线粒体蛋白质翻译因子Guf1在雄性不育研究中的应用

摘要

本发明提供敲除Guf1基因的模式生物小鼠在研究雄性不育机理中的用途，更具体地，本发明提供针对Guf1基因敲除的小鼠模型在研究人类雄性生殖、精子发生过程和雄性不育机理和治疗中的用途，将有可能成为诊断雄性不育的一种诊断方法。

说明书

技术领域

本发明涉及线粒体蛋白质翻译因子Guf1在雄性生殖研究中的应用。 具体地，本发明提供敲除Guf1基因的模式生物小鼠在研究雄性不育过程 中的用途，更具体地，本发明提供针对Guf1基因敲除的小鼠模型在研究 人类雄性生殖、精子发生过程和雄性不育机理和治疗中的用途。

背景技术

目前，全球约有15%已婚夫妇受到不孕不育的困扰，而在男性不育中 弱精子症占19%，已成为影响男性生育力的常见病因。精子运动所需能量 主要来自线粒体呼吸链的氧化磷酸化。如果氧化磷酸化功能异常，酶活 性或表达量改变及线粒体DNA的变异等均可能导致线粒体能量合成障 碍，降低精子活力。1955年，Hoffman-Berling最早证明ATP是精子尾部运 动的能量来源，所以线粒体的结构和功能状态是评价精子质量的重要指 标之一。近年来线粒体结构和功能异常与精子活力低下的相关性已引起 关注。

线粒体是细胞进行有氧氧化的主要细胞器，细胞的各项生命活动几 乎都是由线粒体氧化磷酸化提供能量，而精子的运动需要大量的能量供 应，因此精子线粒体呼吸链的氧化磷酸化功能对维持精子正常活力具有 至关重要的作用，若其功能异常可能直接影响能量的产生与传递，导致 精子运动障碍。目前，国内外对线粒体呼吸功能和呼吸链能量代谢的研 究主要集中在一些高耗氧、能量需求大的组织器官，如肝脏组织、脑组 织、心肌组织等，这些高耗氧组织线粒体能量代谢障碍会引起膜电位下 降，ATP生成大大减少，影响组织器官的功能。而维持精子正常运动需 要大量的能量供给，因此对精子线粒体呼吸功能和呼吸链能量代谢的研 究就具有重要的意义。

LepA作为原核细胞蛋白质翻译延伸因子可以与核糖体结合引发 tRNA的反向转运，在体外能够增加蛋白质翻译的保真性。lepA的真核细 胞同源蛋白Guf1蛋白是非常保守的定位于线粒体基质的蛋白，有研究说 明Guf1蛋白突变的酵母细胞在低温条件下线粒体蛋白质合成速率减慢， 温度升高线粒体细胞色素c氧化酶活性降低，从而表明Guf1蛋白是线粒 体蛋白质合成过程中重要的保真因子。因此Guf1蛋白在高等动物体内的 功能研究尤其重要。

发明内容

我们的研究发现Guf1蛋白对于小鼠精子生成有重要意义。Guf1蛋白 敲除导致小鼠精子发生过程出现障碍，精子数目显著减少，精子运动能 力下降，进一步的研究发现这与睾丸的线粒体氧化磷酸化功能缺陷有 关。Guf1蛋白引起线粒体蛋白质翻译加速但是翻译产物保真性差导致其 降解加速有可能是线粒体氧化磷酸化功能障碍的一个重要原因。

我们首次发现在模式生物小鼠中Guf1蛋白对雄性生殖线粒体功能具 有重要的调控作用。Guf1蛋白编码基因的敲除可以使得小鼠生精障碍， 严重影响小鼠的精子发生和成熟，为研究雄性生殖的机理和治疗提供了重 要的靶点。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种获得雄性不育哺乳动物的方法，所述方法包括培育Guf1基因 被敲除的所述哺乳动物的雄性。

