颗粒，得到浓度为0.5mg/mL至10mg/mL 的悬浮液；及

（v）通过0.5μm至5μm的聚碳酸酯过滤器过滤步骤（iv）中得到的悬浮液， 以获得均匀粒径形成的微粒。

在本发明的一个实施例中，在制备微粒制剂方法的步骤（i）中，添加30mL 到40mL的SLF到式I化合物和DPPC组成的混合物中。

在本发明的另一个实施例中，在制备微粒制剂方法的步骤（i）中，式I化 合物和DPPC按1:20的比例溶解。

在本发明的一个实施例中，在制备微粒制剂方法的步骤（iii）中，步骤（ii） 得到的悬浮液在20000G到35000G，4℃下离心十分钟得到颗粒。

在本发明的另一个实施例中，在制备微粒制剂方法的步骤（iv）中，步骤（iii） 得到的颗粒在SLF中重悬得到浓度为1mg/mL至5mg/mL的悬浮液。

在本发明的另一个实施例中，在制备微粒制剂方法的步骤（v）中，步骤（iv） 得到的悬浮液经2μm至5μm的聚碳酸酯过滤器过滤

本发明进一步涉及制剂的应用，在通过给药治疗上有效量的制剂到需要其 的哺乳动物来治疗肺结核，MDRTB，MRSA肺炎和MSSA肺炎的方法中。

本发明进一步涉及微粒制剂在制造治疗肺结核，MDRTB，MRSA肺炎和 MSSA肺炎的药物上的应用，该微粒制剂包含式I化合物和用于给药的生物可降 解性脂，其中，药物（式I化合物）与脂的比例为1:15到1:25。

在本发明的一个方面，治疗方法的目标为肺泡巨噬细胞，它可以藏有分枝 杆菌和耐甲氧西林以及甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌。

本发明也涉及给药微粒制剂到需要其的哺乳动物的方法，其中，制剂通过 吸入或气管内灌注肺部给药而给药。

在本发明的一个方面，给药微粒制剂的方法是吸入。

在本发明的另一个方面，吸入的方法是雾化，其中，式I化合物被包埋在微 粒制剂中。

关于本发明的微粒制剂，已经观察到，当通过吸入给药时，在制剂中包含 的显著浓度的式I化合物在小鼠的肺部被检测到。在接受未配制的式I化合物的 老鼠的肺里，没有检测到显著浓度的式I化合物。这是一个表示的式I的化合物 的微粒制剂的生物利用度增加。另外，已经观察到，当本发明的微粒制剂通过 吸入给药时，药物（式I化合物）被保留在肺部超过24小时。

在本发明的另一个方面，包埋式I化合物的保留是大于30%。特别的，包埋 式I化合物的保留范围是30%到70%。

吸入式I化合物的剂量范围介于0.05和10毫克/千克体重/天。

在本发明的另一方面，微粒制剂的给药方法是在呼吸系统在病人气管内滴 注。

在本发明的另一方面，通过雾化给药帮助减少治疗肺结核，MDRTB，MRSA 肺炎和MSSA肺炎的式I化合物的需求量。

在本发明的另一个方面，该方法有助于式I化合物到达肺部。

微粒制剂的疗效通过随后示例中详细描述的生物测定来建立。本文所提供 的这些实施例仅为了说明的目的，并不意在限制本发明的范围。

实施例

下列术语/缩略语/化学式在实施例中被采用：

NaCl:氯化钠

CaCl₂:氯化钙

NaOH:氢氧化钠

SLF:人工肺液

HPLC:高效液相色谱法

DPPC:1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱

DMSO:二甲基亚砜

RB flask:圆底烧瓶

rpm:每分钟转数

DSC:微分扫描量热仪

TSI:双阶段撞击

MSSA:甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌

MRSA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

VRE:抗万古霉素肠球菌

TSA:胰蛋白大豆琼脂

CFU:菌落形成单位，

HBSS:汉克斯缓冲盐溶液

MTS:（3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）

-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑鎓）

GC-HS:气相色谱仪顶空附件

CPCSEA:委员会对动物实验的控制和监督的目的

IAEC:实验动物伦理委员会

API:活性药物成分

实施例1

将编号PM0626271的培养菌与从南极地区采集的土壤分离

a）分离培养基的组成：

改进的人工海水琼脂：蛋白胨1.5g，酵母提取物0.5g，氯化铁0.007g，1.0 升的水（750mL人造海水+250mL软化水），琼脂粉末15.0g，最终的pH值（在 25°C），7.4至7.8。

b）步骤：

从在南极地区的尔马赫绿洲地区收集的表面层次土壤，运到印度孟买格尔 甘的Piramal生命科学有限公司，一路上储存在-20°C。样品被储存在-20℃到 -22℃，并稍后解冻至室温（25±2℃）以隔离微生物。在一个100毫升灭菌的烧 瓶中，土壤样品（～1g）被悬浮在25毫升无菌1%蛋白胨水中。烧瓶中加入30 秒的涡流。高达10-5的系列稀释液在无菌1%蛋白胨水中制备。100μL的10^-5稀释液在改进的人工海水琼脂表面扩散。该板在室温下保温（25±2℃），直到观 察菌落。孵育了一个半月后，在这种培养基上出现的菌落上划线出现在培养皿 中，该培养皿中包含放线菌隔离琼脂[Hi培养基]制备在75%的人工的海水中 [AccumixTm]（AS-AIA）。分离物被纯化并提供培养的ID号码PM0626271。编 号PM0626271的培养菌因此从成长的微生物当中隔离作为单一的分离物。

