参与光合组织中基因表达调控的DNA

摘要

本发明提供了基因表达调控性DNA，其具有以成熟叶特异性方式启动基因表达的活性。提供了以下内容：具有以成熟叶特异性方式启动基因表达之活性的基因表达调控DNA，其包含以下(a)至(d)中的任何一种：(a)由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的DNA；(b)由在SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中具有一个或多个核苷酸的缺失、替换、添加或插入的核苷酸序列组成并且具有以成熟叶特异性方式启动基因表达之活性的DNA；(c)由与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列有90％或更高序列同一性的核苷酸序列组成并且具有以成熟叶特异性方式启动基因表达之活性的DNA；和(d)在严格条件下与由互补于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列之一部分或全部的序列所组成的DNA杂交并且具有以成熟叶特异性方式启动基因表达之活性的DNA。

说明书

技术领域

本发明涉及具有以光合组织特异性方式(特别是成熟叶特异性方式) 启动基因表达之活性的基因表达调控性DNA及其用途。

背景技术

生物体的遗传信息通过被称为“中心法则(central dogma)”的一系 列过程进行传递，其中功能性基因的DNA信息转录为mRNA，通过 mRNA信息的翻译合成功能性蛋白质。从而表达生物学功能。基因组DNA 是由亲本单倍体的组合而形成的遗传信息的聚集体。另外，对于植物，基 因组DNA一般记载了包含所述DNA的细胞以及来源于此细胞的植物的 特性。

为了以正确方式通过细胞中所含基因组DNA的功能性遗传信息传递 来诱导生物学功能的表达，必须在适当位点适当时间并且以适当强度诱导 适当基因的表达。因此，需要严格调控特定基因的表达。例如，对于存在 于植物的叶中并且参与气孔形成的基因，需要所述基因在合适的时间表达 于合适的组织中以形成气孔。

对于功能性基因的表达，所述基因5’上游区中存在的基因表达调控性 DNA调控表达的时间、位点和强度。

近年来，由于使用拟南芥(Arabidopsis thaliana)、稻米等对基因组 DNA进行了破译，所以这些植物各个功能性基因的基因表达调控性DNA 已变得可以容易地获得(非专利文献1和2)。

与此同时，甘蔗(一种易于获得的作物)的基因组DNA仍未被破译。 因此，得到甘蔗各个功能性基因的基因表达调控性DNA并不容易。迄今 为止，为了将基因引入甘蔗中，已使用了来自非甘蔗植物的基因表达调控 性DNA来调控转基因的表达(非专利文献3和4)。

但是，当使用非甘蔗植物的基因表达调控性DNA在甘蔗中诱导功能 性基因表达时，观察到在一些情况下无法严格地调控表达的时间、位点、 强度和其他条件。因此，相关领域期望获得来源于甘蔗的基因表达调控性 DNA，特别是组织特异性基因表达调控性DNA。

引用列表

非专利文献

NPL1：Nature，2000，408：769-815

NPL2：Science，2002，296：92-100

NPL3：Plant Mol Bio1.1992，Feb；18(4)：675-89

NPL4：Planta，1998，206：20-27

发明内容

技术问题

因此，本发明的一个目的是提供基因表达调控性DNA，其具有以光 合组织特异性方式启动基因表达的活性。

问题的解决方案

作为为了实现以上目的而进行的深入研究的结果，本发明人发现在甘 蔗成熟叶中强烈表达的基因的5’上游区中具有以成熟叶特异性方式启动 基因表达之活性的基因表达调控性DNA。这导致了本发明的完成。

具体地，本发明涵盖以下特征{1}至{4}。

{1}具有以成熟叶特异性方式启动基因表达之活性的基因表达调控 性DNA，其包含以下(a)至(d)中的任何一种：

(a)由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的DNA；

(b)由在SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中具有一个或多个核苷酸的 缺失、替换、添加或插入的核苷酸序列组成并且具有以成熟叶特异性方式 启动基因表达之活性的DNA；

(c)由与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列有90％或更高序列同一性的 核苷酸序列组成并且具有以成熟叶特异性方式启动基因表达之活性的 DNA；和