2.根据1所述的方法，其中所述哺乳动物是人或小鼠。

3.根据2所述的方法，其中所述哺乳动物是小鼠，所述Guf1基因的 序列如SEQ ID NO：1所示。

4.一种致使雄性哺乳动物不育的方法，所述方法包括使所述雄性哺乳 动物的Guf1基因表达异常。

5.根据4所述的方法，其中所述哺乳动物是小鼠，所述Guf1基因的 序列如SEQ ID NO：1所示。

6.Guf1基因作为致使雄性哺乳动物不育的靶点的用途。

7.根据6所述的用途，其中所述哺乳动物是小鼠，所述Guf1基因的 序列如SEQ ID NO：1所示。

8.用于检测哺乳动物的Guf1基因表达异常的试剂在制备用于检测所 述哺乳动物的雄性不育的诊断剂中的用途。

9.一种用于诊断雄性哺乳动物不育的试剂盒，所述试剂盒包含用于 检测所述哺乳动物的Guf1基因异常的试剂。

附图说明

图1：Guf1基因敲除的策略及PCR、蛋白免疫印迹检测；

图2：Guf1敲除的引起的雄性不育病理学分析；

图3：Guf1敲除增加精细胞凋亡，影响精子发生过程；

图4：Guf1敲除小鼠的睾丸和精子线粒体的透射电镜观察；

图5：Guf1蛋白对线粒体呼吸链复合物功能的影响；

图6：Guf1敲除对线粒体呼吸链复合物亚基蛋白的影响；

图7：Guf1敲除引起胞质翻译降低和mTOR信号通路降低；

图8：Guf1蛋白敲除对线粒体拷贝，转录和翻译的影响。

图9：人精子的保存及其基因组DNA的提取。

具体实施方式

实施例1、Guf1基因敲除的策略及PCR、蛋白免疫印迹检测。

为了研究Guf1蛋白在高等生物中的功能及其突变会对机体产生哪 些影响。我们选择小鼠这种模式生物，运用基因打靶技术将Guf1蛋白 进行敲除，并运用PCR和蛋白免疫印迹的方法对敲除的效率进行评价。 图1为Guf1蛋白敲除的策略以及PCR和蛋白免疫印迹检测敲除效率。 图1A表明Guf1的敲除策略图1B代表PCR鉴定的Guf1基因敲除小鼠 基因型。图1B代表western blot检测Guf1在小鼠组织中的敲除效率。 结果表明Guf1蛋白量在睾丸中显著减少，进一步证明该蛋白在小鼠中 被剔除掉。

具体方法：

Guf1基因敲除小鼠的获得：

Guf1打靶载体的构建：从含有鼠Guf1基因(Guf1基因的核酸序列如 SEQ.ID.NO.1所示)的129BAC（bMQ-420K22）克隆(购自Welcome Trust  Sanger Institute)中获得Guf1基因，如图1A所示。在该基因第二个至第 八个外显子两侧加入loxp位点(其序列为 GAATTCCTGCAGCCCAATTCCGATC)，同时在外显子8和外显子9之 间加入新霉素抗性基因(neo基因，序列如SEQ ID NO.2所示)进行下一 步的筛选。打靶载体的序列如SEQ ID NO.3所示。

胚胎干细胞阶段：打靶载体构建完成后，中体打靶质粒（约需准备 100ug）电转入同源的胚胎干细胞鼠129细胞(购自南京生物医药研究院) 中，使打靶载体上的Guf1基因与胚胎干细胞基因组发生同源重组，即 打靶载体上Guf1外显子1和外显子8与胚胎干细胞Guf1基因组上的相 同序列进行交换，进而将Guf1的外显子2至外显子8敲除。通过G418 和丙氧鸟苷正负筛选获得重组胚胎干细胞克隆，并进行PCR和southern  blot鉴定。

囊胚注射阶段：扩增正确中靶的ES cell克隆，显微注射到C57BL/6 小鼠（南京生物医药研究院）的囊胚中，并将此囊胚移植到代孕母鼠 C57BL/6（南京生物医药研究院）子宫内，产出8只雄性和2只雌性嵌合 鼠。7只雄性嵌合鼠与C57BL6小鼠杂交，生出20只杂合子小鼠 (Guf1^flox/+)。杂合子小鼠Guf1^flox/+雌雄合笼，产生后代，PCR鉴定获得 Guf1^flox/fox小鼠，与EIIa-cre小鼠（军事医学科学院）进行交配，获得 Guf1敲除型和杂合小鼠。

剪取和消化鼠尾：将Guf1基因杂合小鼠合笼，新生野生，杂合和敲 除型小鼠出生至18天左右时，离乳，分笼，准备好灭菌的剪刀、镊子、 EP管，酒精棉球。从新生小鼠尾部末梢减去0.5cm左右的一段，放入 EP管中。配制鼠尾消化液(20mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.4M氯化钠， 1%SDS，400μg/ml蛋白酶K)，取400μl加入到EP管中，55度消化过夜。

