与α2整联蛋白结合的肽或肽复合物以及涉及所述肽或肽复合物的方法和用途

摘要

本发明涉及与α2整联蛋白结合的肽或肽复合物、涉及编码所述肽或肽复合物的一种或多种核酸、产生所述肽或肽复合物的重组细胞、用于产生所述肽或肽复合物的方法、用作药物的包含肽或肽复合物或核酸的药物组合物、检测α2整联蛋白的方法和筛选方法。

说明书

本发明涉及用于治疗、预防或诊断的与α2整联蛋白结合的肽或肽复合物，涉及编码所述肽或肽复合物的一种或多种核酸、产生所述肽或肽复合物的重组细胞、用于产生所述肽或肽复合物的方法、用作药物的包含所述肽或肽复合物或核酸的药物组合物、检测α2整联蛋白的方法和筛选方法。 

发明背景

整联蛋白是介导相邻细胞和/或胞外基质(ECM)中的粘附分子间的相互作用的跨膜蛋白。整联蛋白在包括发育和伤口愈合期间的细胞迁移、细胞分化和细胞凋亡在内的若干生物过程中起各种各样的作用。其活性还可调节肿瘤细胞的转移和侵袭潜力。它们作为由α和β亚基组成的异二聚体存在。一些α和β亚基彼此显示出特异性，并可命名为VLA (极迟抗原)成员。异二聚体常常优先结合某些细胞粘附分子或ECM的组分。尽管它们没有催化活性，但整联蛋白可为被称作粘着斑的多分子信号转导复合物(multimolecular signaling complexes)的部分。

在与配体结合时，整联蛋白将胞内信号转导至细胞骨架，这改变在响应这些细胞粘附事件时的细胞活性，被称为由外到内的信号转导(outside-in signaling)。这种信号转导还可激活在同一细胞上表达的其它整联蛋白亚型，这被称为由内到外的信号转导(inside-out signaling)。由内到外的信号转导还通过起源于细胞质内的调节信号(例如α和β亚基间紧密结合(clasp)的破坏)而发生，然后传送至受体的外部配体结合结构域。整联蛋白可在控制发育、器官形态形成、生理学和病理学以及正常的组织稳态及免疫应答和血栓形成反应的细胞粘附事件中起重要作用，另外它们用作细胞的环境感受器。 

整联蛋白异二聚体之一是α2β1整联蛋白。α2β1整联蛋白在若干不同的细胞类型中表达，所述细胞包括内皮和上皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞和血小板。α2β1的配体特异性随细胞类型而变化。虽然它用作血小板和成纤维细胞上的胶原受体，但它在内皮和上皮细胞上既用作胶原受体又用作层粘连蛋白受体。 

α2β1整联蛋白是由α整联蛋白家族的α2整联蛋白亚基和β整联蛋白家族的β1整联蛋白亚基组成的分子。α2和β1整联蛋白的序列是本领域已知的，并发表于例如Takada和Hemler J. Cell Biol. 109(1):397-407，1989和Argraves，W.S, J. Cell. Biol. Sep 105(3):1183-90 (1987)。实例序列见图9所示，进一步的序列可检索自国家生物技术信息中心(National Centre for Biotechnology Information，NCBI)数据库，例如对于人(homo sapiens) α2和β1整联蛋白，使用NCBI登录号NP_002194 NM_002203、NM_002211、NP_002202 (β1整联蛋白同种型1A)，亦见下文。 

备选的剪接变体、同种型以及非人源(例如小鼠、大鼠等啮齿动物、猿猴或其它)的序列是本领域已知的，并代表可能的备选实施方案，只要它们显示α2或β1整联蛋白的至少一种已知功能。 

α2亚基是整联蛋白α亚基亚组的成员，所述整联蛋白α亚基位于通常常称为I (或插入)结构域的氨基端附近、含有约200个氨基酸结构域。许多I结构域，包括α₂和整联蛋白亚基I结构域，含有额外的阳离子结合部位，即金属离子依赖性粘附部位(metal ion-dependent adhesion site，MIDAS)基序。α2整联蛋白I结构域的结构表征发表于例如Dickeson等, J. Biol. Chemistry, 272，7661-7668 (1997)。I结构域在配体结合中是重要的决定因素。人α2整联蛋白I结构域的氨基酸序列可获自图9，以α2整联蛋白序列(SEQ ID 20)标注。 

α2β1整联蛋白(极迟抗原2；VLA-2)在各种细胞类型中表达，包括血小板、血管内皮细胞、上皮细胞、激活的单核细胞/巨噬细胞、成纤维细胞、白细胞、淋巴细胞、激活的嗜中性粒细胞和肥大细胞。α2β1的天然配体包括胶原和层粘连蛋白，两者存在于胞外基质中。α2β1整联蛋白牵涉若干生物学和病理学过程，包括胶原诱导的血小板聚集、胶原上的细胞迁移、胶原纤维的细胞依赖性重构(reorganization)以及导致细胞因子表达和增殖增加的胶原依赖性细胞反应；T细胞、肥大细胞和嗜中性粒细胞功能的方面；迟发型超敏反应、接触性超敏反应和胶原诱导的关节炎的方面；乳腺导管形态发生；表皮伤口愈合和VEGF诱导的血管生成相关过程。 

血小板通常以无活性静息状态在血液中循环，然而，它们在损伤部位被引发(prime)以快速响应各种各样的激动剂。在刺激时，它们经历形态改变，并且变得对血浆蛋白质例如血纤蛋白原和冯维勒布兰德因子(vWf)、其它血小板和血管壁内皮衬里有高度反应性。所有这些相互作用共同协调促进止血的血纤蛋白血小板栓的快速形成(Cramer，2002载于Hemostasis and Thrombosis，第4版)。在结合配体，血小板受体转导由外到内的信号途径，该途径进而引发导致第二受体(例如血小板血纤蛋白原受体、αIIbβ3整联蛋白)活化的由内到外的信号转导，这就引起血小板聚集。甚至血小板的少量活化都可导致血小板血栓形成反应、血小板减少和出血并发症。 

α2整联蛋白是唯一在血小板中表达的胶原结合性整联蛋白，并涉及在血小板与胶原的粘附和止血中起某些作用(Santoro等, Thromb. Haemost. 74:813-821 (1995)；Vanhoorelbeke等，Curr Drug Targets Cardiovasc. Haematol. Disord. 3(2)：125-40 (2003)；Sarratt等，Blood 106(4)：1268-1277 (2005))。因此，为了负干扰血小板聚集，可期需α2整联蛋白功能的失活。例如，一种该类型的抑制可为将整联蛋白锁定在无活性状态的变构抑制。 

整联蛋白/配体相互作用可促使白细胞渗出到发炎组织(Jackson等, J. Med. Chem. 40:3359-3368 (1997)；Gadek等，Science 295(5557):1086-9 (2002)，Sircar等, Bioorg. Med. Chem. 10:2051-2066 (2002))，并且在白细胞响应炎性刺激从循环中开始渗出到组织之后的下游事件(包括在炎症部位促炎细胞的迁移、募集和活化)中起作用(Eble J. A., Curr Pharm Des. 11(7):867-880 (2005))。 

据报道，阻断α2整联蛋白显示对迟发型超敏反应的影响以及在类风湿性关节炎鼠模型和炎性肠病模型中的功效(Kriegelstein等, J. Clin. Invest. 110(12):1773-82 (2002)；de Fougerolles等, J. Clin. Invest. 105:721-720 (2000)，而且体外减少内皮细胞增殖和迁移(Senger等, Am. J. Pathol. 160(1):195-204 (2002)，这就表明阻断α2整联蛋白可防止/抑制如各种癌症中所观察到的异常的或高于正常的血管生成。此外，在大鼠结肠直肠癌手术模型中表明α2-整联蛋白抑制是有效的抗转移药(van der Bji等，Hepatology 47(2)：532-543 (2008))。结肠直肠癌细胞的谱系定型还可偏离恶性表型而转变(Kirkland等，J Biol Chem 283(41)：27612-27619 (2008))。由于表明胰腺癌中α2整联蛋白介导恶性表型(Grzesiak和Bouvet，Br J Cancer 94：1311-1319 (2006))，这就证实了用于这种类型的侵略性癌症的治疗方法的这个靶标。此外，在前列腺癌进程中，α2β1整联蛋白与鞘糖脂相互作用，表明了这种相互作用的阻断对这种类型的癌症可具有治疗作用(van Slambrouck等，Int J Onco 35：693-699 (2009)。在实验性自身免疫性脑炎(EAE)、多发性硬化(MS)鼠模型中，α2整联蛋白似乎起重要作用，因为恰在发病之后给予用抗α2抗体的治疗，抑制CNS的临床征象和炎症(Tsunoda等，Brain Pathol 17:45-55 (2007)。抗α2抗体的这种治疗有益作用的机制很可能是由于α2β1整联蛋白与C1q补体蛋白的相互作用受到抑制所致。这种相互作用是肥大细胞脱粒和肥大细胞活化中的第一步，肥大细胞脱粒和肥大细胞活化涉及自身免疫病和炎性疾病，像MS、系统性红斑狼疮、肾小球性肾炎等(McCall-Culbreath等，Blood 111(3562-3570) 2008)。 

因此，α2整联蛋白是引人关注的医学靶标。因为整联蛋白是用于开发特异性抑制剂的困难靶标，而且鉴于许多不同的可能的治疗适应证，因此需要与α2整联蛋白结合的备选抑制剂，尤其与现有α2整联蛋白抑制剂相比显示某种不同性质的α2整联蛋白抑制剂，所述抑制剂可用于治疗α2整联蛋白相关病症。 

发明概述

本发明涉及用于治疗、预防或诊断的α2整联蛋白抗体、抗原结合片段和其它结合分子、涉及编码结合分子的一种或多种核酸、产生结合分子的重组细胞、用于产生结合分子的方法、用作药物的包含结合分子或核酸的药物组合物、检测α2整联蛋白的方法和筛选方法。

为此，产生了抗α2整联蛋白的单克隆抗体，并测试其特性。这提供了如实施例中所描述的有利特性。具体地讲，通过一组实验数据，包括结合常数、交叉反应性、结构域作图和体外功能数据，对抗α2整联蛋白抗体和其单价片段或衍生物进行了表征。 