(d)在严格条件下与由互补于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列之一部 分或全部的序列所组成的DNA杂交并且具有以成熟叶特异性方式启动基 因表达之活性的DNA。

{2}重组载体，其包含根据{1}所述的基因表达调控性DNA。

{3}经转化植物，其通过使用根据{2}所述的重组载体转化而得到。

{4}经转化植物，其由经转化的植物细胞得到，所述转化通过使用根 据{2}所述的重组载体的植物细胞转化进行。

日本专利申请No.2010-293580(本申请的优先权文件)的说明书和/ 或附图所公开内容的一部分或全部通过引用并入本文。

发明的有利效果

根据本发明，可提供以下内容：具有以成熟叶特异性方式启动基因表 达之活性的基因表达调控性DNA；包含所述DNA的重组载体，其可引起 功能性基因以成熟叶特异性方式表达；以及用所述重组载体转染的经转化 植物。

附图简述

图1示出来源于白甘蔗(Saccharum officinarum)的ecc0002 EST的核苷酸序列(使用DFCI甘蔗基因指数(Sugarcane Gene Index) 检索)。

图2示出甘蔗属栽培变种NiF8(Saccharum spp.hybrids cv. NiF8)各个组织的ecc0002EST表达水平分析的结果。将对于成熟叶所确 认的最强表达水平指定为100％。

图3示出在5’和3’端分别插入HindIII限制酶识别序列和BlnI 限制酶识别序列的ecc0002基因之基因表达调控区的核苷酸序列。

图4-1示出使用启动子分析工具鉴定的ecc0002基因之基因表 达调控区中的预测启动子区。

图4-2(续接图4-1)。

图5示意性地示出包含彼此连接的ecc0002基因之基因表达调 控区和β-葡糖醛酸糖苷酶基因的基因表达载体。

图6示出转基因甘蔗各个组织的GUS基因表达水平分析的结 果，其中β-葡糖醛酸糖苷酶的基因表达受ecc0002基因的表达调控性DNA 调控。将对于转基因甘蔗成熟叶所确认的最强表达水平指定为100％。

实施方案的描述

以下详细描述本发明。

首先，描述了本发明的具有以成熟叶特异性方式启动基因表达之活性 的基因表达调控性DNA。本发明的基因表达调控性DNA包含以下(a)至(d) 中的任何一种：

(a)由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列组成的DNA；

(b)由在SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中具有一个或多个核苷酸的 缺失、替换、添加或插入的核苷酸序列组成并且具有以成熟叶特异性方式 启动基因表达之活性的DNA；

(c)由与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列有90％或更高序列同一性的 核苷酸序列组成并且具有以成熟叶特异性方式启动基因表达之活性的 DNA；和

(d)在严格条件下与由互补于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列之一部 分或全部的序列所组成的DNA杂交并且具有以成熟叶特异性方式启动基 因表达之活性的DNA。

本发明的基因表达调控性DNA可通过以下方式得到：通过使用来自 各个甘蔗组织(茎、成熟叶、幼叶等)的总RNA或来自这些RNA的cDNA 的基因表达分析得到以成熟叶特异性方式表达的候选基因；评价所述候选 基因的表达特征；基于评价结果指明被评价为以成熟叶特异性方式表达的 基因；以及基于相关所指明基因的cDNA或基因组DNA鉴定每个候选基 因5’上游区的核苷酸序列。本文中，可使用本领域技术人员众所周知的穷 尽性(exhaustive)基因表达分析技术(例如DNA芯片法和差异显示法) 进行基因表达分析。

特别地，SEQ ID NO：1的核苷酸序列存在于基因(下文称为 “ecc0002”)的5’上游区，其在成熟甘蔗叶中特异性表达。本文所述的“甘 蔗”植物的实例包括(但不特别限于)属于甘蔗属的植物，例如白甘蔗 (Saccharum officinarum)、中国竹蔗(Saccharum sinense)、细秆甘蔗 (Saccharum barberi)、大茎野生种(Saccharum robustum)、割手密 (Saccharum spontaneum)、肉质花穗野生种(Saccharum edule)和甘蔗 属杂交栽培变种NiF8；以及属于与甘蔗属/甘蔗种密切相关的属/种的植 物，例如高粱(Sorghum)。其中，优选甘蔗属杂交栽培变种NiF8。