提取小鼠基因组：将小鼠消化液11000rpm离心5分钟，将上清倒入 到一新的EP管中，加入200μl饱和氯化钠，上下晃动200次，冰上放置 10分钟，14000rpm离心10分钟。将上清倒入至一新EP管中，加入800μl 无水乙醇，14000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀DNA室温晾干后，加入 50μl双蒸水。

PCR鉴定：合成PCR鉴定引物(上海生工合成)，引物序列如下：

Loxpt F2：5’TTTGTCCTAAATGCGTGGTG 3’

Loxpt R2：5’CCCGCTCCCTAATAAAGATG 3’

Frtt R2：5’CGATCCCTGTACTCAAGACC 3’

反应体系如下：

2x Taq mix：10μl

Loxpt F2：0.5μl

Loxpt R2(Frtt R2)：0.5μl

基因组DNA:1.5μl

RT-PCR扩增条件：变性-95度，5分钟；退火-60度，45秒；延伸 -72度，1分钟；循环次数：30次；最后延伸条件-72度，10分钟。PCR 样品进行琼脂糖胶电泳(胶浓度：1%)。

蛋白免疫印迹：将交配合笼PCR鉴定获得的6-8周龄野生型和Guf1 基因敲除小鼠断颈处死，取出心脏和睾丸组织，PBS漂洗。加入RIPA 裂解液1ml，放入组织研磨器研磨，匀浆液冰上放置30分钟，12000rpm 离心30分钟，上清用BCA试剂盒测定蛋白浓度。

配制15% SDS-PAGE胶，将已经测好蛋白浓度的样品，加上一定体 积的上样缓冲液,95度加热15分钟,取50μg蛋白加入到15% SDS-PAGE 胶中，100v恒压，跑3小时左右。

将胶上的蛋白样品转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1小时，然 后加入1:1000稀释的抗Guf1抗体(sigma)，孵育过夜。TBST洗膜5次， 每次5分钟。加入1:3000稀释的辣根过氧化酶标记的兔二抗（Jackson  ImmunoResearch），孵育1.5小时。TBST(150mM NaCl,20mM Tris-HCl, pH7.4,Tween-20 0.05%)洗膜三次后加入超敏ECL化学发光试剂(碧云天 公司)，放入暗盒中曝光。

实施例2、Guf1基因敲除引起的雄性不育病理学分析。

为了进一步研究Guf1的缺失会引起那些功能障碍，我们着重对 Guf1基因敲除小鼠的生殖进行病理学研究，包括后代数目，精子运动能 力，以及睾丸的病理切片和透射电镜分析。图2A代表后代数目分析， 表明雄性敲除型小鼠和正常雌鼠合笼后，有交配行为但不产生后代。图 2B统计野生型和Guf1敲除小鼠的精子数目，表明Guf1敲除小鼠精子 数目显著减少。图2C是睾丸形态观察，发现Guf1敲除小鼠的睾丸形 态变小。图2D是共聚焦荧光显微镜观察精子形态，发现敲除型精子线 粒体鞘有缺失，弯折现象，线粒体异常。

具体方法：

雄性生殖能力分析：分别取6-8周龄的20只野生型和Guf1敲除型 小鼠，每只小鼠与两只6-7周龄的CD1雌鼠合笼，每天早晨验栓，将有 阴栓的小鼠取出单独饲养，统计其后代数目，结果发现与野生型小鼠交 配的40只雌鼠，都见栓，只有两只没有后代，其余生出4-12只幼鼠。 而与敲除型小鼠交配的40只CD1雌鼠，见栓但没有后代。

精子数目统计：取6-8周龄野生和敲除型小鼠(n>3),断颈处死，用剪 刀取出附睾，放入装有磷酸盐缓冲液(PBS)的平皿中，用注射器将附睾扎 碎，血球计数板计数。

共聚焦荧光显微镜观察精子形态：取6-8周龄野生和敲除型小鼠 (n>3),断颈处死，用剪刀取出附睾，注射器将附睾扎碎，Hoechest和 Mitotracker(invitrogen)用PBS 1:10000稀释,共聚焦荧光显微镜观察精子。