实施例2

编号PM0626271培养菌纯化

a）纯化培养基的组成（放线菌分离琼脂，1.5%琼脂进行琼脂化的）

甘油5.0mL，L-天冬酰胺酪蛋白酸钠2.0g，0.1g，钠丙酸4.0g，磷酸氢二钾 0.5g，硫酸镁0.1g，硫酸亚铁0.001g，1.0L的水（750mL人工海水+250mL软化 水），琼脂粉末15.0g，最终的pH值（在25℃）7.4至7.8。

人工海水的组合物：氯化钠24.6g，氯化钾0.67g，二水氯化钙1.36g，七水 硫酸镁6.29g，六水氯化镁4.66g，碳酸氢钠0.18g，软化水1.0L，最终的pH值 （在25℃）7.8到8.2。

b）步骤

编号PM0626271的培养菌划线出现在划线放线菌的分离琼脂（含75%的人 工海水盐）的培养皿。培养皿在25℃下温育10天。从培养皿中的一个分离的菌 落被转移到制备在75%的人工海水中的放线菌分离琼脂的新鲜斜面。斜面在 25℃下温育10天。

实施例3

生产菌株的维护-培养菌编号PM0626271

a）培养基的组成（放线菌隔离琼脂）

甘油5.0mL，L-天冬酰胺2.0g，酪蛋白酸钠0.1g，钠丙酸4.0g，磷酸氢二 钾0.5g，硫酸镁0.1g，硫酸亚铁0.001g，1.0L的水（750mL人造海水+250mL 软化水），琼脂粉末15.0g，最终的pH值（在25℃）7.4至7.8。

人工海水的组成：氯化钠24.6g，氯化钾0.67g，二水氯化钙1.36g，七水 硫酸镁6.29g，六水氯化镁4.66g，碳酸氢钠0.18g，软化水1.0L，最终的pH 值（在25℃）7.8到8.2。

b）通过加热彻底溶解成分后，所得溶液分发到试管中，并在121℃下灭菌 30分钟。试管被冷却并使其固化在倾斜位置。随着编号PM0626271培养菌由丝 环生长，琼脂斜面上有纹出现并继续培养在27°C至29°C，直到观察到良好的增 长势头。生长良好的培养菌在4°C～8°C存放在冰箱里。

实施例4

在摇瓶中，编号PM0626271培养菌的发酵

a）种子培养基的组成[AS-274(1)]：

葡萄糖15g，玉米浆5g，蛋白胨7.5g，酵母提取物7.5g，碳酸钙2.0g， 氯化钠5.0g，体积与750mL人造海水和250mL软化水。

b）上述培养基在40mL的量分布，在500mL容量的三角烧瓶中，在121℃ 下高压灭菌30分钟。将烧瓶冷却至室温（25°C2±2℃），每个烧瓶中接种一个菌 环量生长良好的生产菌株（培养菌编号PM0626271）在倾斜面上，在230rpm 至250rmp，30℃±°C下，在旋转摇床上振荡72小时得到种子培养菌。

c）生产培养基的组成[AS36P(1)]：

可溶性淀粉20g，葡萄糖15g，酵母提取物2g，蛋白胨3g，碳酸钙2g，硫 酸铵0.5g，玉米浆2g，氯化钠2g，磷酸镁5g，氯化钴1mL/L从库存中的1g/L， 微量盐溶液1mL/L，体积至1L，用75%的人造海水和25%软化水。

d）40mL的培养基在500mL容量的三角烧瓶中在121℃下被高温灭菌30分 钟，冷却至29℃至30℃，并接种实施例4b中提到的5%（体积/体积）的种子培 养菌。

e）发酵参数：

生产烧瓶在29℃，220rpm的转速下摇动培养96小时。生产烧瓶收获，从 各个培养基烧瓶的整个培养液在29℃振荡条件下，使用相同体积的甲醛萃取一 小时，在3500rmp下离心半小时。上清液用于抗菌琼脂孔扩散法进行监测的活 动。

实施例5

在摇瓶中制备用于发酵的种子培养菌

a）培养基的组成[AS-274(1)]：

葡萄糖15g，玉米浆5g，蛋白胨7.5g，酵母提取物7.5g，碳酸钙2.0g，氯 化钠5.0g，体积与750mL人工海水和250mL软化水。

b）上述培养基，在1000毫升的锥形瓶中，并在200毫升的量分布，在121℃ 下进行30分钟高压灭菌。将烧瓶冷却至室温（25+2℃），每个烧瓶中接种一个 菌环量生长良好的生产菌株（PM0626271）在倾斜面上，在230rpm至250rmp， 29℃到30℃下，在旋转摇床上振荡70至74小时得到种子培养菌。

实施例6

编号PM0626271培养菌在发酵罐中的培养

a）生产培养基的组成

人工海水（人造海水盐28.32g）（75%），可溶性淀粉20g，葡萄糖15g，酵 母提取物2g，蛋白胨3g，碳酸钙2g，硫酸铵0.05g，玉米浆2g，氯化钠2g，磷 酸镁5g，氯化钴（氯化钴1g软化水1.0L）1mL/L，微量盐溶液（硫酸铜7g， 硫酸亚铁1g，氯化锰8g，硫酸锌2g，软化水1.0L）1mL/L，软化水1.0L，pH 值为6.5～7.5（灭菌前）。

b）100L的生产培养基在150L发酵罐中，以及30毫升德士模范作为消泡 剂，在121℃原位灭菌30分钟，冷却至29℃至30℃并接种用2.5L至3.5L的 上面获得的种子培养菌（实施例5）。

c）发酵参数：发酵进行在温度29°C至30°C，搅拌100rpm下，曝气60lpm 并且在70小时至74小时收获。在发酵液中的式Ⅰ化合物的生产通过使用琼脂 孔扩散法，测试对金黄色葡萄球菌E710（MRSA菌株）和/或屎肠球菌 （Enterococcus faecium），R2（VRE）的生物活性而定性检测。培养液的收获pH 值是7.5到8.0。收获后，全培养液进行溶剂萃取。