用于分离所述5’上游区中存在的DNA的方法无特别限制。DNA分 离可通过本领域技术人员众所周知的方法进行。例如，DNA可通过常规 已知方法分离，所述方法包括基于ecc0002基因的核苷酸序列(SEQ ID  NO：2)克隆未知区域(即，上述情况的5’上游区)。在这样的方法中， 使包含ecc0002基因5’上游区的基因组DNA经历限制酶处理以使得由预 定核苷酸序列组成的接受体(adopter)与所述DNA连接。为ecc0002基 因和接受体的核苷酸序列指定引物，然后进行PCR。因此可扩增毗连 ecc0002基因核苷酸序列5’上游区的未知核苷酸序列。在确定扩增的核苷 酸序列之后，基于确定的核苷酸序列设计另一对引物。

因此，可以以类似方式扩增毗连所确定的核苷酸序列的另外未知核苷 酸序列。该方法可使用可商购克隆试剂盒如RightWalk(注册商标)试剂 盒(BEX Co.，Ltd.)进行。或者，除以上之外可建议使用反向PCR的方 法。在这种情况下，基于ecc0002基因的核苷酸序列信息设计一对引物。 使用该引物对和通过用某些限制酶处理和自身连接所得到的基因组DNA 片段进行PCR。因此，可扩增ecc0002基因的上游区。此外，可建议另 一种用于从基因组DNA文库中分离ecc0002基因上游区的方法。在这种 情况下，使用包含ecc0002基因的cDNA作为探针来筛选已通过标准方法 制备的基因组DNA文库以获得包含ecc0002基因的基因组DNA。然后， 测定通过筛选得到的基因组DNA的核苷酸序列。因此，可指明ecc0002 基因上游区中存在的5’上游区。此外，可通过PCR或其他方式扩增仅仅 所述5’上游区。

如上所述，依次扩增或筛选位于ecc0002基因上游的未知核苷酸序列 用以通过标准方法测定核苷酸序列。因此，可指明SEQ ID NO：1所示的 核苷酸序列。在测定了SEQ ID NO：1所示核苷酸序列后，使用提取自甘 蔗的基因组DNA作为模板和基于SEQ ID NO：1所示核苷酸序列设计的 引物通过PCR得到SEQ ID NO：1所示核苷酸序列就变得可能。

SEQ ID NO：1所示核苷酸序列作为能够以成熟叶特异性方式诱导基 因表达的基因表达调控区起作用。基因表达调控区包含参与基因转录控制 的核苷酸序列，例如启动子区、增强子区、TATA盒和/或CAT盒(但是 所述区的内容不特别受限于此)。

本文使用的术语“特异性”指以下情况：基因表达诱导型功能(gene  expression inducible function)仅存在于作为构成植株的各个组织之一的 成熟叶组织中；以及成熟叶组织中的基因表达诱导型功能显著的或统计上 显著的(例如约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍 或更多倍)高于非成熟叶的组织(例如幼叶、茎髓(stalk pith)、茎表皮 (stalk epidermis)、根或分生组织)中的基因表达诱导型功能。

本文使用的术语“成熟叶(组织)”指包含细胞中积聚的用于光合作 用的叶绿体并因此带有绿色的叶(组织)。它还表示除不含用于光合作用 的叶绿体的幼叶(组织)之外的叶(组织)。