实施例3、Guf1敲除增加精细胞凋亡，影响精子发生过程。

为了研究Guf1对于小鼠精子发生过程的影响，我们对野生型和Guf1 敲除雄鼠的生殖器官包括睾丸和附睾进行切片染色，以及精子运动能力分 析。图3A、C是敲除型附睾和睾丸的H&E染色，该结果表明敲除型小鼠附 睾中存在大量的未成熟精细胞。图3B是TUNEL检测睾丸和附睾中的凋亡 现象，表明Guf1敲除后会产生明显的凋亡现象。图3D、E是计算机辅助 精子分析(computer assisted sperm analyzer,CASA)对精子运动能力的 分析,结果表明敲除小鼠精子运动能力明显降低。通过以上对Guf1敲除的 病理学分析，发现Guf1敲除会引起精子发生障碍，导致雄性不育。

具体方法：

附睾和睾丸的H&E染色：

石蜡切片：取下野生型和Guf1基因敲除小鼠睾丸和附睾组织，放入 4%的过氟烷基化物(Polyfluoroalkoxy，PFA)中固定，以防止细胞死后的自 溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。

脱水透明：用由低浓度到高浓度的乙醇作脱水剂，逐渐脱去组织中的 水分。然后放于透明剂二甲苯中透明。

浸蜡包埋：将小盒中倒入已融化的石蜡，组织放于其中，冷却凝固。

切片与贴片：将包埋好的蜡块放于切片机中，切成薄片，5-8μm，薄 片放到42度的热水中展片，贴到载玻片上，放于恒温箱中烘干。

脱蜡染色：染色前，将烘干的石蜡切片放于二甲苯中脱去石蜡，再经 由高浓度到低浓度乙醇，最后加入到蒸馏水。片子放于苏木精水溶液中染 色几分钟，流水冲洗1小时后加入蒸馏水片刻，入70%和90%酒精中脱水 各10分钟。加入伊红染色液染色2-3分钟。

脱水透明：染色后切片经不同浓度的乙醇脱水，再经二甲苯使切片透 明。

封固：将透明好的切片滴上树胶，盖上盖玻片封固。

TUNEL细胞凋亡检测：

制作睾丸和附睾的石蜡切片，切片用二甲苯浸洗2次，每次5分钟。 将透明好的片子放于梯度乙醇(100%，95%，90%，80%，70%)各浸洗1 次，每次3分钟。片子PBS洗涤2次。用蛋白酶K工作液处理组织20 分钟。之后PBS洗涤2次。制备TUNEL反应混合液，50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀。片子干后加入50μl TUNEL反应混合液， 在暗湿盒中37度反应1小时。PBS漂洗3次。拍照。

计算机辅助精子分析(CASA)评价精子各项运动参数：取6-8周龄野生 型和敲除型小鼠各4只，将其附睾取出，精子置于37度水浴，计数池放 分析仪恒温板上预温，精子标本液化后取混匀样本精液1滴滴在样品池中 间，然后进行分析。采用中科计算机辅助精液分析软件(中科院动物所)， 对精液主要参数即精子活动力、及精子平均曲线运动速度(VCL)、平均直 线运动速度(VSL)、平均路径运动速度(VAP)、平均鞭打频率(BCF)等进行 分析。

实施例4、Guf1敲除小鼠的睾丸和精子线粒体的透射电镜观察。

以前研究表明，Guf1是定位于线粒体的蛋白。为了研究Guf1蛋白对 线粒体功能的影响，我们对Guf1敲除小鼠的生殖器官的线粒体结构和功 能进行研究。图4为Guf1敲除对小鼠睾丸和精子线粒体形态的影响。图 4A、C分别代表Guf1蛋白敲除的精原细胞和精母细胞透射电镜，结果 表明Guf1敲除小鼠发育到精母细胞线粒体形态发生变化。图4B、D代 表Guf1敲除小鼠的精子线粒体鞘，结果显示Guf1缺失会引起精子线粒 体形态发生明显改变，体现在精子线粒体鞘线粒体摆列不整齐，内脊有 缺损。

具体方法：

睾丸和附睾组织透射电镜：睾丸和附睾从野生和敲除型小鼠活体取下 来，放入四氧化锇中固定1-2小时。固定完毕，用缓冲液漂洗20分钟后进 行脱水。脱水梯度依次为：30%丙酮，50%丙酮，70%丙酮，80%丙酮，90% 丙酮，每级作用30分钟。纯丙酮作用3次，每次30分钟。样品进行渗透 后做超薄切片，最后染色，先柠檬酸铅染色10分钟，去二氧化碳的双蒸 水清洗3次，再用醋酸铀染色30分钟，双蒸水清洗3次。等超薄切片干 燥后，即可上透射电子显微镜Tecnai Spirit(120KV)观察。