已发现单克隆抗体(mAb)以nM亲和力与α2整联蛋白的I结构域结合，其中结合显然发生在I结构域内的表位上，该表位不同于被同样靶向α2整联蛋白I结构域的现有技术水平的比较抗体(comparator antibody)结合的表位。在Biacore实验中，本发明抗体的全部工程改造的分子(IgG4 mAb、Fab)显示可比的结合速率和解离速率。它们显示与灵长类动物α2β1整联蛋白的交叉反应性，而在用来自相关物种的血小板测试时，针对小鼠、大鼠、狗、豚鼠、猪或兔α2β1整联蛋白未检出交叉反应性。 

受测分子以低nM IC₅₀值体外抑制重组α2整联蛋白与胶原的相互作用。除抑制胶原以外，在静态条件下，在分离的人血小板和富含人血小板的血浆两者中，抗α2β1整联蛋白mAB或Fab片段还能够抑制血小板与胶原的粘附。它们还能够抑制在胶原包覆的表面上流动时的血栓形成。阻断胶原结合，从而防止血小板与胶原粘附的能力是血栓形成的最早步骤之一。 

最后，mAb或Fab不引起血小板活化，因为mAb的约30个供体中所观察到的GPIIbIIIa活化或P-选择蛋白表面表达未增加。因此，本发明提供单价抗体，抗体片段或衍生物及其对于制造研究的用途，用于治疗下列α2整联蛋白相关病症的诊断剂和治疗剂；具体实例包括血栓形成、其它血管病、癌症和新血管生成的病理结果、自身炎性疾病例如多发性硬化。 

技术人员已知，抗体的结合特性受可变结构域介导。对于与抗原结合，来自重链的可变结构域和来自轻链的起协同作用的可变结构域通常存在于抗体中，并排列以供协同作用(co-action)。可变结构域亦称为FV区。更具体地讲为可变环，轻(VL)链和重(VH)链上各有3个，负责与抗原结合。这些环称为互补决定区(CDR)，VL为LCDR1、LCDR2和LCDR3，VH为HCDR1、HCDR2和HCDR3。重链的可变结构域和轻链的起协同作用的可变结构域的各种不同排列是本领域已知的。因此，重要的是鉴定重链的一个或多个合适的可变结构域和轻链的一个或多个起协同作用的可变结构域。通过序列比对，已鉴定出上述α2整联蛋白抗体的重链和轻链的CDR。 

第一方面，本发明涉及肽或肽复合物，优选分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述肽或肽复合物、抗体或片段与人α2整联蛋白的I结构域特异性结合，所述抗体或片段包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述抗体或片段与非人灵长类动物α2整联蛋白交叉反应，但不与非灵长类动物α2整联蛋白交叉反应。 

第二方面，本发明涉及肽或肽复合物，优选分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述肽或肽复合物、抗体或片段与人α2整联蛋白的I结构域特异性结合，所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述抗体或片段与参比抗体竞争结合参比抗体的表位，所述参比抗体包含由以登记号DSM 23944保藏于DSMZ的质粒编码的轻链，和由(i)以登记号DSM 23946保藏于DSMZ的质粒或(ii)以登记号DSM 23945保藏于DSMZ的质粒编码的重链。 

第三方面，本发明涉及肽或肽复合物，其包含一个或多个下列组分： 

(a) LCDR1，其中LDR1为RASESVESYGNSFIY (SEQ ID NO:6)或其功能活性变体，

(b) LCDR2，其中LDR2为lasnlas (SEQ ID NO:7)或其功能活性变体，

(c) LCDR3，其中LDR3为qqnnedpyt (SEQ ID NO:8)或其功能活性变体，

(d) HCDR1，其中HDR1为GYTFTSYWMN (SEQ ID NO:3)或其功能活性变体，

(e) HCDR2，其中HDR2为RidpsdsetHYNQKFK (SEQ ID NO:4)或其功能活性变体，和

(f) HCDR3，其中HDR3为VGRGYFDY (SEQ ID NO:5)或其功能活性变体，

且其中组分a)-f)的一个或多个经排列以允许肽或肽复合物与α2整联蛋白结合。

第四方面，本发明涉及用于治疗、预防或诊断α2整联蛋白相关病症或疾病的上述肽或肽复合物。 

第五方面，本发明涉及编码本发明的肽或肽复合物的一种或多种核酸。 

第六方面，本发明涉及异源表达本发明的核酸之一的细胞。 

第七方面，本发明涉及用于产生本发明的肽或肽复合物的方法，所述方法包括将本发明的细胞在允许肽或肽复合物表达的条件下培养，任选从宿主细胞中回收肽或肽复合物。 

第八方面，本发明涉及用作药物的包含至少一种本发明的肽或肽复合物和/或至少一种本发明的核酸的药物组合物。 

第九方面，本发明涉及诊断与α2整联蛋白改变有关的疾病的方法，所述方法包括 

a) 使包含α2整联蛋白的样品与权利要求1-3中任一项的肽或肽复合物接触；和

b) 检测α2整联蛋白与肽或肽复合物的结合；和

c) 将步骤b)的结合与参比进行比较，

其中相对于参比，样品中的α2整联蛋白结合改变表明有所述疾病。

在第十方面，本发明涉及包含以下的制品 

a) 包装材料，

b) 权利要求1-3中一项的肽或肽复合物或其药学上可接受的盐，

c) 标签物(label)或包装说明书(package insert)，包装说明书装入所述包装材料内，标明所述肽或肽复合物有效治疗疾病或病症，特别是α2整联蛋白相关疾病/病症。

第十一方面，本发明涉及用于诊断α2整联蛋白相关病症或疾病的诊断试剂盒，其包括本发明的肽或肽复合物和合适的包装，及可能地合适的使用说明，其用于在检测α2整联蛋白时使用所述肽或肽复合物。 

第十二方面，本发明涉及使用一种或多种本发明的肽或肽复合物和/或一种或多种本发明的核酸或本发明的药物组合物之一治疗或诊断α2整联蛋白相关病症或疾病的方法。 

第十三方面，本发明涉及诊断与α2整联蛋白改变有关的疾病的方法，所述方法包括 

a) 使所取个体的样品与本发明的肽或肽复合物接触；和

b) 检测α2整联蛋白与肽或肽复合物的结合；和

c) 将步骤b)的结合与α2整联蛋白与一个或多个参比样品中的肽或肽复合物的结合进行比较，

其中相对于一个或多个参比样品中检测到的结合，所取样品中的结合改变表明有所述疾病。

在某些实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段与人α2整联蛋白的I结构域特异性结合，所述抗体或片段包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述抗体或片段与非人灵长类动物α2整联蛋白交叉反应，但不与非灵长类动物α2整联蛋白交叉反应。 

在其它实施方案中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段与人α2整联蛋白的I结构域特异性结合，所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述抗体或片段与参比抗体竞争结合参比抗体的表位，所述参比抗体包含由以登记号DSM 23944保藏于DSMZ的质粒编码的轻链，和由(i)以登记号DSM 23946保藏于DSMZ的质粒或(ii)以登记号DSM 23945保藏于DSMZ的质粒编码的重链。 

在一个实施方案中，所述抗体或片段以nM结合亲和力与人α2整联蛋白的I结构域特异性结合。在另一个实施方案中，所述抗体或片段体外抑制人α2整联蛋白与胶原的相互作用，从而抑制因所述血小板与所述胶原粘附而引起的血小板活化。 

在一个实施方案中，所述重链可变区结构域包含SEQ ID NO:5的重链HCDR3。在另一个实施方案中，所述重链可变区结构域包含SEQ ID NO:3 (HCDR1)、SEQ ID NO:4 (HCDR2)和SEQ ID NO:5 (HCDR3)的重链CDR或其功能活性变体。在一个实施方案中，HCDR2的功能活性变体包含氨基酸6位处的突变Asp→Glu。 

在一个实施方案中，轻链可变区结构域包含SEQ ID NO:8的轻链LCDR3。在另一个实施方案中，轻链可变区结构域包含SEQ ID NO:6 (LCDR1)、SEQ ID NO:7 (LCDR2)和SEQ ID NO:8 (LCDR3)的轻链CDR或其功能活性变体。在一个实施方案中，LCDR1的功能活性变体包含氨基酸11位处的突变Asn→Gln。 

在一个实施方案中，重链可变区(VH)结构域与SEQ ID NO: 2的VH序列具有至少90%、95%、97%或99%序列同一性。在另一个实施方案中，所述重链可变区(VH)结构域包含SEQ ID NO:2的序列或其功能活性变体(functionally active thereof)。 

在一个实施方案中，轻链可变区(VL)结构域与SEQ ID NO: 1的VL序列具有至少90%、95%、97%或99%序列同一性。在另一个实施方案中，所述轻链可变区(VL)结构域包含SEQ ID NO:1的序列或其功能活性变体。 

在一个实施方案中，重链可变区(VH)结构域包含在选自以下位置处的一个或多个氨基酸取代：H5、H7、H11、H12、H17、H20、H38、H40、H43、H55、H61、H65、H66、H67、H76、H81、H82、H87、H91、H93、H112、H113和H116。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自5His→Val、7Pro→Ser、11Leu→Val、12Val→Lys、17Pro→Ser、20Leu→Val、38Lys→Arg、40Arg→Ala、43Arg→Gln、55Asp→Glu、61Asn→Ala、65Lys→Gln、66Asp→Gly、67Lys→Arg、76Ser→Thr、81Ile→Met、82Gln→Glu、87Thr→Arg、91Ser→Thr、93Val→Lys、112Thr→Leu、113Leu→Val和116Ser→Val。 

在一个实施方案中，轻链可变区(VL)结构域包含在选自以下位置处的一个或多个氨基酸取代：L9、L12、L15、L22、L34、L46、L47、L80、L83、L85、L87和L89。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自9Ala→Ser、12Ala→Ser、15Leu→Val、15Leu→Pro、22Ser→Thr、34Asn→Gln、46Gln→Lys、47Ala→Pro、80Asp→Asn、83Glu→Gln、85Asp→Glu、87Ala→Thr和89Thr→Asn。 