可通过本领域技术人员众所周知的报告基因测定(reporter assay)或 类似测定来确定基因表达诱导型功能。基于报告基因测定制备载体，其中 多种报告基因(例如β-葡糖醛酸糖苷酶基因(beta-glucuronidase gene， GUS)、萤光素酶基因(luciferase gene，LUC)和绿色荧光蛋白基因(green  fluorescent protein，GFP))与待研究基因表达诱导型功能的核苷酸序列 之下游区连接，使得所述报告基因受所述核苷酸序列调控。使用所述载体 将基因引入(或瞬时基因引入)宿主基因组中。然后，测定每个报告基因 的表达水平。由此可确定基因表达诱导型功能。只要报告基因的表达水平 可检测，所述报告基因就没有具体限制。这样的报告基因的实例包括本领 域技术人员常规使用的报告基因，例如CAT基因、lacZ基因、萤光素酶 (下文表示为“LUC”)基因、β-葡糖醛酸糖苷酶(下文表示为“GUS”) 基因和绿色荧光蛋白(下文表示为“GFP”)基因。

可根据报告基因的类型通过本领域技术人员众所周知的方法测定报 告基因的表达水平。例如，如果报告基因是CAT基因，则可通过检查基 因产物对氯霉素的乙酰化来测定报告基因的表达水平。可通过以下技术测 定各个报告基因的表达水平。对于报告基因是lacZ基因的情况，检测由 基因表达产物催化作用诱导的染料化合物的显色。对于报告基因是LUC 基因的情况，检测由基因表达产物催化作用诱导的荧光化合物的荧光发 射。对于报告基因是GFP基因的情况，检测GFP蛋白质的荧光发射。例 如，如果报告基因是GUS，则GUS活性通过以下两种方法之一测定为宿 主细胞中的启动子活性：(i)涉及组织化学GUS染色的方法(EMBO J.6， 3901-3907(1987))和/或(ii)涉及使用荧光底物的Castle & Morris的方法 (Plant Molecular Biology Manual，B5，1-16(1994)；S.B.Gelvin & R.A. Schilperoort，Kluwer Academic Publishers)。此外，通过Bradford方法测 定蛋白质量(Anal.Biochem.72，248-254(1976))。基于蛋白质量将GUS 活性转化为单位为nmol4-MU/min/mg蛋白质。因此，对于每种情况都可 确认基因表达诱导型功能。

此外，如果将除以上之外的基因用作报告基因，则通过Northern杂 交、RT-PCR、DNA阵列技术等来测定基因转录水平。或者，通过电泳例 如SDS-PAGE、Western印迹等来测定由基因编码的蛋白质的表达水平。 因此，可确认基因表达诱导型功能。

本发明的基因表达调控性DNA不限于SEQ ID NO：1所示核苷酸序 列。如以上(b)中所述，它可以是在SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中具有 一个或多个核苷酸替换、缺失、添加或插入的核苷酸序列，只要它具有以 成熟叶特异性方式启动基因表达的活性。

例如，本发明的基因表达调控性DNA甚至包括在SEQ ID NO：1所 示核苷酸序列中具有1至100个核苷酸，优选1至50个核苷酸，并且更 优选1至10个核苷酸缺失、替换、添加或插入的核苷酸序列，只要它显 示出以成熟叶特异性方式启动基因表达的活性。

此外，本发明的基因表达调控性DNA不限于SEQ ID NO：1所示核 苷酸序列。如以上(c)所述，它可以是与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具 有80％或更多，更优选90％或更多，更优选95％或更多，并且最优选99％ 或更多序列同一性的核苷酸序列，只要它表现出以成熟叶特异性方式启动 基因表达的活性。核苷酸序列可通过众所周知的方法进行比较。可使用例 如BLAST(美国国家生物学信息中心(National Center for Biological  Information)的局部序列排列检索基本工具(Basic Local Alignment  Search Tool))基于默认设置进行比较。

此外，本发明的基因表达调控性DNA不限于SEQ ID NO：1所示核 苷酸序列。如以上(d)所述，它可以是在严格条件下与由互补于SEQ ID NO： 1所示核苷酸序列一部分或全部的序列所组成的DNA杂交的核苷酸序列， 只要它显示出以成熟叶特异性方式启动基因表达的活性。

本文中，术语“严格条件”指这样的条件：即在所述条件下形成特定 特异性杂交体，但从不形成非特异性杂交体。例如，这样的条件包括在包 含2至6×SSC(1×SSC组成：0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0) 和0.1至0.5％SDS的溶液中在42℃至55℃杂交，然后在包含0.1至0.2 ×SSC和0.1至0.5％SDS的溶液中在55℃至65℃洗涤。