实施例7

化合物的隔离和纯化

整个培养液（10L批），用乙酸乙酯（1:1）萃取。将有机层和水层分离。将 有机层进行处理，以使溶剂蒸发，得到粗品的乙酸乙酯萃取液（1.5g）。粗提取 物通过快速色谱法（硅胶，30g，溶剂：甲醇/氯仿分步梯度，流量：15毫升/分 钟）被进一步处理。活性化合物用1%至5%甲醇在氯仿溶液中洗脱，浓缩以获 得半纯的化合物（250mg）。通过反复正相制备HPLC进一步进行纯化。

制备HPLC条件：

柱:Eurospher硅胶(10μ,20×250mm)

洗脱液:甲醇：氯仿(5:95)

流量:20毫升/分钟

检测(UV):245nm

保留时间:(5到6分钟)

馏分的纯度是通过对屎肠球菌R2和/或金黄色葡萄球菌3066和/或分析型 HPLC进行生物测定而检查。洗脱液在减压下汇集和浓缩以除去溶剂，得到化合 物。

分析用HPLC的条件：

柱:Eurospher RP-18,(3μ,4.6×125mm)

溶剂系统:梯度(0%乙腈至100%在15分钟内对水，跟随 100%乙腈5分钟)

流量:1毫升/分钟

检测(UV):245nm

保留时间:式I化合物(12到13分钟)

式I的化合物的物理和光谱性质：

外形:白色粉末

熔点:240°C(分解)

可溶性:溶于氯仿，乙酸乙酯，甲醇，不溶于水

HR-ESI:1650.4858(M+H)

分子量(ESI):1650.5(M+H)

分子式:C₇₁H₈₃N₁₉O₁₈S₅

IR(KBr):3386,2927,1648,1507,1206,756,666cm^-1

¹H NMR:参照表1

¹³C NMR:参照表2

表1

式Ⅰ化合物的¹H NMR在CDCl₃：CD₃OD（4:1）在500MHz

表2

式I化合物的¹³C NMR在CDCl₃:CD₃OD(4:1)在500MHZ

信号 δ 信号 δ 信号 δ 1 12.11 25 64.45 49 144.61 2 13.74 26 64.73 50 148.17 3 14.1 27 65.69 51 148.45 4 14.8 28 65.95 52 151.89 5 16.48 29 70.27 53 152.76 6 17.11 30 77.1 54 155.45 7 17.27 31 101.45 55 157.9 8 17.55 32 101.45 56 159.0 9 20.9 33 102.6 57 160.04 10 23.13 34 116.52 58 160.36 11 27.56 35 120.63 59 161.01 12 27.56 36 121.59 60 163.75 13 29.04 37 123.28 61 164.46 14 33.24 38 123.87 62 164.5 15 46.17 39 123.87 63 166.6 16 50.14 40 125.48 64 167.13 17 51.3 41 126.03 65 167.95

18 53.91 42 126.69 66 168.47 19 53.91 43 128.24 67 168.67 20 55.8 44 130.34 68 170.35 21 57.32 45 130.98 69 170.35 22 58.8 46 131.14 70 171.63 23 62.42 47 132.39 71 172.0 24 62.73 48 141.85    

实施例8

式I化合物在SLF的溶解性的估计(pH7.4)

所用材料：

NaCl:RFCL有限公司，印度

CaCl₂:RFCL有限公司，印度

NaOH:RFCL有限公司，印度

步骤：

SLF制备方法基于Respiratory Physiology&Neurobiology，2008，162，73-79。

制备SLF

9g氯化钠，0.220g氯化钙和6.5g乳糖溶解在1000mL的水中。所得溶液的 pH值调节到7.4。在SLF中式Ⅰ化合物的溶解度测定在两种温度下，45oC和60oC。 对于这一点，将1mg的式I化合物加入到3mL的SLF（一式两份）并且涡旋几 秒钟后，在设定要求的温度下在水浴中孵育。溶解度以一个小时的时间间隔测 定了三个小时。将该溶液通过0.22μm过滤器过滤，将滤液在HPLC上注入。相 对于适当的校准曲线计算溶解度。