在一个实施方案中，重链可变区(VH)结构域与选自以下的VH序列有至少90%、95%、97%或99%序列同一性：SEQ ID NO: 38 (HC1)、SEQ ID NO:39 (HC2)、SEQ ID NO:40 (HC3)、SEQ ID NO:41 (HC4)、SEQ ID NO:42 (HC5)、SEQ ID NO:43 (HC6)和SEQ ID NO:44 (HC7)。在另一个实施方案中，重链可变区(VH)结构域包含选自以下的VH序列：SEQ ID NO: 38 (HC1)、SEQ ID NO:39 (HC2)、SEQ ID NO:40 (HC3)、SEQ ID NO:41 (HC4)、SEQ ID NO:42 (HC5)、SEQ ID NO:43 (HC6)和SEQ ID NO:44 (HC7)。 

在一个实施方案中，轻链可变区(VL)结构域与选自以下的VL序列有至少90%、95%、97%或99%序列同一性：SEQ ID NO: 33 (LC1)、SEQ ID NO:34 (LC2)、SEQ ID NO:35 (LC3)、SEQ ID NO:36 (LC4)和SEQ ID NO:37 (LC5)。在另一个实施方案中，轻链可变区(VL)结构域包含选自以下的VL序列：SEQ ID NO: 33 (LC1)、SEQ ID NO:34 (LC2)、SEQ ID NO:35 (LC3)、SEQ ID NO:36 (LC4)和SEQ ID NO:37 (LC5)。 

在一个实施方案中，抗体或结合部分是嵌合抗体或人源化抗体。在另一个实施方案中，抗原结合部分选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv和(scFv)₂。在另一个实施方案中，抗体或结合部分选自多特异性抗体、双重特异性抗体(dual specific antibody)、同种型抗体、双重可变结构域抗体(dual variable domain antibody)和双特异性抗体(bispecific antibody)。在另一个实施方案中，抗体或结合部分包含选自以下的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、结构域、人IgG4恒定结构域、人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。在一个实施方案中，抗体或结合部分包含人IgG4恒定结构域。 

另一方面，本发明提供编码本发明的抗体或抗原结合部分的氨基酸序列的核酸。另一方面，本发明提供包含所述核酸的重组表达载体。另一方面，本发明提供包含所述重组表达载体的宿主细胞。另一方面，本发明提供产生抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括将宿主细胞培养在使得宿主细胞产生抗体的条件下。 

另一方面，本发明提供包含抗体或抗原结合部分和一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。另一方面，本发明提供治疗、预防或诊断α2整联蛋白相关病症或疾病的方法，所述方法包括给予有需要的受试者药物组合物。在一个实施方案中，α2整联蛋白相关疾病或病症选自血栓形成、血管病、癌症包括新血管生成和转移、炎症、炎性疾病、自身免疫病和其特征在于血管生成异常或增加的疾病、炎性肠病、克罗恩病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎、移植反应、视神经炎、脊髓创伤、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化、雷诺综合征(Reynaud's syndrome)、实验性自身免疫性脑脊髓炎、斯耶格伦综合征(Sjorgen's syndrome)、硬皮病、心血管病、银屑病和诱导炎性反应的感染。在另一个实施方案中，α2整联蛋白相关疾病或病症选自急性冠状动脉综合征、经皮冠状动脉介入、缺血性中风、颈动脉狭窄或外周动脉闭塞性疾病。 

发明详述

定义

在下面详细描述本发明之前，要了解本发明不局限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些都可以改变。还要了解，本文所用术语仅出于描述具体实施方案的目的，并无意限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附权利要求书。除非另有说明，否则本文所用的全部科技术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。

优选按"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations) (生物技术术语多语言词汇：(IUPAC建议))"，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.和K?lbl，H.主编(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland)中的描述来定义本文所用术语。 

在整个本说明书和随附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则措词“包含”和变化形式例如“包括”和“含有”应理解为隐含囊括所述整体或步骤或者一组整体或步骤，但不排除任何其它的整体或步骤或者一组整体或步骤。 

在贯穿本说明书文本中引用了若干文献(例如：专利、专利申请、科学出版物、生产商说明书、使用说明、GenBank登记号序列提交等)。本文绝不得解释为承认由于现有发明，本发明无资格先于这样的公开内容。本文引述的一些文献被描述为“通过引用结合”。在这类结合的参考文献中的定义或教导与本文明书的定义或教导相抵触的情况下，以本说明书的文本为准。 

序列：本文提及的所有序列公开于所附序列表中，其完整内容和公开内容是本说明书的一部分。 

术语“约”当与数值联用时意指包括具有小于标示数值5%的下限和具有大于标示数值5%的上限的范围内的数值。 

本文所用术语“α2整联蛋白”或“a2整联蛋白”是指本领域已知的α2整联蛋白，优选人α2整联蛋白和特别是具有SEQ ID NO: 21所示核酸序列和SEQ ID NO: 20的氨基酸序列或其生物活性片段的人α2整联蛋白。术语“I结构域”是指SEQ ID NO:20中用下划线和粗体表示的α2整联蛋白的部分。 

术语“特异性地结合”、“特异性结合”等意指肽或肽复合物(例如抗体或其抗原结合片段)与在生理条件下相对稳定的抗原形成复合物。特异性结合的特征可为至少约1x10^-6 M或更小的平衡解离常数(例如K_D越小表示结合越紧密)。用于测定两个分子是否特异性结合的方法是本领域众所周知的，包括例如平衡透析、表面等离振子共振等。然而，特异性结合α2整联蛋白的分离抗体可与其它抗原例如其它物种的α2整联蛋白分子显示出交叉反应性。例如，在某些实施方案中，本发明的α2整联蛋白特异性抗体与人和非人灵长类动物α2整联蛋白两者结合，其亲和力是其对非特异性抗原(例如非灵长类动物α2整联蛋白)的亲和力的至少2倍。此外，本文使用的与α2整联蛋白和一个或多个其它抗原结合的多特异性抗体(例如双特异性抗体)虽然如此也被视为“特异性结合” α2整联蛋白的抗体。 

本文所用术语“K_D”欲指特定的肽/肽复合物-靶分子或抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。平衡解离常数通常以“mol/L” (简称为“M”)测量。 

所谓术语“慢的解离速率(slow off rate)”、“Koff”或“kd”意指以1 x 10^-3 s^-1或更小、优选1 x 10^-4 s^-1或更小的速率常数从α2整联蛋白上解离的肽/肽复合物或抗体，所述速率常数通过表面等离振子共振例如BIACORE 

术语“高亲和力”抗体是指与人α2整联蛋白的结合亲和力为至少10^-10 M、优选10^-11 M、甚至更优选10^-12 M的那些mAb，所述结合亲和力通过表面等离振子共振例如BIACORE-亲和力ELISA测量。 

本文所用术语“表面等离振子共振”是指例如采用BIACORE(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)，通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化，可供分析实时生物特异性相互作用的光学现象。 

“表位”，亦称抗原决定簇，是由免疫系统、具体而言由抗体、B细胞或T细胞识别的抗原区域。本文所用“表位”是能够与本文所述抗体或其抗原结合片段结合的抗原的部分。在这种情况下，术语“结合”优选涉及本文定义的“特异性结合”。表位通常由分子的化学活性表面基团(groupings)组成，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可具有特定的三维结构特性和/或特定的电荷特性。可区分构象表位和非构象表位，因为在变性溶剂存在下丧失与前者而不是与后者的结合。 

“互补位”是与表位特异性结合的抗体的部位。 

本文所用术语“抗体”欲指由4条多肽链组成的免疫球蛋白分子，2条重(H)链和2条轻(L)链通过二硫键相互连接。术语“抗体”还包括所有重组形式的抗体，特别是本文所述抗体，例如在原核生物中表达的抗体、非糖基化抗体和下文所述的任何抗原-结合抗体片段和衍生物。每条重链由重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(由结构域CH1、CH2和CH3组成)组成。每条轻链由轻链可变区(“LCVR或“VL”)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可进一步再分成超变区(称为互补决定区(CDR))，中间散布有更保守的区域(称为构架区(FR))。每条VH和VL由3个CDR和4个FR组成，自氨基端到羧基端按下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。 

就本发明而言，术语alpha2抗体、a2抗体、α2抗体、alpha2整联蛋白抗体、a2整联蛋白抗体、α2整联蛋白抗体按同义词使用，优选是指抑制性即抗(alpha2抗体、a2抗体、α2抗体、alpha2整联蛋白抗体、a2整联蛋白抗体、α2整联蛋白抗体)。 

一个或多个CDR残基的取代或一个或多个CDR的省略也是可能的。在科学文献中描述了其中一个或两个CDR可被分配用于结合的抗体。Padlan等人(1995 FASEB J. 9:133-139)根据已发表的晶体结构，对抗体及其抗原间的接触区进行了分析，并得出仅约1/5-1/3的CDR残基实际接触抗原的结论。Padlan还发现其中一个或两个CDR没有与抗原接触的氨基酸的许多抗体(另见Vajdos等，2002 J Mol Biol 320:415-428)。 

可通过分子建模和/或凭经验，根据之前的研究自位于Chothia CDR外的Kabat CDR的区域，鉴定不接触抗原的CDR残基(例如通常不需要CDRH2中的残基H60-H65)。如果CDR或其残基省略，则通常被占据另一人抗体序列或这类序列的共有序列的相应位置处的氨基酸取代。还可凭经验选择CDR内取代的位置和要取代的氨基酸。凭经验的取代可为保守或非保守取代。 

本文所用术语抗体的“抗原结合片段” (或简称“结合部分”)是指保留与α2整联蛋白特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已表明可通过全长抗体的片段实现抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合片段”中所包括的结合片段的实例包括(i) Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的单价片段；(ii) F(ab′)₂片段，包含通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v) dAb片段(Ward等(1989) Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR)和(vii)可任选通过合成接头连接的两个或更多个分离CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL和VH，由单独的基因编码，但它们可采用重组方法通过合成接头连接，使它们能够制备成其中VL区和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv (scFv)；参见例如Bird等(1988) Science 242：423-426；和Huston等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883)。这类单链抗体还欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”内。又一个实例是结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽，(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。结合结构域免疫球蛋白融合蛋白还公开于US 2003/0118592和US 2003/0133939。这些抗体片段通过采用本领域技术人员已知的常规技术获得，并按与完整抗体相同的方式针对实用性而筛选片段。“抗原结合片段”的其它实例是所谓的微抗体(microantibodies)，其来源于单一CDR。例如，Heap等人描述了来源于针对HIV-1的gp120包膜糖蛋白的抗体重链CDR3的17个氨基酸残基微抗体(Heap CJ等(2005) J. Gen. Virol. 86:1791-1800)。其它实例包括小抗体模拟物，其包含优选通过同族(cognate)构架区彼此融合的两个或更多个CDR区。Qiu等人描述了包含通过同族VH FR2连接的VH CDR1和VL CDR3的这类小抗体模拟物(Qiu X-Q等(2007) Nature biotechnology 25(8):921-929)。 