实施例5、Guf1蛋白对线粒体呼吸链复合物功能的影响。

为了进一步研究Guf1对于线粒体功能的影响，我们对线粒体氧化 磷酸化系统进行研究，同时以正常组织心脏作为对照。图3A代表野生 型和敲除型睾丸和附睾的ATP水平，结果显示在Guf1敲除的情况下睾 丸和附睾ATP水平下降。图3B代表线粒体细胞色素c氧化酶的活性， 结果表明Guf1敲除的睾丸和附睾中细胞色素c氧化酶的活性降低。图 3C代表Blue native PAGE分析线粒体呼吸链各复合物，结果表明细胞色 素c氧化酶的量在敲除型睾丸和附睾中明显减少。图3D代表细胞色素c 氧化酶的BNG染色，结果表明细胞色素c氧化酶的活性明显降低。图 3E代表线粒复合物I,复合物II和复合物V的活性染色，结果表明复合 物I、V、II的活性没有明显变化。

具体方法：

ATP水平测定：取6-8周龄野生型和敲除型小鼠的睾丸、附睾，PBS 洗三次。睾丸去白膜，灭菌刀片将睾丸，附睾切碎，0.25%的胰酶消化， 每次5分钟,共15分钟。得到单细胞，细胞裂解后，13000rpm离心10分 钟，上清用BCA试剂盒测定蛋白浓度。取5μl样品加入50μl ATP检测 buffer，化学发光酶标仪(Perkin Elmer，USA)检测仪检测。

Blue Native PAGE：按照线粒体分离试剂盒(Abcam)分离小鼠心脏和 睾丸线粒体，BCA试剂盒测定蛋白浓度。取400μg线粒体12000rpm离 心5分钟，加入40μl缓冲液A(50mM氯化钠，50mM咪唑/盐酸，1mM  EDTA，pH 7.0)重悬。每管加入12μl Digitonin，混匀冰上作用10分钟。 100000g，4度离心30分钟，取上清，加入5μl甘油和6μl考马斯亮蓝。 取20μl样品进行Blue-native PAGE分离线粒体复合物，方法见参考文献 (Ilka Wittig等，nature 2006)。

复合物I活性：将Blue-native PAGE分离胶孵育在50mM Tris-Hcl， pH 7.4缓冲液中(含有0.5mM NBT(Nitroblue tetrazolium chloride，氯化硝 基四氮唑)，5mM NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌 呤二核苷酸))，室温作用1小时。

复合物II活性：将Blue-native PAGE分离胶孵育在50mM Tris-Hcl， pH 7.4缓冲液中(0.2mM PMS(Methylphenaziniummethylsulfate，吩嗪甲基 硫酸盐)，84mM琥珀酸，50mM NBT)，室温作用1小时。

复合物IV活性：将Blue-native PAGE分离胶孵育在50mM Tris-Hcl， pH 7.4缓冲液中(含有0.1%二氨基联苯胺，24个单位/ml过氧化氢酶，0.1% 细胞色素c)，37度作用3-6小时。

复合物V活性：将Blue-native PAGE分离胶用清水漂洗10分钟，放 入0.1M的甘氨酸缓冲液中(pH 8.6)作用1小时。再将分离胶放入含有下列 成分的缓冲液中：35mM Tris碱，270mM甘氨酸，14mM硫酸镁，5mM  ATP，0.2%硝酸银，37度作用3-6小时。

实施例6、Guf1敲除对线粒体呼吸链复合物亚基蛋白的影响。

以上研究表明Guf1敲除会引起小鼠睾丸和附睾的电子传递链细胞色素 c氧化酶活性明显下降，所以我们对线粒体电子传递链各复合物亚基的量 进行研究，同时以正常组织心脏作为对照。图A表示心脏和睾丸以及附睾 中复合物I-V各亚蛋白的western blot结果，结果显示敲除型小鼠的睾丸 和附睾中复合物IV中Cox IV(核基因编码)，Cox1、Cox2(线粒体基因组编 码)的量显著减少。复合物I中ND2量降低，而NDUFA9量没有任何变化。 复合物III中细胞色素b(CYTB)的量在敲除型睾丸中减少，而核编码的 Core2量不变。复合物II中70kd Fp的量没有变化。复合物V中ATP5A 量也没有变化。图B是Blue native western blot的结果进一步表明线粒体 复合物IV的量减少。图C是Blue-native 2D结果说明复合物IV各亚蛋白 的量比起其它复合物各亚蛋白量减少得更为显著。