得到的结果列于表3。

表3

结论：

式I化合物展示在SLF中差的溶解性在45℃和60℃。溶解度也没有时间依 赖性。式Ⅰ化合物是一种不溶于水的化合物，从而测定溶解度在缓冲区SLF。

实施例9

制备式I化合物的微粒制剂

所用材料：

DPPC:Avanti Polar Lipids,加拿大

甲醇:RFCL有限公司，印度

氯仿:RFCL有限公司，印度

DMSO:RFCL有限公司，印度

NaCl:RFCL有限公司，印度

CaCl₂:RFCL有限公司，印度

NaOH:RFCL有限公司，印度

一水乳糖:Signet化工股份有限公司私营有限公司,美国

玻璃器皿:Merck有限公司，印度

玻璃珠:N.M.企业，印度

聚碳酸酯膜:ISOPORE^TM,Millipore,美国

过滤器

聚丙烯过滤器:Millipore,美国

台座

气密玻璃注射器:汉密尔顿公司，美国

与金属勒尔锁

pH表:优特仪器，美国

步骤：

方法A

溶剂蒸发法

该试验基于参考US4877561而进行。

式Ⅰ化合物和DPPC以1:1，1:10和1:20的比率，质量/质量，在玻璃烧杯 里溶解在5mL氯仿中。加入30mL甲醇溶液，混合物被转移到一个250mL的圆 底烧瓶中。30毫升的SLF慢慢倒入混合物中。通过使用旋转蒸发器（Buchi  GMBH，瑞士）蒸发溶剂，水浴被设置在45°C并且旋转被设定在100rpm。真 空控制器被设置为400毫巴的压力。蒸发的溶剂被收集在玻璃溶剂收集器中。 在RB烧瓶中剩余的溶液变成乳白色表示形成脂质体。使用SLF补充从RB烧瓶 中的悬浮液的体积至30毫升，在25,000G，4℃下离心10分钟。所得的颗粒在 SLF中重悬，涡旋混合并通过1.2μm的聚碳酸酯过滤器过滤11次，以确保均匀 的颗粒尺寸，并储存在4℃下。通过光学显微镜和电子显微镜分析微粒制剂。

方法B

无溶剂脂质的自组装方法

目标是为制剂发展无溶剂制造工艺。

20mg的式I化合物和20mg的DPPC（按1:20重量/重量）加入到含有20～30 个玻璃珠和30mL SLF的RB烧瓶。在45℃，100rpm下混合物进行一小时的旋 转。得到的制剂如方法A中描述的进行离心和过滤。

该制剂是通过光学显微镜被分析。

观察：

方法A制备的微粒制剂。

（i）含有比例为1:1重量/重量和1:10重量/重量的式I化合物和DPPC的微 粒制剂显示非均匀性，在光学显微镜下观察时，具有药物的不稳定悬浮液聚集。 微粒固定在管的底部。

（ii）含有比例为1:20重量/重量的式I化合物和DPPC的微粒制剂显示非 均匀性，在光学显微镜下观察时，没有药物的悬浮液聚集。微粒没有固定在管 内。

（iii）含有比例为1:20重量/重量的式I化合物和DPPC的微粒制剂，在电 子显微镜下观察时，显示尺寸2μm到3μm的微粒。

结果：

含有式Ⅰ化合物和DPPC的微粒最佳使用药物：类脂比为1:20重量/重量形 成。

实施例10

实施例9方法A和实施例9方法B的制剂的式I化合物的包封率的测定和 物质平衡。

所用材料：

甲醇:RFCL有限公司，印度

DMSO:RFCL有限公司，印度

玻璃器皿:Merck有限公司，印度

自动移液管:Eppendorf有限公司,德国

步骤：

实施例9方法A和实施例9方法B的制剂中的式I化合物的包封率被HPLC （Agilent,USA）分析。HPLC条件如下：

柱:100,RP-18e,150×4.6mm,5μm

流动相:(a)0.01M醋酸铵+0.5%三乙胺在1000mL水中;pH用冰醋酸调 节至6.5

(b)乙腈

成分:(a):(b)::50:50

运行时间:5分钟

柱温:25°C

进样量：20μL

保留时间:～3.5分钟

溶剂:20%DMSO在甲醇

式I化合物溶解在20%DMSO中，得到200μg/mL的浓度，并作为参考标 准。100μL实施例9方法A的制剂和100μL实施例9方法B的制剂分别被吸移 到2mL离心管并且900μL20%的DMSO加入到每个离心管。试管被涡旋而导致 微粒基体破裂并且释放包埋在基体内的式I化合物全部内容。独立地在HPLC 上注入的样品如下：参考标准，实施例9方法A（破裂后微粒基体）的制剂和 实施例9方法B（破裂后微粒基体）的制剂。峰面积的平均值进行计算被考虑。

其中，

W=药物量（式I化合物）联合/包埋微粒内

w=初始量的式I的化合物

对于质量平衡计算，式I化合物从玻璃器皿，过滤器，以及所有其它实验器 皿中回收，该所有其它实验器皿在制剂制备过程中被使用（实施例9方法A和 实施例9方法B），它的内容被估计。聚碳酸酯过滤器（实施例9方法A和实施 例9方法B）用5毫升的在甲醇中的20%的DMSO洗涤。样品注入HPLC作为 “膜残留”。

用于制备制剂的RB烧瓶用10毫升在甲醇中的20%的DMSO来洗涤。样品 注入HPLC作为“烧瓶残留”。

参考标准在HPLC上被注射六次并且峰面积被指出。标准6次注射的相对 标准偏差为2.0%以下。将样品重复注入在HPLC上，峰面积的平均值被考虑用 于计算。

得到的结果列于表4。

表4

制剂 %包封 %质量平衡

实施例9方法A 90.8 100.3 实施例9方法B 76.6 94.8

结论：

当采用实施例9的方法A制备时比当采用实施例9的方法B制备时制剂的 包封率相对更好。

实施例11

测定实施例9方法A的微粒制剂的粒径

步骤

实施例9方法A的微粒制剂的流体力学直径和粒径分布使用光子相关光谱 仪（DELSA Nano,Beckmann Coulter,USA）测定。使用SLF将1mL的制剂稀释 至10mL。使用了1毫升该溶液用于确定粒径。