因此，本文所用术语“抗体或其抗原结合片段”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合部位的分子。 

可用于本发明的抗体及其抗原结合片段可来自任何动物来源，包括禽和哺乳动物。优选抗体或片段来自人、黑猩猩、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠或兔)、鸡、火鸡、猪、绵羊、山羊、骆驼、牛、马、驴、猫或狗来源。特别优选的是人源或鼠源的抗体。本发明的抗体还包括嵌合分子，其中来源于一种物种(优选人)的抗体恒定区与来源于另一物种(例如小鼠)的抗原结合部位组合。此外本发明的抗体包括人源化分子，其中来源于非人物种(例如来自小鼠)的抗体的抗原结合部位与人源的恒定区和构架区组合。 

如本文示例的，本发明的抗体可直接获自表达抗体的杂交瘤，或可以克隆，并在宿主细胞(例如CHO细胞或淋巴细胞)中重组表达。宿主细胞的其它实例为微生物，例如大肠杆菌(E. coli)和真菌，例如酵母。或者，它们可在转基因非人动物或植物中重组产生。 

术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和轻链的氨基酸序列各自的一部分与来源于特定物种或属于特定类别的抗体的相应序列同源，而链的剩余区段与另一物种或类别的相应序列同源。通常轻链和重链两者的可变区模拟来源于一种哺乳动物物种的抗体可变区，而恒定部位与来源于另一种的抗体序列同源。这类嵌合形式的一个明显优点是可变区可方便地来源于通过使用容易获得的B细胞的现有已知来源或来自与来源于例如人细胞制备物的恒定区组合的非人宿主生物的杂交瘤。虽然可变区具有易于制备的优点且特异性不受来源影响，但与非人源的恒定区相比，当注射抗体时人恒定区不太可能引发人受试者的免疫应答。然而，该定义不限于这个具体实例。 

术语“人源化抗体”是指具有基本上来源于非人物种的免疫球蛋白的抗原结合部位的分子，其中该分子的其余免疫球蛋白结构以人免疫球蛋白的结构和/或序列为基础。抗原结合部位可包含与恒定结构域融合的完全可变结构域或仅植入可变结构域中的合适构架区的互补决定区(CDR)。抗原结合部位可以是野生型，或通过一个或多个氨基酸取代而被修饰，例如经修饰更接近地类似于人免疫球蛋白。人源化抗体的某些形式保留全部CDR序列(例如人源化小鼠抗体，其含有来自小鼠抗体的所有6个CDR)。其它形式具有相对于原始抗体结过改变的一个或多个CDR。 

用于使抗体人源化的不同方法是技术人员已知的，有关综述见Almagro和Fransson，其内容通过引用以其整体结合到本文中(Almagro JC和Fransson J (2008) Frontiers in Bioscience 13:1619-1633)。Almagro和Fransson区分了推理方法和经验方法。推理方法的特征在于产生少量工程改造抗体的变体，评价其结合或任何其它目标性质。如果设计的变体不产生预期结果，则开始设计和结合评价的新循环。推理方法包括CDR移植、表面重建(Resurfacing)、超人源化(Superhumanization)和人串含量优化(Human String Content Optimization)。相比之下，经验方法以产生大的人源化变体文库和使用富集技术或高通量筛选选择最佳克隆为基础。因此，经验方法依赖于能够查遍大量抗体变体的可靠选择和/或筛选系统。体外展示技术，例如噬菌体展示和核糖体展示满足这些要求，并为技术人员所熟知。经验方法包括FR文库、引导选择(Guided selection)、构架改组和人源化改造(Humaneering)。 

本文所用术语“人抗体”欲包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人mAb可包括不是人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点专一诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。然而，本文所用术语“人抗体”欲包括这样的mAb，其中来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列被移植到人FR序列中。本发明的人抗体包括自人免疫球蛋白文库分离的抗体，或者自对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，参见例如Kucherlapati和Jakobovits的美国专利号5,939,598。 

本文所用术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体对特定表位显示出单一结合特异性和亲和力。在一个实施方案中，单克隆抗体通过杂交瘤产生，杂交瘤包括与永生化细胞融合的获自非人动物(例如小鼠)的B细胞。 

本文所用术语“重组抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的全部抗体，例如(a)自相对于免疫球蛋白基因是转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)自经转化以表达抗体的宿主细胞(例如自转染瘤)分离的抗体，(c)自重组的组合抗体文库分离的抗体，和(d)通过包括将免疫球蛋白基因序列与其它DNA序列剪接的任何其它方法制备、表达、产生或分离的抗体。 

本文所用术语“转染瘤”包括表达抗体的重组真核宿主细胞，例如CHO细胞、NS/0细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、植物细胞或真菌，包括酵母细胞。 

本文所用的“异源抗体”相对于产生这类抗体的转基因生物来定义。该术语是指具有相当于生物(非由转基因生物组成)中存在的且一般来源于转基因生物以外物种的氨基酸序列或编码核酸序列的抗体。 

本文所用“异杂合抗体”是指具有不同生物来源的轻链和重链的抗体。例如具有与鼠轻链结合的人重链的抗体是异杂合抗体。 

因此，适用于本发明的“抗体及其抗原结合片段”包括但不限于多克隆、单克隆、单价、双特异性、异缀合(heteroconjugate)、多特异性、重组、异源、异杂合、嵌合、人源化(特别是CDR移植的)、去免疫化或人抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段、由Fab表达文库产生的片段、Fd、Fv、二硫键连接的Fvs (dsFv)、单链抗体(例如scFv)、双链抗体(diabodies)或四链抗体(tetrabodies) (Holliger P.等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(14)，6444-6448)、纳米抗体(亦称单结构域抗体)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如抗本发明抗体的抗Id抗体)和上述任一种的表位结合片段。 

本文所述抗体优选是分离的。本文所用“分离的抗体”欲指基本上不含具有不同抗原特异性的其它mAb的抗体(例如特异性结合α2整联蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合α整联蛋白以外抗原的mAb)。然而，特异性结合α2整联蛋白的分离的抗体可与其它抗原例如其它物种的α2整联蛋白分子具有交叉反应性。 

本文所用术语“α2整联蛋白的生物功能或功能”按同义词使用，是指α2整联蛋白的任何功能，例如但不限于：与β1整联蛋白结合并与其形成复合物、与任何已知配体结合例如与胶原、层粘连蛋白结合、胶原诱导的血小板聚集、诱导血栓形成反应、血小板减少、胶原上的细胞迁移、胶原纤维的细胞依赖性重构、导致细胞因子表达和增殖增加的胶原依赖性细胞反应、T细胞的α2整联蛋白或胶原依赖性方面、肥大细胞或嗜中性粒细胞功能、迟发型超敏反应的α2整联蛋白或胶原依赖性方面、接触性超敏反应的α2整联蛋白或胶原依赖性方面、胶原诱导的关节炎、乳腺导管形态发生、表皮伤口愈合和VEGF诱导的血管生成相关过程。 

本文所用“α2整联蛋白拮抗剂”是指尤其当以化学计算量使用时，抑制α2整联蛋白的至少一种生物活性、抑制优选存在于以下细胞上的α2整联蛋白的活性的化合物：血小板、血管内皮细胞、上皮细胞、活化单核细胞/巨噬细胞、成纤维细胞、白细胞、淋巴细胞、活化嗜中性粒细胞和/或肥大细胞。本发明优选的α2拮抗剂为中和抗体。 

本文所用“中和抗体” (或“中和α2整联蛋白活性的抗体”)欲指其与α2整联蛋白的结合导致α2整联蛋白的至少一种生物活性受抑制、优选α2整联蛋白的血小板激活活性受抑制的抗体。可通过若干本领域已知的标准体外或体内测定法的一种或多种，通过测量α2整联蛋白生物活性的一个或多个指示物，来评价α2整联蛋白生物活性的这种抑制。这类测定法的实例描述于例如本发明的实施例中。 

因为α2整联蛋白具有例如上述功能，因此α2整联蛋白的活性对若干疾病例如与血小板活性增加有关的疾病具有作用。因此，α2整联蛋白拮抗剂，例如靶向α2整联蛋白或中和抗α2整联蛋白抗体或其抗原结合片段的抑制剂性肽或肽复合物可用于降低或抑制α2整联蛋白的作用(例如血小板活性)。因此，α2整联蛋白拮抗剂可用于改善、改进、抑制或预防若干的这类疾病，包括而不限于血栓形成、血管病、癌症包括新血管生成和转移、炎症、炎性疾病、自身免疫病和其特征在于血管生成异常或增加的疾病、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、移植反应、视神经炎、脊髓创伤、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化、雷诺综合征、实验性自身免疫性脑脊髓炎、斯耶格伦综合征、硬皮病、心血管病、银屑病和诱导炎性反应的感染。 

在具体的实施方案中，本文所述抗α2整联蛋白抗体或其抗原结合片段可与治疗性部分(“免疫缀合物”)例如细胞毒素、化学治疗药、免疫抑制剂或放射性同位素缀合。 

“保守氨基酸取代”是这样的取代，其中氨基酸残基被具有有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一氨基酸残基取代。总的来说，保守氨基酸取代基本上将不改变蛋白质的功能性质。在其中两个或更多个氨基酸序列通过保守取代而彼此不同的情况下，可上调相似性的百分比或程度以纠正取代的保守性质。用于进行这种调整的方法为本领域技术人员所熟知。参见例如Pearson (1994) Methods MoI. Biol. 24：307-331。具有有类似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括 

1) 脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；

2) 脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；

3) 含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；

4) 芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；

5) 碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；

6) 酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，和

7) 含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。

优选的保守氨基酸取代基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守置换是公开于Gonnet等(1992) Science 256：1443-45中的PAM250 log似然矩阵为正值的任何变化。“适度保守”置换是PAM250 log似然矩阵为非负值的任何变化。鉴于已知的遗传密码及重组和合成DNA技术，有技术的科研人员可容易地构建编码保守氨基酸变体的DNA。 