而且，具有以成熟叶特异性方式启动基因表达之活性的本发明基因表 达调控性DNA可以是在SEQ ID NO：1所示核苷酸序列5’端和/或3’端具 有100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、 1300、1400或1500个或更多个连续核苷酸缺失的DNA片段，只要它表 现出以成熟叶特异性方式启动基因表达的活性。可通过本领域技术人员众 所周知的方法(例如PCR或限制酶处理)使核苷酸缺失。所述DNA片 段可以是本发明基因表达调控性DNA的启动子区。可使用本领域技术人 员众所周知的启动子分析技术(例如BioInformatics and Molecular  Analysis Section(http：//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)； Prestridge，D.S.(1995)，Predicting Pol II Promoter Sequences Using  Transcription Factor Binding Sites，J.Mol.Biol.249：923-32)检索预定基 因表达调控性DNA的启动子区。SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的此类片 段的实例是由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的第868位至第1118位核苷 酸组成的DNA。可通过以上的报告基因测定或类似测定来确认所得片段 是否具有基因表达诱导型功能。

确定了本发明基因表达调控性DNA的核苷酸序列后，通过化学合成、 使用基因组DNA作为模板的PCR、或使用具有所述核苷酸序列的DNA 片段作为探针的杂交来得到本发明的基因表达调控性DNA就变得可能。 另外，在SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中具有突变的核苷酸序列可通过 位点特异性诱变等方式来合成。可通过已知技术例如Kunkel法或缺口双 链体(Gapped duplex)法或基于其的方法将突变引入SEQ ID NO：1所 示核苷酸序列中。例如，通过使用定点诱变(例如Mutant-K或Mutant-G (二者都是TAKARA Bio的商品名))等的诱变试剂盒或LA PCR体外诱 变系列试剂盒(in vitro Mutagenesis series kit)(商品名，TAKARA Bio) 来引入突变。

接着，描述了重组载体，其包含以上具有以成熟叶特异性方式启动基 因表达之活性的基因表达调控性DNA。

可通过将包含与以上基因表达调控性DNA有效连接的期望功能性基 因的DNA引入适当载体中来构建本发明的重组载体。本文使用的术语“有 效连接”指这样的情况：上述载体包含彼此连接的基因表达调控性DNA 和功能性基因使得在经以上载体转化的宿主细胞中功能性基因在基因表 达调控性DNA调控下正确表达。本文中，“连接”可以是直接连接或通 过适当长度和适当序列的间隔子(spacer)间接连接。用于本发明的载体 的优选实例包括pBI载体、pBII载体、pPZP载体(Hajdukiewicz P，Svab  Z，Maliga E：The small，versatile pPZP family of Agrobacterium binary  vectors for plant transformation.，Plant Mol Biol.，25：989-94，1994)、 pCAMBIA载体(http://www.cambia.org/main/r_et_camvec.htm)和pSMA 载体，通过所述载体可使用农杆菌(Agrobacterium)将功能性基因引入 植物中。特别优选地，使用pBI和pBII双元载体(binary vector)或中 间载体。这样的载体的实例包括pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3、 pBII221和pIG121。双元载体是可在大肠杆菌和农杆菌中复制的穿梭载 体。当植物感染包含双元载体的农杆菌时，载体上存在的对应于边界序列 (border sequence)(LB序列和RB序列)之间区域的DNA可合并到植 物的核DNA中(EMBO Journal，10(3)，697-704(1991))。同时，使用pUC 载体可将基因直接引入植物中。PUC载体的实例包括pUC18、pUC19和 pUC9。此外，可使用植物病毒载体，例如花椰菜花叶病毒(cauliflower  mosaic virus，CaMV)、菜豆金黄花叶病毒(bean golden mosaic virus， BGMV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)。