结果：

实施例9方法A的微粒制剂的平均粒径是2μm到3μm。对于每个单独分布， 平均值附近的粒径的分散约为0.45-0.47。

表5提供了三种截止直径。D₁₀，D₅₀和D₉₀表示平均直径的分别的10%，50% 和90%的粒子分布。

表5

制剂 D₁₀D₅₀D₉₀实施例9方法A 1.7 3.9 7.9

结论：

式I化合物脂质基础的微粒的溶剂蒸发方法（实施例9方法A）已导致1μm 至10μm范围的微粒（如表5所述）产生，99%以上的粒子具有粒径小于10μm （在表6中所示）。

表6

%粒子 直径(μm) 90 5.6 99.4 6.1

实施例12

确定实施例9方法A的制剂的pH

步骤：

对pH计（Eutech,USA）进行了电子标准化对标准的pH缓冲区的pH值为 4，7和9。实施例9方法A的制剂的pH通过使用同样的pH计测定。

结果：

实施例9方法A的制剂的pH是6.14。

结论：

实施例9方法A的制剂的pH与短期30分钟一次雾化或气管内安装给药（式 I化合物）生理上相兼容。

实施例13

实施例9方法A的制剂的渗透压的测定

材料：

参考溶液：Wheecon仪器有限公司

渗透压仪：Wheecon仪器有限公司

步骤：

实施例9方法A的制剂的渗透压通过使用渗透压仪确定。渗透压仪使用 290mOsmol/kg的参考溶液来标准化。

结果：

实施例9方法A的制剂的渗透压是340mOsmol/kg。

结论：

体液的生理渗透压为300mOsmol/kg。这渗透压的任何重大变化具有病理意 义。给药大量的高渗溶液（显著更高渗透压）或低渗溶液（显著更低渗透压） 引起要么是过度的损失/获取体液导致肺组织水肿或脱水的病理状况。引入少量 的流体，在正常渗透压浓度以气溶胶形式排除上述病症的发展。实施例9方法A 的制剂具有340mOsmol/kg的渗透压，因此是在安全的限度内。

实施例14

在实施例9方法A的制剂的式I化合物的赋形剂的相容性评价。

材料：

用O型环密封锅：Perkin Elmer印度有限公司

DSC：Perkin Elmer，美国

步骤：

50μL实施例9方法A的制剂移液在示差扫描量热仪（DSC）锅。样品和空 参考锅（参考标准）被密封，并放置在高速示差扫描量热仪，温度程序运行如 下：

温度程序:0°C to50°C

加热率:5°C/分钟

吹扫气体:氮气

流量:30mL/分钟

结果：

没有式I化合物制备的脂质体展一个吸热初始在41.1℃下。这个吸热可以归 因于从撕开凝胶相过渡到液晶相。微粒制剂表现出吸热约在42.5°C。起始温度 的这种转移可能是由于式Ⅰ化合物与DPPC脂质体的物理相互作用。主要转变 的这种转移标记着磷脂双分子层从高度受阻组织良好的烃链包装状态转变到一 些酰基链存在扭结的状态。

结论：

结果表现出式I的化合物和DPPC之间的药物赋形剂的相容性的关系。没有 重大转移在吸热起始温度以及缺乏峰值取消。

实施例15

实施例9方法A的制剂的溶剂含量的估计

材料：

甲醇(HPLC级):RFCL有限公司，印度

氯仿(HPLC级):RFCL有限公司，印度

DMSO(HPLC级):RFCL有限公司，印度

玻璃GC-HS瓶:Perkin Elmer印度有限公司

玻璃器皿:Merck有限公司，印度

步骤：

使用GC-HS，实验用于研究在实施例9方法A的制剂的溶剂残留量。这个 实验评估使用溶剂蒸发法（实施例9方法A）将用于大规模的商业化生产实施 例9方法A的制剂的可行性。

空白准备：5mL的DMSO被加入到20mL的GC-HS玻璃瓶。将该瓶用聚四 氟乙烯塞子和铝盖压接。两个这样的瓶为空白注射准备。

标准准备：在100mL的标准容量瓶中精确称量10mg的氯仿和100mg的甲 醇。溶剂被溶解并且体积用DMSO补充到100毫升。5mL储备液被移液到20mL GC-HS玻璃瓶中。将瓶用聚四氟乙烯塞子和铝盖压接。六个这样的瓶子在标准 注射中被准备。

样品制备：5mL的DMSO被加入到20mL的GC-HS玻璃瓶中。将瓶置于电 子天平上并且测量皮重。500μL实施例9方法A的制剂被添加到玻璃小瓶中， 并且重量准确地被称出。将瓶用聚四氟乙烯塞子和铝盖压接。三个这样的瓶子 在样品注入中准备。

表7给出了色谱条件和用于估计在实施例9方法A的制剂中的溶剂含量的 方法。

表7

结果：

表8给出蒸发时间在溶剂含量上的影响的破坏和实施例9方法A制剂的包封。

表8

观察：

已经观察到，蒸发时间为2小时，给出实施例9方法A的制剂较低的溶剂的含 量和所需的包封和质量平衡特质。此外，通过GC-HS检测出的残留溶剂量低于 为每个单独的溶剂的允许极限值（允许每天暴露限值，三氯甲烷为60ppm和甲醇 为3000PPM-（ICH Quality Guidelines,Impurities:Guidelines for Residual Solvents, Q3C(R5),Feb2011)对于API溶剂含量和允许每天接触限值的医药产品。