本文所用“非保守取代”或“非保守氨基酸交换”定义为一个氨基酸用上文所示7个标准氨基酸组1)-7)的不同组所列的另一个氨基酸进行交换。 

术语“基本同一性”或“基本上相同的”当指核酸或其片段时，表明以适当核苷酸插入或缺失与另一个核酸(或其互补链)进行最佳比对时，在至少约90%、更优选至少约95%、96%、97%、98%或99%核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性，这通过序列同一性的任何熟知的算法测定，例如下文论述的FASTA、BLAST或GAP。 

当用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本上相似”意指当进行最佳比对时，例如通过使用默认空位权重的程序GAP或BESTFIT，2个肽序列具有至少90%序列同一性，甚至更优选至少95%、98%或99%序列同一性。优选不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。 

多肽的序列相似性通常应用序列分析软件测量。蛋白质分析软件利用赋值于各种取代、缺失和其它修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性度量，使相似序列匹配。例如，GCG软件包含程序例如GAP和BESTFIT，其可与默认参数一起应用以测定密切相关多肽的序列同源性或序列同一性，例如来自不同的生物物种或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的同源多肽。参见例如GCG 6.1版。还可应用带有默认参数或推荐参数的FASTA (GCG 6.1版中的一个程序)比较多肽序列。FASTA (例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和检索序列之间最佳重叠区的比对和百分比序列同一性(Pearson (2000)，同上)。当将本发明的序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库比较时，另一种优选的比对是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见例如Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215：403 410和(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402，其每一份均通过引用结合到本文中。 

当在本申请中百分比提及序列同一性时，相对于较长序列的全长计算这些百分比，如果不是明确说明的话。这种相对于较长序列的全长的计算适用于核酸序列和多肽序列两者。 

本文所用疾病或病症的“治疗”、“医治”或“处理”意指实现以下的一个或多个：(a)降低/缩短病症的严重程度和/或持续时间；(b)限制或防止待治疗病症特有症状的发展；(c)抑制待治疗病症特有症状的恶化；(d)限制或防止之前已患病症的患者的该病症的复发；和(e)限制或防止之前有病症症状的患者的症状的复发。 

本文所用疾病或病症的“防止”、“预防”、“防治”或“预防法”意指防止病症在受试者中发生。 

本文所用表述“用于给药”和“待给予”与“准备给予”具有相同含义。换句话说，“用于给药”的活性化合物的陈述要理解为所述活性化合物经过配制并制成剂(doses)，使得所述活性化合物呈能够发挥其治疗活性的状态。 

术语“治疗有效量”或“治疗量”欲指可引起研究人员、兽医、医生或其它临床工作者正进行研究的组织、系统、动物或人的生物或医学反应的药物或药剂的量。术语“预防有效量”欲指可防止或降低组织、系统、动物或人中的生物或医学事件发生的风险的药物的量，其中研究人员、兽医、医生或其它临床工作者正在寻求预防所述生物或医学事件。具体地讲，可选择患者接受的剂量，以实现这样的肽或肽复合物的量，该量显示充分抑制α2整联蛋白功能从而可供预防性或治愈性治疗(预防、改善或痊愈) α2整联蛋白相关疾病或病症，所述疾病或病症优选选自血栓形成、血管病、癌症包括新血管生成和转移、炎症、炎性疾病、自身免疫病和其特征在于血管生成异常或增加的疾病、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、移植反应、视神经炎、脊髓创伤、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化、雷诺综合征、实验性自身免疫性脑脊髓炎、斯耶格伦综合征、硬皮病、心血管病、银屑病和诱导炎性反应的感染。 

本文所用“患者”意指可获益于用本文所述抗体及其抗原结合片段的治疗的任何哺乳动物或禽类。优选“患者”选自实验室动物(例如小鼠或大鼠)、驯养动物(包括例如豚鼠、兔、鸡、火鸡、猪、绵羊、山羊、骆驼、牛、马、驴、猫或狗)或灵长类动物包括黑猩猩和人类。特别优选的是“患者”是人类。 

“药学上可接受的”意指经联邦或州政府的监管机构批准或美国药典(United States Pharmacopeia-33/National Formulary-28 Reissue，由United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville Md.出版，出版日期：2010年4月)或其它公认药典所列举的以用于动物，更特别用于人。 

可通过本发明的治疗方法治疗的特定群体包括表明为α2整联蛋白激活性突变(功能获得突变，“GOF”)的受试者，患α2整联蛋白相关疾病或病症的受试者，所述疾病或病症优选选自：血栓形成、血管病、癌症、包括新血管生成和转移、炎症、炎性疾病、自身免疫病和其特征在于血管生成异常或增加的疾病、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、移植反应、视神经炎、脊髓创伤、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化、雷诺综合征、实验性自身免疫性脑脊髓炎、斯耶格伦综合征、硬皮病、心血管病、银屑病和诱导炎性反应的感染。 

本发明的实施方案

现在将进一步描述本发明。在下列段落中，更详细地描述了本发明的不同方面。如此限定的各方面可与任何其它一个方面或多方面组合，除非清楚说明有相反情况。具体来讲，表明是优选的或有利的任何特征可与表明是优选的或有利的任一个其它特征或多个特征组合，除非清楚说明有相反情况。

因此，本发明的第一方面涉及肽或肽复合物、优选分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述肽或肽复合物、抗体或片段与人α2整联蛋白的I结构域特异性结合，所述抗体或片段包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述抗体或片段与非人灵长类动物α2整联蛋白交叉反应，但不与非灵长类动物α2整联蛋白交叉反应。 

本发明的第二方面涉及肽或肽复合物、优选分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述肽或肽复合物、抗体或片段与人α2整联蛋白的I结构域特异性结合，所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述抗体或片段与参比抗体竞争结合参比抗体的表位，所述参比抗体包含由以登记号DSM 23944保藏于DSMZ的质粒编码的轻链，和和由(i)以登记号DSM 23946保藏于DSMZ的质粒或(ii)以登记号DSM 23945保藏于DSMZ的质粒编码的重链。 

第三方面，本发明涉及肽或肽复合物，其中所述肽或肽复合物包含一个或多个下列组分： 

LCDR1，其中LCDR1为RASESVESYGNSFIY (SEQ ID NO:6)或其功能活性变体，

LCDR2，其中LCDR2为lasnlas (SEQ ID NO:7)或其功能活性变体，

LCDR3，其中LCDR3为qqnnedpyt (SEQ ID NO:8)或其功能活性变体，

HCDR1，其中HCDR1为gytftsywMN (SEQ ID NO:3)或其功能活性变体，

HCDR2，其中HCDR2为RIDPSDSETHYNQKFK (SEQ ID NO:4)或其功能活性变体，和

HCDR3，其中HCDR3为VGRGYFDY (SEQ ID NO:5)或其功能活性变体，

且其中一个或多个组分a)-f)排列得允许肽或肽复合物与α2整联蛋白结合或作为异二聚体α2β1整联蛋白。

第四方面，本发明涉及用于治疗、预防或诊断α2整联蛋白相关病症或疾病的上述肽或肽复合物。 

SEQ ID NO:6-8的序列为所分析抗体的轻链的CDR，SEQ ID NO:3-5的序列为所分析抗体重链的CDR (通过序列分析测定)。按照本发明，肽或肽复合物，包含上述轻链CDR之一或其功能活性变体和/或重链CDR之一或其功能活性变体。实例包括以任何想得到的组合的包含1或2或3个上述HCDR和/或1或2或3个上述LCDR的肽或肽复合物。本发明的一个实施方案是包含3个LCDR和3个HCDR的肽或肽复合物，其中它们中至少一个是上述CDR a-f之一。 

在本发明的情况下，术语LCDR和LDR按同义词使用。同样地适用于术语HCDR和HDR。 

如果上述CDR以适当方式排列，则所述排列允许与α2整联蛋白特异性结合。允许抗原结合的CDR的适当排列是本领域已知的。迄今为止已开发和鉴定出各种不同的抗体形式或结合参数形式。任何的这些排列或任何其它的合适排列都可用于本发明的多肽或多肽复合物，只要形式或排列允许与α2整联蛋白特异性结合。 

由上述SEQ ID NO或其变体限定的CDR序列可以一条(多)肽链或以多肽或肽复合物排列。如果它们排列在一条(多)肽链内，则序列可通过一个或多个接头序列、优选肽接头连接，例如作为融合蛋白。按照一个实施方案，它们可如本领域所知嵌入天然或人工抗体支架或构架内。对于天然抗体，CDR在可变结构域内通过保守构架区支持。可对构架进行修饰以获得人工抗体，例如Fab、单链抗体等，下面将更详细地加以描述。 

如果CDR以肽复合物排列，则两个或更多个(多)肽通过非共价键合彼此结合，非共价键合包括氢键、离子键、范德瓦尔斯力和疏水相互作用。 

肽是由以线性链排列的两个或更多个α-氨基酸构成的有机化合物。氨基酸通过相邻氨基酸残基的羧基和氨基之间的肽键连接在一起。一般而言，遗传密码指定20个标准氨基酸。在合成后或甚至在合成期间，蛋白质中的残基可通过翻译后修饰而被化学修饰，这就改变了蛋白质的理化性质、折叠、稳定性、活性和最终的功能。本发明不同方面的肽可以是修饰的或未修饰的，只要它们能够结合α2整联蛋白。 

本领域中，术语“多肽”是指包含约20、约25、约30个或更多个氨基酸以线形方式通过肽键彼此偶联形成多肽链的分子。包含至少2个氨基酸的这种较短的分子一般称为肽。术语“蛋白质”通常是指包含一条或多条多肽链的分子。在本发明的情况下，术语肽、多肽和蛋白质按同义词使用。 

在本发明的情况下，术语“肽”或“多肽”在本发明的不同方面是指上文定义的肽或多肽，术语“肽复合物”是指包含上文定义的一个或多个肽和/或多肽(例如本发明的抗体、抗原结合片段和其它结合分子)的分子复合物。 