具体方法：

蛋白免疫印迹(western blot)：取6-8周龄的野生型和Guf1敲除型小 鼠断颈处死，取出小鼠心脏，睾丸和附睾组织，PBS漂洗。加入RIPA 裂解液1ml,同时加入蛋白酶抑制剂cocktail(Roche)，放入组织研磨器中 研磨，匀浆液冰上放置30分钟，12000rpm离心30分钟，上清用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。

配制15% SDS-PAGE胶，将已经测好蛋白浓度的样品，加上一定体 积的蛋白上样缓冲液，95度加热15分钟,取一定量蛋白加入到15%  SDS-PAGE胶中，100v恒压，电泳3小时左右。

将胶上的蛋白样品转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1小时,然 后不同一抗(Abcam)按照说明书稀释，孵育过夜。TBST(150mM NaCl, 20mM Tris-HCl,pH7.4,Tween-200.05%)洗膜5次，每次5分钟。二抗 1:3000稀释，孵育1.5小时。TBST洗膜三次后加入超敏ECL化学发光 试剂(碧云天公司)，放入暗盒中曝光。

Blue-native 2D：首先按照以上的实验方法进行Blue native PAGE电 泳，然后将胶置于固定液中固定1小时，考马斯亮蓝染色2小时以上。 将胶切下，放于1%巯基乙醇(痕量溴酚蓝)放置1小时。配制10% Tricine-SDS-PAGE，将胶置于Tricine-SDS-PAGE的积层胶中，恒流20mA, 电泳完毕后考马斯亮蓝染色，脱色。

实施例7、Guf1敲除引起胞质翻译降低和mTOR信号通路降低。

为了在真核细胞中研究Guf1基因的功能，我们研究Guf1引起的信号 通路变化和胞质翻译水平以此揭示Guf1在生物体内的意义。图4A为睾丸 的磷酸化芯片结果，结果显示Guf1主要与癌症相关，同时mTOR信号通 路相关蛋白表达降低。图4B为western blot验证mTOR信号通路相关蛋 白的表达情况，结果表明mTOR下游的底物4E-BP的Thr37/46磷酸化水 平下降，与芯片结果一致。图4C为胞质核糖体展示技术观察胞质翻译水 平，结果发现敲除型小鼠胞质翻译降低。

具体方法：

蛋白免疫印迹(western blot)：取6-8周龄野生型和Guf1敲除型小鼠 断颈处死，取出小鼠心脏和睾丸组织，PBS漂洗。加入RIPA裂解液1ml, 加入蛋白酶抑制剂cocktail(Roche)和磷酸酶抑制剂(Roche)，放入组织研 磨器研磨，匀浆液冰上放置30分钟,12000rpm离心30分钟，上清用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。

配制15%SDS-PAGE胶，将已经测好蛋白浓度的样品，加上一定体 积的蛋白上样缓冲液,95度加热15分钟,取一定量蛋白加入到15% SDS-PAGE胶中，100v恒压，电泳3小时左右。

将胶上的蛋白样品转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1小时,然 后不同一抗(Cell signal technology)按照说明书稀释，孵育过夜。 TBST(150mM NaCl,20mM Tris-HCl,pH7.4,Tween-200.05%)洗膜5次 后，二抗(辣根过氧化物酶标记)1:3000稀释，孵育1.5小时。TBST洗膜 5次后加入超敏ECL化学发光试剂(碧云天公司)，放入暗盒中曝光。

胞质核糖体展示技术：

配制TMK裂解缓冲液:

10mM Tris-Cl，pH 7.4：1ml的1M Tris-Cl

10mM氯化镁：0.5ml的1M氯化镁

100mM氯化钾：10ml的1M氯化钾

1%(v/v)Triton X-100：1ml

0.5%(w/v)脱氧胆酸钠：0.5g

1U/ml RNA酶抑制剂：2.5μl40U/μl

2mM DTT：200μl的1M DTT

放线菌酮：0.1mg/ml

加入DEPC-H₂O至100ml。

配制10%-50%蔗糖：在4度用DEPC水配制。

10%(w/v)蔗糖溶液的配制(200ml)：

蔗糖：20g

100mM氯化钾：20ml的1M氯化钾

5mM氯化镁：1ml的氯化镁

2mM DTT：400μl的1M DTT

20mM HEPES，pH 7.4：4ml的1M HEPES

50%(w/v)蔗糖溶液的配制(200ml)：

蔗糖：100g

100mM氯化钾：20ml的1M氯化钾

5mM氯化镁：1ml of氯化镁

2mM DTT：400μl的1M DTT

20mM HEPES，pH 7.4：4ml的1M HEPES

在用之前加入2μl(40U/μl)RNA酶抑制剂和50μl放线菌酮(100 μg/μl)于50ml蔗糖中。放于梯度混合仪配制梯度。

野生型和Guf1敲除型小鼠断颈处死，立即取出心脏和睾丸放于液氮 中速冻，无RNA酶的研钵研磨成粉末，倒入到EP管中，加入TMK裂 解液，冰上裂解5分钟。13000g离心20分钟。上清铺于10%-50%的蔗 糖梯度中。26000rpm离心4小时。核酸检测仪A260检测。

实施例8、Guf1蛋白敲除对线粒体拷贝，转录和翻译的影响。

在酵母中的研究表明，Guf1是重要的线粒体蛋白质翻译因子。为了进 一步研究Guf1在真核细胞中对线粒体蛋白质合成的影响。我们做了如下 研究，图A是测定野生型和Guf1敲除型小鼠的心脏、睾丸以及附睾中线 粒体DNA的拷贝数，结果表明线粒体DNA的拷贝数有所增加。图C,E 是表示线粒体各复合物蛋白的mRNA水平，其中C是睾丸的结果，E图 是心脏结果，结果表明线粒体各复合物蛋白的mRNA水平在野生型和敲 除型心脏和睾丸中没有明显变化，Guf1敲除不影响线粒体DNA的转录。 图B是线粒体核糖体大亚基L11和核糖体小亚基S18的量变化，结果显示 敲除型睾丸中L11和S18的量稍有增加。图D是线粒体蛋白质体外翻译， 结果表明在Guf1敲除的睾丸中，线粒体蛋白质体外翻译的量增加。

具体方法：

线粒体DNA拷贝数的测定：

提取野生型和Guf1敲除型小鼠的心脏和睾丸的DNA,合成线粒体 DNA(mtDNA)编码的cox1基因引物和细胞核DNA(nDNA)编码的ndufv1 基因的引物。以心脏和睾丸的基因组DNA为模板，qPCR扩增cox1和ndufv 基因。cox1和ndufv的比值代表mtDNA/nDNA。

线粒体各复合物蛋白qPCR：Trizol试剂提取野生型和Guf1敲除型小 鼠心脏和睾丸的总RNA,以2μg总RNA为模板，用莫洛尼小鼠白血病病 毒逆转录酶(Molony murine leukemia virus reverse transcriptase，MoMuLV  RT)为模板，以多聚胸腺嘧啶(oligo(dT))为引物合成cDNA.参照文献合成 16S rRNA,12S rRNA，ND1，ND6，NDUFS3，NDUFS7，NDUFB6， NDUFA9(NADH脱氢酶亚基)，Cox1，Cox2(细胞色素氧化酶亚基)，CytB(细 胞色素还原酶亚基，细胞色素b)，ATP6(ATP合成酶亚基)，EF-Tu(延伸 因子TU)引物。用SYBR Green Master Mix(Takara，Japan)试剂在ABI  StepOne plus定量PCR仪进行RT-PCR反应。

线粒体蛋白质体外翻译：用线粒体分离试剂盒(Abcam)提取野生型和 Guf1敲除型小鼠的心脏和睾丸线粒体，BCA试剂盒测定线粒体蛋白浓度。 100μg线粒体12000g离心，沉淀用反应缓冲液37度反应1小时。反应缓 冲液成分如下：25mM蔗糖，75mM山梨醇，1mM氯化镁，0.05mM  EDTA，10mM Tris-HCl，10mM磷酸氢二钾，10mM谷氨酸盐，2.5mM 苹果酸，1mM ADP，1mg/ml脱脂牛血清白蛋白,100μg/ml吐根素，100 μg/ml放线菌酮，0.2mM氨基酸混合物，1个单位的RNA酶抑制剂。