为了有助于连接和/或插入载体中，可通过限制酶识别序列的替换、 插入或添加来适当修饰包含基因表达调控性DNA的DNA和/或包含功能 性基因的DNA。对于插入载体中，可使用例如包括以下的方法：用适当 的限制酶切割包含基因表达调控性DNA和/或功能性基因的纯化DNA， 然后将每个所得片段插入适当载体DNA的限制酶识别位点或多克隆位点 以与所述载体连接。

术语“功能性基因”指目标植物的任意内源基因或期望引起基因产物 在成熟叶中表达的任意外源基因。这样的基因的实例包括但不限于光合作 用相关基因、易位(translocation)相关基因、能够产生有用物质(例如 药物、染料或芳香成分)的基因、糖代谢相关基因、具有疾病/昆虫抗性 (例如昆虫损伤抗性、霉菌(真菌)和细菌疾病抗性、或病毒(疾病)抗 性)的基因、环境压力(例如低温、高温、干燥、光损伤(photolesion) 或紫外线)抗性相关基因和植物生长调控(启动/抑制)基因。

如果需要，则可将增强子、内含子、聚A加尾信号(poly-A addition  signal)、5’-UTR序列、选择标记基因等连接到载体中基因表达调控性 DNA和/或功能性基因的上游/下游或其之间。

增强子用于例如提高功能性基因表达的效率。其实例是包含位于 CaMV35S启动子上游之序列的增强子区。

终止子可以是可终止由以上启动子引起的基因转录的序列。其实例包 括胭脂碱(nopalin)合成酶基因终止子、章鱼碱合成酶基因终止子和 CaMV35S RNA基因终止子。

选择标记基因的实例包括潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、双丙 氨膦抗性基因、灭瘟素S抗性基因和乙酰乳酸合酶基因。选择标记基因可 以和功能性基因一起连接至如上所述的相同质粒以制备重组载体。或者， 可分开制备通过连接选择标记基因与质粒得到的重组载体和通过连接功 能性基因与质粒得到的重组载体。当它们分开制备时，用两种载体共转染 宿主。

可使用由此制备的重组载体产生转化体。

当制备转化植物时，可适当地使用已报道和建立的多种方法。这样的 方法的优选实例包括农杆菌法、PEG-磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法、 粒子枪(particle gun)法和显微注射法。对于农杆菌法，使用原生质体 或组织切片或使用植物自身(在植物中(in planta)方法中)。当使用原 生质体时，使用包括共培养具有Ti质粒的农杆菌与原生质体的方法或包 括使农杆菌原生质球(spheroplast)与原生质体融合的方法(即原生质球 法)。

当使用组织切片时，可使用包括用农杆菌感染目标植物的无菌培养叶 切片(叶盘)的方法、包括用农杆菌感染愈伤组织等的方法。此外，如果 采用使用种子或植物(不需要进行添加植物激素的组织培养的系统)的植 物中方法，则用农杆菌直接处理吸水种子、幼小植物(幼苗)、盆栽植物 等。

通过PCR法、Southern杂交法、Northern杂交法、Western印迹法 等可确认基因并入植物是否发生。例如，由转化植物制备DNA。设计DNA 特异性引物，然后进行PCR。PCR之后，使扩增产物经历琼脂糖凝胶电 泳、聚丙烯酰胺电泳、毛细管电泳等，然后用溴化乙锭、SYBR Green液 体等染色。然后，检测来源于扩增产物的单一条带。由此可确认转化的发 生。此外，可使用预先标记有荧光染料等的引物通过PCR检测扩增产物。

此外，还可进行包括使扩增产物与固相(例如微板)结合并通过例如 荧光或酶反应确认扩增产物的方法。

本发明用于转化的植物的实例包括但不限于属于禾本科 (Gramineae)、茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、豆科 (Leguminosae)、蔷薇科(Rosaceae)、菊科(Asteraceae)、百合科 (Liliaceae)、伞形科(Apiaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、葫芦科 (Cucurbitaceae)、旋花科(Convolvulaceae)和藜科(Chenopodiaceae) 的植物。其优选实例包括已从其中分离了上述基因表达调控性DNA的属 于禾本科的植物，包括甘蔗、稻米、大麦、小麦、玉米、结缕草、高粱、 粟、日本粟、象草(napier grass)和柳枝稷(switchgrass)。