本文定义的肽及其肽复合物选择性识别和特异性结合α2整联蛋白抗原。在本发明的情况下，术语“与α2整联蛋白特异性结合”是指本发明的肽或肽复合物与α2整联蛋白或与α2整联蛋白I结构域或与具有任何其它多肽的复合物(例如具有另一个整联蛋白亚基的异二聚体复合物，例如α2β1整联蛋白复合物)中的α2整联蛋白特异性结合的能力。在一个优选的实施方案中，本发明的肽或肽复合物包含分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者由分离的单克隆抗体或其抗原结合片段组成，或者是分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。 

本文使用的术语“选择性”或“特异性”，当用来描述本发明的肽或肽复合物的结合特性时，是指所公开的肽或肽复合物对于除α2整联蛋白以外的蛋白不显示显著结合的事实，只是以下特定实例除外：其中补充肽/复合物以赋予α2整联蛋白特异性结合部分额外完全不同的特异性(例如其中将分子设计成结合或实现2种功能的双特异性或双功能分子，其至少一种与α2整联蛋白特异性结合)。在具体的实施方案中，α2整联蛋白特异性肽或其复合物与人α2整联蛋白结合，其K_D至少为1.2 x 10^-6。在具体的实施方案中，α2整联蛋白特异性肽或其复合物与人α2整联蛋白结合，其K_D为5 x 10^-7或以上、为2 x 10^-7或以上，或为1 x 10^-7或以上。在另外的实施方案中，α2整联蛋白特异性肽或其复合物与人α2整联蛋白结合，其K_D为1 x 10^-8或以上。在其它实施方案中，α2整联蛋白特异性肽或其复合物与人α2整联蛋白结合，其K_D为5 x 10^-9或以上，或为1 x 10^-9或以上。在进一步的实施方案中，α2整联蛋白特异性肽或其复合物与人α2整联蛋白结合，其K_D为2 x 10^-10或以上。在具体的实施方案中，α2整联蛋白特异性肽或其复合物在上述K_D下不与其它蛋白质结合。在其它实施方案中，α2整联蛋白特异性肽或其复合物与α2整联蛋白(例如人和/或非人灵长类动物α2整联蛋白)结合，其亲和力是对其非特异性抗原的亲和力的至少2倍。 

K_D涉及表示为摩尔浓度(M)的获自k_d (特定结合分子-靶蛋白相互作用的解离速率；亦称k_off)与k_a (特定结合分子-靶蛋白相互作用的结合速率；亦称k_on)之比即k_d/k_a的解离常数。K_D值可采用本领域已充分确立的方法确定。用于测定结合分子的K_D的优选方法描述于实施例1D。 

已表明α2整联蛋白特异性肽或其复合物剂量依赖性地抑制α2整联蛋白/配体相互作用(见图2和实施例)。因此，α2整联蛋白特异性肽或其复合物的特征可在于其对抗胶原与α2整联蛋白结合的能力。可在与对照的统计比较中，或通过本领域可获得的任何备选方法，定量测定被任何α2整联蛋白特异性肽或其复合物抑制的程度。在具体的实施方案中，抑制为约10%抑制或更高。在其它实施方案中，抑制为20%或更高、30%或更高、40%或更高、50%或更高、60%或更高、70%或更高、80%或更高、90%或更高或95%或更高。 

肽或肽复合物还可包含上述序列的功能活性变体。本发明的肽或肽复合物的功能活性变体的特征在于具有类似于完整肽所显示的生物活性，包括与α2整联蛋白结合、任选抑制α2整联蛋白的能力。在本发明的情况下，如果变体的活性(例如结合活性，任选表示为K_D)占无序列改变的肽/复合物活性的10%或更高、25%或更高、50%或更高、70%或更高、80%或更高、90%或更高、95%或更高或99%或更高，则变体是有功能活性的。实施例中给出了用于测定与α2整联蛋白的结合活性的合适方法。功能活性变体可通过有限数目的氨基酸取代、缺失和/或插入来获得。 

在本发明的优选实施方案中，本发明的肽或肽复合物的特征还在于一个或多个下列特征： 

(i) 1、2或3个组分a)-c)包含在轻链(VL)的可变结构域内

(ii) 1、2或3个组分d)-f)包含在重链(VH)的可变结构域内

(iii) 肽或肽复合物是抗体

(iv) 肽或肽复合物是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、(scFv)₂、双特异性抗体、多特异性抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体或微型抗体(minibody)、单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体

(v) 肽或肽复合物包含选自以下的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、结构域、人IgG4恒定结构域、人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域

(vi) 功能活性变体是这样的功能活性片段，其由SEQ ID NO: 3-8中任一个的氨基酸序列的60%或更多、70%或更多、80%或更多、90%或更多、95%或更多或99%或更多组成；

(vii) 功能活性变体是与SEQ ID NO: 3-8中任一个的氨基酸序列具有60%或更高、70%或更高、80%或更高、90%或更高、95%或更高或99%或更高序列同一性的功能活性片段，特别地其中功能活性变体来源于经过一个或多个保守氨基酸取代的SEQ ID NO: 3-8中任一个的氨基酸序列；

(viii) 肽或肽复合物包含以下氨基酸序列

— SEQ ID NO: 1或其功能活性变体，和/或

— SEQ ID NO: 2或其功能活性变体，和/或

— SEQ ID NO:9或其功能活性变体，和/或

— SEQ ID NO:10或其功能活性变体，和/或

— SEQ ID NO:11或其功能活性变体，和/或

(ix) 肽或肽复合物由以下的氨基酸序列组成

— SEQ ID NO: 9或其功能活性变体，和

— SEQ ID NO: 10或其功能活性变体，和

— 任选50个或更少的额外氨基酸残基，1-40、1-30、1-25、1-15、1-10或5、4、3、2或1个额外的氨基酸残基

(x) 肽或肽复合物由以下氨基酸序列组成

— SEQ ID NO: 9或其功能活性变体，和

— SEQ ID NO: 11或其功能活性变体，和

— 任选50个或更少的额外氨基酸残基，1-40、1-30、1-25、1-15、1-10或5、4、3、2或1个额外的氨基酸残基。

SEQ ID NO 1和2分别可获自图5：SEQ ID NO: 1是α2整联蛋白抗体可变轻链的氨基酸序列。SEQ ID NO:2是可变重链的氨基酸序列。 

SEQ ID NO 9、10和11可获自图7：SEQ ID NO:9是以IgG4形式产生的抗体的嵌合轻链的氨基酸序列(CDR用下划线表示)，SEQ ID NO:10是以IgG4形式产生的抗体的嵌合重链的氨基酸序列(CDR用下划线表示)，SEQ ID NO 11是呈具有6xhis标签的Fab形式的嵌合重链的氨基酸序列。恒定区来源于人序列主链(参见实施例)。本发明还涉及没有his标签的任何抗体构建体或片段、肽或多肽复合物。 

按照一个实施方案，HC和LC的可变结构域与相应的恒定区偶联形成嵌合HC或LC构建体。具体实施方案为与IGKC蛋白恒定区融合的嵌合α2整联蛋白抗体LC可变区(例如SEQ ID NO:9中)、与IGHG4的恒定区融合的嵌合α2整联蛋白抗体HC可变区(例如在SEQ ID NO:10中)或与IGHG1的恒定区CH1结构域融合的嵌合α2整联蛋白抗体HC可变区(例如在SEQ ID NO:11中)。 

如上文详细描述的，组分a)-c) (LC CDR)和d)-f) (HC CDR)分别通过对所产生和测试的单克隆抗体的轻链(VL)可变结构域和重链(VH)可变结构域进行测序而获得。因此，它们可包括在其中。它可以是任何天然存在的VL或VH构架或人工VL或VH构架。在本发明的一个实施方案中，一个或多个CDR (LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3)以主要的可变结构域的构架排列，即VL构架中的LCDR1、LCDR2和LCDR3和VH构架中的HCDR1、HCDR2和HCDR3。这意味着通过上述任何合适方法鉴定的CDR (参见SEQ ID NO: 1和2)单独、共同或以任何组合，可从所示领域(neighborhood)除去，并转移到另一(第二)可变结构域的构架中，从而取代第二可变结构域的CDR。各个可变结构域或抗体序列是本领域已知的，并可用于此目的。例如，目标CDR插入其中的可变结构域，可获自任何种系或重排的人可变结构域。可变结构域还可合成产生。可采用重组DNA技术将CDR区引入相应的可变结构域中。一种可实现这一点的方法描述于Marks等，1992, Bio/Technology 10:779-783。可变重链结构域可与可变轻链结构域配对以提供抗原结合部位。另外，可使用独立区域(例如仅可变重链结构域)结合抗原。 

上述重链或轻链嵌合体与通过之前段落描述的CDR移植产生的人工产生的轻链或重链的组合也是可想到的，只要它们显示α2整联蛋白结合特异性。 

本发明的肽或肽复合物可被糖基化。蛋白质的糖基化及其生理作用是本领域已知的。寡糖组分可显著(正面或负面)影响与治疗性糖蛋白的功效相关的性质，包括物理稳定性、蛋白酶攻击抗性、与免疫系统的相互作用、药代动力学和特定的生物活性。对于糖基化蛋白质的表达，本领域常使用哺乳动物宿主细胞(Cumming等，1991，Glycobiology 1：115-130；Jenkins等，1996，Nature Biotechn. 14：975-981)。实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、NSO-和SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞。还发表了自转基因动物产生糖基化蛋白质(Jenkins等，1996，同上)。此外，异源表达/过量表达糖基转移酶基因的工程改造的重组宿主细胞是本领域已知的(Bailey，1991，Science 252：1668-1675)。WO 9954342 (A1)公开了使用表达多种糖蛋白改性糖基转移酶活性的宿主细胞来产生糖基化蛋白质的方法，所述糖蛋白改性糖基转移酶增加携带据报道功能得到改进的二分枝GIcNAc的复合物N-联寡糖。 

按照本发明的一个实施方案，肽或肽复合物可与不同于本发明的肽或肽复合物的一个或多个分子(额外部分)偶联，整个复合物为“缀合物”。额外部分的实例包括例如一个或多个其它的生物分子，像肽或肽复合物、核酸(例如寡核苷酸或RNA分子，例如RNAi)或有机(小)分子、放射性部分。这些额外部分可具有其自身的功能，例如细胞毒性、治疗活性、免疫抑制活性等，或者它们出于其它原因可对整个缀合物是有益的(例如缀合物的稳定性提高或降低等)。本发明包括与一个或多个额外部分缀合的肽或肽复合物。在肽或肽复合物是抗体、其衍生物或片段的情况下，这种缀合物是免疫缀合物。免疫缀合物的实例是本领域已知的(参见例如WO05/103081)，例如一种或多种化学治疗物质、前药、细胞毒素、放射性同位素或放射性核苷酸、免疫抑制部分、治疗性寡核苷酸、抑制性RNA (RNAi)。 