结论：

溶剂蒸发的方法（实施例9方法A）可以被认为是一种合适的方法来开发该 制剂。

实施例16

实施例9方法A的制剂的雾化

材料：

双阶段撞击单位:Copley科学,英国

喷雾器:,Sunrise医疗，美国

甲醇:RFCL有限公司，印度

DMSO:RFCL有限公司，印度

HPLC:Agilent，美国

电子天平:Denver仪器，美国

步骤：

本研究使用的TSI单位和依照使用说明书被组装。TSI是人肺道在体外的玻 璃模型并且用于量化在体外的肺部药物沉积电位。

TSI的真空泵被接通，流量计用于准确地检查该系统的流动。真空泵上的流 阀被调节，以确保精确的流规范（28.3L/min）。经过校准气流后，整个单元被 拆卸。7毫升甲醇溶液加入到较上的撞击器，20mL甲醇加入到较低的撞击器。 TSI单元按照指令手册再次被组装。

5mL的实施例9方法A的制剂被加入到雾化器的服药杯中。雾化器的喉舌 被安装在TSI口处。确保所有部件适合，以避免任何真空损失。

TSI的真空泵开始运行，以确保均匀的气流。30秒后雾化器开始启动和开 始时间被记下。刚好有5分钟后，雾化器停止。在其关闭后，该泵被允许运行 另外30秒之。较上的冲击室模拟喉和上呼吸道，较低的冲击室模拟肺泡。

甲醇被用来作为漂洗溶剂，冲击腔室的上部和下部的内容被收集在适当的 标准容量瓶。20%的DMSO溶液被加入，以确保式（Ⅰ）化合物的溶解。最终 容量瓶的体积由甲醇补充。用六个批次的制剂重复上述实验和两批未配制的式 Ⅰ化合物。

样品在几种浓度被进行了评估，开始从：

0.5mg的式Ⅰ化合物在5mL实施例9方法A的制剂-样品1；

1mg的式Ⅰ化合物在5mL实施例9方法A的制剂-样品2；

2.5mg的式Ⅰ化合物在5mL实施例9方法A的制剂-样品3；

5mg的式Ⅰ化合物在5mL实施例9方法A的制剂-样品4；及

100μg/mL未配制的式I化合物（只有式I化合物）-样品5。

这项研究是为了了解在体外药沉积浓度的影响。研究进一步继续为了估计 雾化过程的药物（式I化合物）的损失量，因此在雾化器杯留下。

沉积在TSI冲击室上部和下部的式I化合物被HPLC使用梯度泵和自动进样 器分析。表9提供HPLC分析中使用的色谱条件。

表9

100μg/mL的式Ⅰ的化合物（2.5mg的式Ⅰ化合物溶解在20%DMSO的甲醇 中）被作为参考标准。

参考标准在HPLC被注射6次，峰面积被指出。标准的六次注射的相对标 准差为2.0%以下。样品在HPLC上被重复注入，用于计算的峰面积的平均值被 考虑。

结果：

表10给出在TSI撞击器的上部和下部中由各种样品沉积的式I化合物的百 分比。

表10

（Ｂ）表11给出式Ｉ化合物在雾化杯中的损失（在雾化过程中）量。

表11

观察：

当以1mg/mL和2.5mg/mL的浓度雾化时，制剂沉积引入到雾化杯中的初 始式Ｉ化合物量的16%和10%。式Ｉ化合物的最小抑制浓度在0.125μg/mL 至5μg/mL的范围内（PCT申请公布WO2011027290）。式Ⅰ化合物沉积的量是 足够的，高于在体外模型的最小抑菌浓度。结果表明，1mg/mL和2.5mg/mL式 Ⅰ化合物制剂的浓度可能是需要的浓度来在体内研究来加以评价。在浓度低于 1mg/mL，式Ⅰ化合物沉积的百分比较高，但数量并不显著，而在浓度为5mg/mL， 显著量的式I化合物被保留在雾化器杯，导致式Ⅰ化合物的浪费。

结论：

结果清楚证明实施例9方法A的制剂能够沉积显著量的式I化合物在体外 肺模型的TSI中，然而没有制定的式I化合物没有在雾化的TSI中沉积。因此， 实施例9方法A的制剂可以用于吸入为基础的式Ⅰ化合物的给药。

微粒制剂的生物学评价

体外实验

实施例17

微生物检测

该实验基于参考文献进行；Nathan P et al，1978，Laboratory Methods for  Selection of Topical antimicrobial Agents to treat infected Burn Wounds，Burns4: 177-187.

（A）实验中使用的细菌测试模型

金黄色葡萄球菌209P（MSSA）

金黄色葡萄球菌ATCC33591（MRSA）

屎肠球菌R-2（VRE）

（B）接种物的制备

离心管中的培养菌划线出现在TSA斜面，并在37°C培养18～24小时。使 用生长在斜面上的生理盐水悬浮液被之辈，在560nm处，光密度调整至0.3个 单位(～10⁸CFU/ml)。

（C）样品制备

实验中测试的样品是：

（i）样品1：实施例9方法B的制剂的未过滤的悬浮液。

（ii）样品2：实施例9方法B的制剂的过滤的悬浮液（通过0.22μm过滤 器过滤后）。

（iii）样品3：样品用甲醇破坏方法制备：样品2与相等体积的甲醇混合， 并温育1小时。该溶液的稀释液在甲醇中制备和用于释放式 Ⅰ化合物的功效评价。

（iv）样品4：没有制定的式I化合物（式I化合物以1:80比率溶解在甲醇 氯仿中）。

样品1，2，3和4的在实验中评估的浓度为：100,50,25,12.5,6.25,3.125,1.56, 0.78,0.39和0.195μg/mL。

（D）实验步骤：

40μL从方法（B）得到的测试培养菌的接种物悬浮液被放入在100mL容量 的无菌锥形瓶中的各个40mL的熔化TSA对接（保持在38℃到39℃）并且为了 均匀混合而涡旋。种子对接被倒入培养皿（150mm外径）允许他们设置为约30 分钟。为完成设定板被保持在4℃至8℃。从设定的介质冲压出所需数量的孔（直 径6mm）。50μL的试样1，试样2和试样3被加入板中的相应的孔。该板在低 温度（2℃-8℃）预孵育约30分钟，以允许扩散。然后将该板在37℃下孵育18 至24小时。20μg/mL的万古霉素被用作标准抗生素。各种样品的活性的结果被 解释为以mm为单位的抑制区的大小。