本发明的经历转化的植物材料的实例包括根、茎、叶、种子、胚、胚 珠、子房、枝条顶端(植物芽尖端的生长点)、花粉囊、花粉等的植物组 织，此类植物组织的切片，未分化的愈伤组织，以及培养的植物细胞(例 如通过使以上实例经历酶处理以除去细胞壁从而得到的原生质体)。此外， 当采用植物方法时，可使用吸水种子和整个植物。

此外，本发明的经转化植物可以是整个植物、植物器官(例如根、茎、 叶、花瓣、种子或果实)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木 质部或维管束的组织)或植物培养细胞。

当使用植物培养细胞时，可通过用于由所得经转化细胞再生经转化植 物的已知组织培养方法再生植物器官或植物自身。本领域技术人员可容易 地进行这样的再生操作，只要常规已知的方法用作用于由植物细胞再生植 物的方法。可如下所述由植物细胞再生植物。

首先，当将植物组织或原生质体用作转化的目标植物材料时，在补充 有无机元素、维生素、碳源、用作能量来源的糖、植物生长调节剂(例如 植物激素，如植物生长素或细胞分裂素)等的无菌愈伤组织形成培养基中 培养以形成能够不定(adventitiously)生长的去分化愈伤组织(下文中称 为“愈伤组织诱导”)。将由此形成的愈伤组织转移至包含植物生长调节剂 (例如植物生长素)的新鲜培养基中以进行进一步生长(继代培养)。

在固体培养基(例如琼脂)上进行愈伤组织诱导。通过例如液体培养 进行继代培养。在这种情况下，可有效地并且大规模地进行每一培养。接 着，在用于诱导器官再分化的适当条件下培养通过上述继代培养生长的愈 伤组织(下文中称为“再分化诱导”)。这最终导致完整植物的再生。可通 过以下方法进行再分化诱导：确定待添加至培养基中的植物生长调节剂 (例如植物生长素或细胞分裂素)和不同组分(例如碳源)的类型和量， 然后以适当方式设定光、温度和其他条件。这种再分化诱导导致形成不定 胚、根、芽、茎叶等，然后进一步培养以获得完整植物。或者，例如，可 将再分化的产物维持在允许其变为完整植物的状态(例如胶囊化 (encapsulated)人工种子、干燥胚、或冻干细胞或组织)下。

根据本发明，术语“经转化植物”不仅表示转化后通过再分化得到的 作为第一代植物的“T1代植物”，还表示作为由T1代植物种子后续产生 的植物的“T2代植物”以及由通过药物选择、Southern分析等发现是转 基因植物的“T2代”植物的花自花授粉得到的后代植物，例如第三代(T3 代)植物。

由此产生的经转化植物以成熟叶特异性方式表达引入的功能性基因。

本发明的基因表达调控性DNA在植物(特别是甘蔗)中具有以成熟 叶特异性方式启动基因表达的活性。将期望的功能性基因与本发明的基因 表达调控性DNA连接并将连接产物引入植物中，从而使功能性基因在植 物中以成熟叶特异性方式表达。由此赋予植物以期望特性。本发明的基因 表达调控性DNA可适当地用于尚未针对其开发许多基因表达调控系统的 甘蔗。使用本发明的基因表达调控性DNA能够产生具有适于生物质资源 和其他应用之特性的转基因甘蔗。

实施例

下文参照以下实施例对本发明进行更详细的描述，但是本发明的技术 范围不限于此。

实施例1

成熟叶表达基因的克隆

使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)从甘蔗(甘蔗属栽培变种 NiF8)的成熟叶、幼叶和茎组织中提取并纯化总RNA。根据标准方法构 建cDNA文库并用于基因表达分析。使用甘蔗基因组阵列(Sugarcane  Genome Array)(Affimetrix)根据制造商说明书进行基因表达分析。