按照一个实施方案，肽或肽复合物是抗体。天然存在的抗体是共有基本结构的球状血浆蛋白质(约150 kDa)，亦称免疫球蛋白。因为它们具有添加至氨基酸残基的糖链，因此是糖蛋白。各抗体的基本功能单位是免疫球蛋白(Ig)单体(只含一个Ig单位)；分泌的抗体还可为具有两个Ig单位的二聚体(像IgA一样)，具有4个Ig单位的四聚体(像硬骨鱼IgM一样)，或5个Ig单位的五聚体(像哺乳动物IgM一样)。在本发明中，合适形式的实例包括天然存在的抗体形式，包括称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的抗体同种型。 

Ig单体是由4条多肽链组成的“Y”型分子；两条相同的重链和2条相同的轻链通过半胱氨酸残基之间的二硫键连接。每条重链长为约440个氨基酸；每条轻链长为约220个氨基酸。重链和轻链各含有稳定其折叠的链内二硫键。每条链由称为Ig结构域的结构域组成。这些结构域含有约70-110个氨基酸，并根据其大小和功能归类为不同的类别(例如可变或V和恒定或C)。它们具有特有的免疫球蛋白折叠，其中两个β折叠产生“夹层(sandwich)”形状，通过保守半胱氨酸和其它带电荷的氨基酸之间的相互作用保持在一起。 

有5种类型的哺乳动物Ig重链，用α、δ、ε、γ和μ表示。存在的重链类型限定了抗体的同种型；这些链分别存在于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体中。 

不同的重链在大小和组成上不同；α和γ含有约450个氨基酸，δ含约500个氨基酸，而μ和ε具有约550个氨基酸。每个重链具有两个区，恒定区(C_H)和可变区(V_H)。在一个物种中，相同同种型的所有抗体中恒定区基本相同，但不同同种型的抗体中恒定区不同。重链γ、α和δ具有由3个串联Ig结构域和用于附加柔性的铰链区组成的恒定区；重链μ和ε具有由4个免疫球蛋白结构域组成的恒定区。在由不同B细胞产生的抗体中，重链的可变区不同，但对于由单一B细胞或B细胞克隆产生的全部抗体都相同。每条重链的可变区长为约110个氨基酸，并由单一Ig结构域组成。 

在哺乳动物中，有两种类型的免疫球蛋白轻链，用λ和κ表示。轻链具有两个连续的结构域：一个恒定结构域(CL)和一个可变结构域(VL)。轻链的近似长度为211-217个氨基酸。各抗体含有总是相同的2条轻链；哺乳动物中，每个抗体中仅存在一种轻链类型κ或λ。其它类型的轻链(例如ι链)存在于低级脊椎动物中，像软骨鱼(Chondrichthyes)和真骨鱼(Teleostei)。 

除天然存在的抗体以外，已开发出包括抗体片段的人工抗体形式。下面描述了其中的一些。然而，包含上述多肽或由上述多肽组成且允许与α2整联蛋白特异性结合的任何其它抗体形式也包括在本发明内。 

虽然所有抗体的通用结构非常相似，但如上文详述，给定抗体的独特性质取决于可变(V)区。更具体地讲为可变环，分别在轻(VL)链上3个和重(VH)链上3个，负责与抗原结合，即用于其抗原特异性。这些环称为互补决定区(CDR)。因为来自VH和VL结构域的CDR有助于抗原结合部位，因此正是重链和轻链的组合，而不是单独的任一个决定了最终的抗原特异性。 

因此，本文所用术语“抗体”意指与天然存在的抗体具有结构相似性，并且能够与α2整联蛋白特异性结合的任何多肽，其中结合特异性取决于SEQ ID NO: 3-8中的CDR。因此，“抗体”欲涉及特异性结合α2整联蛋白的免疫球蛋白衍生的结构，包括但不限于全长或完整抗体、抗原结合片段(物理上或概念上来源于抗体结构的片段)、前述任一种的衍生物、嵌合分子、前述任一种与另一多肽的融合物或选择性结合α2整联蛋白和任选抑制α2整联蛋白的功能的任何备选结构/组合物。抗体可以是包含至少一个抗原结合片段的任何多肽。抗原结合片段至少由重链可变结构域和轻链可变结构域组成，以两个结构域一起能够与特定抗原结合的方式排列。 

“全长”或“完全”抗体是指包含通过二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白质：(1)就重链而言，其包含可变区和包含3个结构域CH1、CH2和CH3的重链恒定区；和(2)就轻链而言，其包含轻链可变区和包含1个结构域CL的轻链恒定区。有关术语“完全抗体”，任何抗体都意味着具有天然存在的抗体的典型的整体结构域结构(即包含3或4个恒定结构域的重链和1个恒定结构域的轻链以及相应的可变结构域)，即使每个结构域可包含其它修饰，例如突变、缺失或插入，但这不会改变整体结构域结构。 

“抗体片段”还含有如上定义的至少一个抗原结合片段，并显示出与片段来源于其中的完全抗体基本相同的功能和特异性。用木瓜蛋白酶的有限蛋白水解性消化将Ig原型切成3个片段。两个相同的氨基端片段，各含有一个完整的L链和约半条H链，为抗原结合片段(Fab)。第3个片段，大小上相似，但含有具有其链内二硫键的两条重链的羧基端一半，是可结晶片段(Fc)。Fc含有糖、补体结合和FcR结合部位。有限的胃蛋白酶消化产生含有Fab片段和铰链区两者、包括H-H链内二硫键的单一F(ab')2片段。F(ab')2为二价用于抗原结合。可切割F(ab')2的二硫键，以获得Fab'。此外，重链和轻链的可变区可融合在一起形成单链可变片段(scFv)。 

由于完全大小的抗体的第一代存在某些问题，第二代抗体的许多只包含抗体的片段。可变结构域(Fv)是具有由一个VL和一个VH组成的完整抗原结合结构域的最小片段。只具有结合结构域的这类片段可通过酶促方法或例如在细菌和真核细胞表达相关的基因片段来产生。可采用不同的方法，例如仅Fv片段或包含包括Fv加上第一恒定结构域的“Y”的上臂之一的'Fab'片段。这些片段通常通过引入连接两条链的多肽来稳定，这就导致了单链Fv (scFv)的产生。或者，可以使用二硫键连接的Fv (dsFv)片段。所述片段的结合结构域可与任何恒定结构域组合以产生全长抗体，或者可与其它蛋白质和多肽融合。 

重组抗体片段是单链Fv (scFv)片段。一般而言，它对其抗原具有有高亲和力，并且可在各种宿主中表达。这些和其它性质使得scFv片段不仅仅适用于医学，而且还具有生物技术应用的潜力。如上文的详述，在scFv片段中，VH和VL结构域用亲水和柔性肽接头连接，这改进表达和折叠效率。通常使用约15个氨基酸的接头，其中最常使用(Gly₄Ser)₃接头。scFv分子可容易地被蛋白水解性降解，这取决于所用接头。随着遗传工程技术的发展，这些限制几乎都可被集中于功能和稳定性改进的研究所克服。实例是产生二硫键稳定的(或二硫键连接的) Fv片段，其中VH-VL二聚体被链内二硫键稳定。在VL和VH结构域之间的界面引入半胱氨酸，形成二硫桥，这将两个结构域保持在一起。 

scFv的解离产生单体scFv，其可复合成二聚体(双链抗体或(scFv)₂)、三聚体(三链抗体)或更大的聚集体例如TandAbs和Flexibodies。 

通过具有简单多肽连接的两个scFv (scFv)₂的结合或通过两个单体二聚化来产生具有两个结合结构域的抗体(双链抗体)。最简单的设计是具有两个功能性抗原结合结构域的双链抗体，所述结合结构域可相同、相似(二价双链抗体)，或者对不同的抗原具有特异性(双特异性双链抗体)。这些双特异性抗体允许例如将新的效应子功能(例如细胞毒性T细胞)募集至靶细胞，这使得它们非常有益于医学应用。 

最近，已开发出包含4个重链可变结构域和4个轻链可变结构域的抗体形式。这些的实例包括四价双特异性抗体(TandAbs和Flexibodies，Affimed Therapeutics AG，Heidelberg. Germany)。与双特异性双链抗体不同，双特异性TandAb是只由一个多肽组成的同二聚体。Flexibodies是具有双链抗体多聚体基序的scFv的组合，这产生具有高度柔性用于连接在细胞表面上彼此完全不同的两个分子的多价分子。如果存在两个以上的功能性抗原结合结构域，且如果其具有针对不同抗原的特异性，则该抗体是多特异性。 

某些抗体分子，包括但不限于Fv、scFv、双链抗体分子或结构域抗体(Domantis)可通过掺入二硫桥以连接VH和VL结构域而稳定。双特异性抗体可通过常规技术产生，其具体方法包括以化学法产生或来自杂合杂交瘤和其它技术，包括但不限于BiTE^TM技术(具备与肽接头具有不同特异性的抗原结合区的分子)和knobs-into-holes工程改造。 

优选抗体可以是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、(scFv)₂、双特异性抗体、多特异性抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体或微型抗体。 

在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。单克隆抗体是相同的单特异性抗体，因为它们由一种类型的免疫细胞产生，所述免疫细胞是单个母细胞的全部克隆。嵌合抗体是这样的抗体，其中通过遗传工程使一种物种的免疫球蛋白的至少一个区与另一物种的免疫球蛋白的另一个区融合，以降低其免疫原性。例如鼠V_L和V_H区可与人免疫球蛋白的其余部分融合。嵌合抗体的一个具体类型是人源化抗体。人源化抗体通过使编码非人抗体的CDR的DNA与产生人抗体的DNA合并(或反之亦然)来产生。然后，所得DNA构建体可用来表达和产生抗体，所述抗体通常不与非亲本抗体(non-human parenteral antibody)或不与嵌合抗体具有相同免疫原性，因为仅仅CDR是非人的。 