反应完成后，样品12000g离心5分钟，用冷缓冲液(320mM蔗糖;1 mM EDTA;10mM Tris-HCl,pH7.4)洗涤3次，沉淀加入1x蛋白上样缓冲 液25μl,95度加热10分钟，进行15%-20%SDS-PAGE电泳。制干胶，压 磷屏。

实施例9、人精子的保存及其基因组DNA的提取

取400微升不育病人的精子(天津市总医院)提取基因组，然后进行测 序，图9A表示提取的编号为1、2、3的病人基因组，结果显示提取成功。 将上述DNA进行测序，图9B表示测序结果，结果显示在生殖异常的人 guf1基因的5’未翻译端有两个碱基(TC)的缺失。我们采用的这个实验方案 可以成功的得到精子外显子DNA序列，通过比对分析突变的位点，因此 可以成为一个制作试剂盒的基础。

具体方法：

取样：室温水溶液化(或37℃水浴液化)

冻存：

将液化的精子与冻存液按1：1混合逐滴慢慢加入，边加入边混匀；4℃冷 冻30分钟，液氮15分钟冻存。

精子DNA提取：

1.取200μl精子+200μl Buffer X2于1.5ml离心管，55℃水浴至少1 小时(1.5小时)，每隔10分钟颠倒混匀；

2.加入400μl的Buffer AL(QIAGEN DNA提取试剂盒中成分)(可能会 产生沉淀，70℃能溶解)漩涡振荡15秒，70℃孵育10分钟，简单离心，将 盖子上的水滴离下来;

3.加入400μl的乙醇(95%-100%)，涡旋振荡混匀15秒，简单离干盖 子上的水滴(可能会产生沉淀，沉淀对结果无影响)；

4.将第3步混合物加入反应柱中，8000rpm离心1分钟，换柱于一 新的2ml收集管中(若离不干净，再次离心)；

5.加入500μl AW1(QIAGEN DNA提取试剂盒中成分)，8000rpm离 心1分钟，换柱于一新的收集管中；

6.加入500μl AW2(QIAGEN DNA提取试剂盒中成分)，14000rpm离 心3分钟；

7.换新收集管，14000rpm空柱离心1分钟；

8.换一新的1.5ml离心管，加入100μl Buffer AE(QIAGEN DNA提 取试剂盒中成分)或蒸馏水，室温放置1分钟，8000rpm，离心1分钟(此 处AE应分多次加入，确保柱子上DNA的洗脱充分)。

表1：人guf1基因外显子测序的引物表

引物标号 引物序列 测序外显子 1F ACTGACAGTACACACACCACAG 第1个外显子 1R AAGTTAGTGACTTGCCCAAGG 第1个外显子 2F CTGATTGGCCCTAAAAATTG 第2到第4个外显子 2R ACTAGTCAATTCCAGAGAATGC 第2到第4个外显子 3F TGACCCCAAAGACATAAGTTG 第5个外显子 3R GTGAGTTTCAGTTGCACTTCTG 第5个外显子 4F TATTGTAGAGGGGTCAGTTAGG 第6个外显子 4R AGTGATAAAACCTTTGAGCCTC 第6个外显子 5F TACCCAGATTTCGAACTATTCC 第7到第8个外显子 5R TCAACTGACGTTTCTATTGTCC 第7到第8个外显子 6F TAAGACCTGGTGTGTTCATTTG 第9个外显子 6R AACACATCCTAAATGATCTCCC 第9个外显子 7F TTGGAGTGCAAATCTAGTTG 第10和11个外显子 7R_1 AATCCGCAACGTGAAACAG 第10个外显子

7R_2 GTTCTTCATCATTAGCCATAGG 第11个外显子 8F CATGTAAGTGGCAATCTGTTC 第12个外显子 8R CTTTCCTTTGGGCTAACATATC 第12个外显子 9F TTTGGTAGCAAGCCTAATGC 第13个外显子 9R TGTTCCAAGTCATTCTAACC 第13个外显子 10F GATGGAAACATATCTCTTTGGG 第14个外显子 10R GGTGAAGGGAAACATTTCTATG 第14个外显子 11F TCCATTTGAACCTCCTTAAGAG 第15个外显子 11R AAACTGGAGAGCACCATCATAC 第15个外显子 12F CAAGCCTTGACCATTTTTTC 第16个外显子 12R CATGGTCAAGCTGAAATTTACC 第16个外显子 13F CTCCATCCAGATTAAATCCTG 第17个外显子 13R CATGGCTTCAAAATCTAAGCTC 第17个外显子

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