结果：

样品3表现出明显的区域从100μg/mL到0.78μg/mL，样品4表现出明显的 区域从100μg/mL到0.39μg/mL。样品2的活性（相对于区域大小）比样品1好， 样品2在12.5μg/ml显示清楚的抑制区域，而样品1在25μg/ml显示清晰区域。

在样品3的情况下，式I化合物的区域大小小于未经配制的式Ⅰ化合物（样 品4）的区域大小。这可能是由于从脂质制剂的式Ⅰ化合物的缓慢释放。

结论：

从实施例9方法B（样品3）的制剂释放的式I化合物的活性与未制定的式 I化合物（样品4）是可比的，因此可进行体内测试和评价。

实施例18

在体外细胞相容性实验

实验依据参考文献Journal of Biomedical Materials Research,2009,89A, 281-292而进行。

进行实验来评估实施例9方法A的制剂与监管机构制定的相关细胞系和标 准细胞的细胞相容性。

评估的细胞系：

MRC5（肺成纤维细胞系）

A549（从恶性肿瘤分离出的II型肺泡细胞系）

L929（小鼠成纤维细胞，是一个ASTM标准）

实验细节：

细胞密度:10,000/孔对于MRC5和L292,3000/孔对于A549

时间点：24小时和48小时。

评估的浓度：

1,0.7,0.3,0.1mg/mL的实施例9方法B的制剂的微粒-样品1

0.3,0.1mg/mL没有式I化合物微粒，DPPC-样品2

0.1,0.01mg/mL只有式I化合物-样品3

步骤：

使用由Promega公司的CellTiter96含水一种溶液实验来进行毒理学评价。 该实验是用于确定增殖或细胞毒性实验中存活的细胞数目的标准比色法。在测 定中使用的MTS被细胞生物还原成有色的甲臜产物，其在组织培养基中是可溶 的。量为490nm的吸光度测定的甲臜产物的数量与在培养的活细胞的数目成正 比。

简言之，细胞株接种于96孔板中的三重峰，并使其附着和增殖超过24小 时。细胞黏着24小时后，该化合物被加入。细胞接种48小时后，用100μL的 新鲜培养基更换培养基，实验被终止，加入20μLCellTiter96含水一种溶液 （Promega,Cat.no:G3582）。一个成立于三重“无细胞”控制含100μL的培养 基和20μL的“一种溶液”也保持实验控制。板被孵育30分钟至4小时为颜色 发展。ELISA的96孔板然后用96孔平板读数器在490nm处（450-540nm）进 行吸光度记录。从“无细胞”的控制的平均490nm处的吸光度被减去从所有其 他的吸光度值，校正后的吸光度被用于进一步的计算。（培养4小时后，从“无 细胞”控制的背景吸光度通常是0.2至0.3吸光度单位）

结果：

在样品1存在下评价的所有细胞系的生活力是98%以上。细胞系的形态是 不变的，单层汇合被呈现。这表明，在评估的浓度样品1中在基于细胞的实验 中没有表现出任何毒性。然而，在其未配制形式的式Ⅰ化合物显示出细胞毒性， 在所有的不同评价的细胞系。因此，该制剂具有一个限制毒性的附加优点，由 式（Ⅰ）化合物表现。其结果总结于表12中。

表12

结论：

样品3具有的潜力会导致或表达在体内的不利影响和毒性。然而，样品1 包括DPPC的使用，式I化合物的毒性潜力被掩蔽和在无毒性下生物效能被观察 到。

实施例19

在体外巨噬细胞吞噬试验

在参考Respiratory Research，2009，10，44的基础上进行该试验。

大鼠肺泡巨噬细胞的分离和培养：

在适当的道德许可后，老鼠的支气管肺泡冲洗液被采用。无菌的温热生理 盐水被导入肺，然后通过抽吸除去。支气管肺泡灌洗液被以冰袋运输（通常需 要100至200毫升的每个供体的支气管肺泡灌洗液）。液体在250g进行离心10 分钟及细胞被收集。在总共10毫升的HBSS中通过重悬细胞获取细胞颗粒。取 出100μL等分试样，用Wright-Giemsa染色做差分细胞计数染色。细胞计数被 调整及接种的细胞在巨噬细胞培养基中（HAM F12培养基，Amimed，瑞士）。 0.5mL的细胞悬浮液被加入到具有0.5mL巨噬细胞培养基的6孔组织培养板中 的每个。在37℃和5%CO₂中，细胞被培育24小时。细胞的粘附和细胞的生长 被酸性桃红染料标记的实施例9方法A的制剂所评价和治疗。治疗后的细胞为 荧光被评价。肺泡巨噬细胞选择性吸收制剂的荧光结果。

结果：

从1小时的治疗后，实施例9方法A的微粒制剂被肺泡巨噬细胞选择性的 接纳。染料显示在3个小时强度逐渐饱和。这表示活性摄取和一个摄取的饱和 点。结核分枝杆菌在肺泡巨噬细胞的居住和生存，通过设计的实施例9方法A 的制剂，很明显式I化合物不仅到达巨噬细胞，而且被它们接纳，这是理想的在 体内治疗成功。