基因表达分析的结果是，发现了甘蔗属栽培变种NiF8成熟叶中以特 别高的水平表达的基因。将所述基因命名为“ecc0002”。来源于甘蔗属栽 培变种NiF8的ecc0002基因的核苷酸序列与图1所示来源于白甘蔗的 ecc0002EST的核苷酸序列相同。从甘蔗属栽培变种NiF8的成熟叶、幼 叶、茎髓、茎表皮、根和分生组织中提取并纯化总RNA。根据标准方法 制备cDNA。使用ABI7500实时PCR系统(Applied Biosystems)通过 SYBRGreen方法分析每个组织中的ecc0002基因表达水平。

图2示出结果(成熟叶中的最强基因表达水平指定为100％)。结果 表明甘蔗属栽培变种NiF8的成熟叶中强烈诱导ecc0002基因的表达。

实施例2

成熟叶特异性启动子的获得

使用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)从甘蔗(甘蔗属栽培变种 NiF8)的成熟叶组织(0.5g)中提取并纯化基因组DNA(约300ng)。使 用RightWalk(注册商标)Kit(BEX)基于实施例1中所得ecc0002的 核苷酸序列由以上基因组DNA得到位于ecc0002基因5’上游的基因表达 调控区。HindIII限制酶识别序列(AAGCTT)和BlnI限制酶识别序列 (CCTAGG)用作接头序列。

前者在所得基因表达调控区的5’端引入，而后者在基因表达调控区3’ 端存在的ecc0002基因翻译起始位点(ATG)的3’侧引入。由此制备了包 含ecc0002基因表达调控区的DNA(图3)(SEQ ID NO：3)。

使用众所周知的启动子分析工具(BioInformatics and Molecular  Analysis Section)(http：//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)分析以 上DNA序列。结果，推测能够作为启动子起作用的区域存在于包含第875 至第1125位核苷酸的区域中(图4-1和4-2)。

实施例3

基因表达载体的构建

(1)β-葡糖醛酸糖苷酶基因表达载体

构建了这样的基因表达载体：其包含与包含β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS) 基因的UidAcDNA连接的包含实施例2所得基因表达调控区的DNA。将 植物转化载体(pBII221)用于基因表达载体。为了将包含基因表达调控 区的DNA与UidAcDNA相连接，使编码UidAcDNA5’端侧第一甲硫氨 酸的ATG序列与编码包含基因表达调控区之DNA3’端侧存在的ecc0002 基因的第一甲硫氨酸的ATG序列匹配以连接(翻译融合型)。图5示意性 地示出所述基因表达载体。

实施例4

转基因植物的产生

使用农杆菌法将实施例3中产生的基因表达载体引入宿主植物(甘蔗 属栽培变种NiF8)中。由此产生了其中GUS基因表达受ecc0002基因的 表达调控性DNA调控的转基因甘蔗。

从转基因甘蔗的成熟叶、幼叶、茎髓、茎表皮、根和分生组织中提取 并纯化总RNA。根据标准方法制备cDNA。使用ABI7500实时PCR系统 (App1ied Biosystems)通过SYBRGreen方法分析每个组织中的GUS基 因表达水平。

作为对比，以上述方式分析其中GUS基因表达受花椰菜花叶病毒 (CaMV)35S启动子调控的转基因甘蔗成熟叶和幼叶中的GUS表达水 平以及转基因甘蔗分生组织中的GUS表达水平(对照)。

图6示出结果。各个组织的的表达水平表示为相比于在所分析的转基 因甘蔗组织中确认的成熟叶中最强GUS基因表达水平(其中GUS基因表 达受ecc0002基因表达调控性DNA调控)(指定为100％)的相对值。

以上结果表明ecc0002基因表达调控性DNA可以成熟叶特异性方式 诱导基因表达，其程度比受CaMV35S启动子调控的GUS基因表达水平 大约高17倍。

工业实用性

本发明的基因表达调控性DNA具有以成熟叶特异性方式启动基因表 达的活性。因为所述DNA具有这样的特征，所以其可用于产生具有期望 特性的植物，所述期望特性通过使期望基因以成熟叶特异性方式表达来实 现。

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