实施例9方法A的制剂被积极由巨噬细胞（化合物浓度减少）接纳（化合 物的浓度逐渐增加）和代谢，从表12中的值看是显而易见的。游离的药物（式 I化合物）不显示活性摄取（从游离的药物的饱和浓度看是显而易见的）。

表12

结论：

当式Ｉ化合物被开发为脂质基础的微粒制剂时，被肺泡巨噬细胞积极吸纳， 这是治疗的目的。该疗法有可能积极达到的目标和有关的细胞。

体内实验

在实验中使用的动物被饲养和照顾遵照印度泰米尔纳德邦CPCSEA公布的 强力指导方针。使用实验室动物的程序由印度，孟买，戈尔甘的Piramal生命科 学有限公司的IAEC批准。

实施例20

肺部沉积的研究

试验报告在AAPS杂志，2005，7(1)，E20-E41。

依照提及的参考，进行了一个体内肺部沉积研究的实验。豚鼠被分为三组。 1组接受了实施例9方法Ａ的制剂，2组接受没有制定的式Ｉ化合物，3组没有 被治疗（天然组）。雾化吸入10毫克/公斤的制剂，并让动物被动呼吸。依照实 施例9方法Ａ的制剂的给药，动物在30分钟点被处死。肺组织被收集并通过 HPLC分析。HPLC条件如表13所示

表13

所得结果列于表14。

表14

组 沉积的式Ｉ化合物(ng/g) 组1 320±0.05 组2 0 组3 0

观察：

在雾化状态，未制定的式Ｉ化合物不能到达肺部。实施例9方法A的制剂 能通过被动呼吸到达肺部。动物的进一步接触将导致在肺部更高水平的式I化合 物。

结论：

实施例9方法Ａ的制剂能够到达肺部。

实施例21

实施例9方法A的制剂的肺生物利用度的测定。

依照提及的参考，进行了只鼻部接触体内肺沉积研究。豚鼠被分为两组。1 组收到未制定的式Ⅰ化合物（3mg/kg），2组收到实施例9方法Ａ的制剂 （3mg/kg）。未制定的式Ｉ化合物和实施例9方法Ａ的制剂被雾化，使用喷射式 喷雾器进行只鼻部暴露，其中，雾化时间是一个小时。遵从气雾剂给药，在1 小时，2小时，6小时，12小时和24小时气雾剂接触后，动物被处死，肺部被 收集和分析，以定量分析通过LC-MS沉积在肺部的式Ⅰ的化合物的量（ng/g）。 LC-MS条件指定如下：

表15

色谱条件：

表16

源/气体参数：

表17

MS-MS参数：

所得结果列于表18。

观察：

在喷雾疗法中，未制定的式I化合物不能到达肺部。实施例9方法A的制 剂能够到达肺部并且被保留24小时。

结论

实施例9方法A的制剂能够克服未制定的式I化合物的生物利用度差分布。 此外，实施例9方法A的制剂的肺部保留分布也可以使其适应一天一次的吸入。

实施例22

在给药5天，每天一次，1小时/天的雾化曝光期后，渐增的实施例9方法A 的制剂的累积的评价

实验报道于AAPS杂志，2005,7(1),E20-E41。

依照提及的参考进行只鼻部暴露体内肺部沉积研究。豚鼠被分为两组。1组 接受未制定的式I化合物（3mg/kg），2组接受实施例9方法A的制剂（3mg/kg）。 未制定的式Ｉ化合物和实施例9方法Ａ的制剂被雾化，使用喷射式喷雾器进行 只鼻部暴露，其中，雾化时间是连续五天每天一小时，动物在第6天被处死。 肺部被收集和分析，以定量分析通过LC-MS沉积在肺部的式Ⅰ的化合物的量 （ng/g）。LC-MS条件如实施例21中的表15，16和17所提供。

所得结果列于表19。

组 沉积的式I化合物(ng/g) 组1 1 组2 885.59

观察：

在喷雾疗法中，未制定的式I化合物不能到达肺部。实施例9方法A的制 剂能够到达肺部并且保留24小时，在5天每天慢性暴露后，也呈现式I化合物。

结论：

肺部保留式I化合物作为制剂（实施例9方法A的制剂）5天的能力能作为 5天喷雾疗法作为一个治疗方案。

实施例23

评估实施例9方法A的制剂的剂量安排

实验报道于AAPS杂志，2005,7(1),E20-E41。

依照提及的参考，进行了只鼻部接触体内肺沉积研究。豚鼠被分为三组。1 组收到未制定的式Ⅰ化合物（3mg/kg），2组收到实施例9方法Ａ的制剂（3mg/kg） 一天一次进行一天，3组收到实施例9方法Ａ的制剂（3mg/kg）一天两次进行一 天。未制定的式Ｉ化合物和实施例9方法Ａ的制剂被雾化，使用喷射式喷雾器 进行只鼻部暴露。动物被处死以及肺部被收集和分析，以定量分析通过LC-MS 沉积在肺部的式Ⅰ的化合物的量（ng/g）。LC-MS条件如实施例21中的表15， 16和17所提供。

所得结果列于表20。

组沉积的式I化合物(ng/g) 组10 组2361.89 组31210.8

观察：

在喷雾疗法中，未制定的式I化合物不能到达肺部。实施例9方法A的制 剂能够到达肺部，当剂量一天增加一倍，肺部吸收的式I化合物的量将增加。