按照本发明不同方面的一个实施方案，可使用人或人源化抗体或其片段。因此，肽或肽复合物可包含选自以下的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、结构域、人IgG4恒定结构域、人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。在本发明的情况下，采用之前在WO2009/032661中描述的方法，使抗α2整联蛋白抗体人源化，但也可采用本领域已知的任何合适的人源化方法。 

如上文详述的，CDR还可以是权利要求书中规定的任何CDR的功能活性变体。在一个实施方案中，功能活性变体是功能活性片段，其由SEQ ID NO: 3-8中任一个的氨基酸序列的90%或更多组成。或者，功能活性变体是与SEQ ID NO: 3-8中任一个的氨基酸序列有70%或更高、优选80%或更高、更优选90%或95%或更高序列同一性的功能活性变体，特别是其中功能活性变体借助一个或多个保守氨基酸取代而来源于SEQ ID NO: 3-8中任一个的氨基酸序列(见下文)。 

在本发明不同方面的一个实施方案中，肽或肽复合物包含以下的氨基酸序列 

— SEQ ID NO: 1或其功能活性变体，和/或

— SEQ ID NO: 2或其功能活性变体，和/或

— SEQ ID NO: 9或其功能活性变体，和/或

— SEQ ID NO: 10或其功能活性变体，和/或

— SEQ ID NO: 11或其功能活性变体。

或者，肽或肽复合物由以下的氨基酸序列组成 

— SEQ ID NO: 9或其功能活性变体，和

— SEQ ID NO: 10或其功能活性变体，和

— 任选50个额外的氨基酸残基或1-40、1-30、1-25、1-15、1-10、1或2、3、4或5个额外的氨基酸残基。

或者，肽或肽复合物由以下的氨基酸序列组成 

— SEQ ID NO: 9或其功能活性变体，和

— SEQ ID NO: 11或其功能活性变体，和

— 任选50个额外的氨基酸残基或1-40、1-30、1-25、1-15、1-10、1或2、3、4或5个额外的氨基酸残基。

功能活性变体可以是这样的片段，其特征在于通过一个或多个缺失而来源于SEQ ID NO: 1或2或9或10或11的任何序列。一个或多个缺失可为C端、N端和/或内部的。片段可通过例如10个或更少的缺失例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个缺失，或者通过5个或更少的例如1、2、3、4或5个缺失，或者通过3个或更少的例如1、2或3个缺失，或者通过2个或更少的例如1或2个缺失，或者通过1个缺失而获得。本发明的功能活性片段的特征在于具有类似于由完全蛋白质显示的生物活性，包括结合α2整联蛋白和/或α2β1整联蛋白和任选抑制α2和/或α2β1整联蛋白的能力。在本发明的情况下，如果片段的活性占没有序列改变的氨基酸序列活性的10%或更高、优选25%或更高、更优选50%或更高、更优选70%或更高、更优选80%或更高、更优选90%或更高、更优选95%或更高、最优选或99%或更高，则抗原的片段是有功能活性的。在实施例中，特别是实施例1D中给出了用于测定与α2β1整联蛋白的结合活性的合适方法。 

变体的特征可在于通过一个或多个氨基酸修饰包括缺失、添加和/或取代而来源于SEQ ID NO: 1或2或9或10或11的任何序列。修饰可以是C端、N端和/或内部的。片段可通过10个或更少的缺失例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个缺失，或者通过5个或更少的例如1、2、3、4或5个缺失，或者通过3个或更少的例如1、2或3个缺失，或者通过2个或更少的例如1或2个缺失，或者通过1个缺失而获得。本发明的功能活性变体的特征在于具有类似于由完全蛋白质显示的生物活性，包括结合α2整联蛋白和/或α2β1整联蛋白和任选抑制α2和/或α2β1整联蛋白的能力。在本发明的情况下，如果变体的活性占没有序列改变的氨基酸序列的活性的10%或更高、优选25%或更高、更优选50%或更高、甚至更优选70%或更高、还更优选80%或更高、尤其90%或更高、特别95%或更高、最优选99%或更高，则变体是有功能活性的。 

(ix、x或xi)的添加的氨基酸可以是位于C端、N端和/或内部的。按照一个实施方案，有50个或更少的添加，或40个或更少的或30个或更少的或20个或更少的添加或10个或更少的添加，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，或者5个或更少的添加，例如1、2、3、4或5个，或者3个或更少的添加，例如1、2或3个，或2个或更少的，例如1或2个，或者仅1个添加。 

添加的氨基酸残基可为任何氨基酸，其可以是天然存在的和否则其它的L-氨基酸和/或D-氨基酸。优选氨基酸是任何天然存在的氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。 

氨基酸还可以是修饰氨基酸或不常见的氨基酸。这些的实例为2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基-异丁酸、2-氨基庚二酸、2,4-二氨基丁酸、锁链素、2,2’-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸或鸟氨酸。另外，可对氨基酸进行修饰，例如翻译后修饰。修饰的实例包括乙酰化、酰胺化、封闭(blocking)、甲酰化、γ-羧基谷氨酸羟基化、糖基化、甲基化、磷酸化和硫酸化。如果多于一个额外的氨基酸残基或异源氨基酸残基存在于肽中，则氨基酸残基可彼此相同或不同。 

序列同一性的百分比可通过例如序列比对测定。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。各种程序和比对算法描述于例如Smith和Waterman，Adv. Appl. Math. 2：482，1981或Pearson和Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85：2444，1988。 

NCBI基础局部比对检索工具(BLAST) (Altschul等，J. Mol. Biol. 215：403-410，1990)可获自若干来源，包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和互连网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联用。SEQ ID NO: 1-8中任一个的序列的变体通常特征在于使用NCBI Blast 2.0、设置为默认参数的空位blastp。对于至少30个氨基酸的氨基酸序列的比较，采用设置为默认参数(空位存在成本(gap existence cost)为11，每残基空位成本为1)的默认BLOSUM62矩阵，应用Blast 2序列函数。当比对短肽(小于约30个氨基酸)时，采用设置为默认参数(开放空位(open gap) 9，延伸空位1罚分)的PAM30矩阵，应用Blast 2序列函数进行比对。由位于Bethesda，Maryland的国家生物技术信息中心维护的网站描述了用于确定这类短窗(例如15个氨基酸或更少)内的序列同一性的方法。 

在本发明不同方面的另一个实施方案中，如上定义的功能活性变体衍生自SEQ ID NO: 1或2或9或10或11任一个的氨基酸序列(所述序列的任一个由一个或多个保守氨基酸取代而得到的序列)。 

本领域技术人员应了解，保守氨基酸取代是氨基酸残基用赋予类似或更佳(用于预期目的)功能和/或化学特性的氨基酸残基置换的取代。例如，保守氨基酸取代常常是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。本领域已定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括以下氨基酸：具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。这类修饰不是设计成显著降低或改变多肽(复合物)的结合或功能抑制特性，但是它们可改进这类性质。产生取代的目的并不明显，可包括但绝不限于用能够更好地保持或加强分子的结构、分子的电性或疏水性或分子的大小置换残基。例如，可能仅仅需要将较不需要的残基用相同极性或电性的残基取代。这类修饰可通过本领域已知的标准技术引入，例如位点定向诱变和PCR介导的诱变。本领域技术人员实现保守氨基酸取代的一种具体方法是丙氨酸扫描诱变。然后采用本领域可获得的或实施例中描述的功能测定法，测定被改变的多肽所保持的或更好的功能。在本发明更优选的实施方案中，SEQ ID NO: 1或2或9或10或20中任一序列的保守取代的数目为20个或更少例如20、19、18、17、16、15、14、13、12或11个，优选10个或更少例如10、9、8、7或6个，尤其5或更少例如5、4、3个，特别2或1个。 

在本发明不同方面的又一个实施方案中，肽或肽复合物包含一个或多个功能活性变体， 

— 其中LDR1的功能活性变体包含氨基酸11位处的突变，特别是11Asn→Gln；

— 其中HDR2的功能活性变体包含氨基酸6位处的突变，特别是6Asp→Glu；

— 其中SEQ ID NO: 1的功能活性变体包含氨基酸9、12、15、22、34、46、47、80、83、85、87和/或89位的一个或多个突变，优选选自9Ala→Ser、12Ala→Ser、15Leu→Val、15Leu→Pro、22Ser→Thr、34Asn→Gln、46Gln→Lys、47Ala→Pro、80Asp→Asn、83Glu→Gln、85Asp→Glu、87Ala→Thr和89Thr→Asn，或者其中SEQ ID NO:1的功能活性变体包含下列突变(LC1)，即9Ala→Ser或15Leu→Val或46Gln→Lys或83Glu→Gln或9Ala→Ser和15Leu→Val或9Ala→Ser和46Gln→Lys或9Ala→Ser和83Glu→Gln或15Leu→Val和46Gln→Lys或15Leu→Val和83Glu→Gln或46Gln→Lys和83Glu→Gln或9Ala→Ser和15Leu→Val和46Gln→Lys或9Ala→Ser和15Leu→Val和83Glu→Gln或9Ala→Ser和46Gln→Lys和83Glu→Gln或15Leu→Val和46Gln→Lys和83Glu→Gln或表5的LC1：9Ala→Ser和15Leu→Val和46Gln→Lys和83Glu→Gln，或者其中SEQ ID NO:1的功能活性变体包含下列突变(LC2)，即9Ala→Ser或15Leu→Val或34Asn→Gln或46Gln→Lys或83Glu→Gln或9Ala→Ser和15Leu→Val或9Ala→Ser和34Asn→Gln或9Ala→Ser和46Gln→Lys或9Ala→Ser和83Glu→Gln或15Leu→Val和34Asn→Gln或15Leu→Val和46Gln→Lys或15Leu→Val和83Glu→Gln或34Asn→Gln和46Gln→Lys或34Asn→Gln和83Glu→Gln或9Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln或9Ala→Ser和15Leu→Val和46Gln→Lys或9Ala→Ser和15Leu→Val和83Glu→Gln或9Ala→Ser和34Asn→Gln和46Gln→Lys或9Ala→Ser和34Asn→Gln和83Glu→Gln或9Ala→Ser和46Gln→Lys和83Glu→Gln或15Leu→Val和34Asn→Gln和46Gln→Lys或15Leu→Val和34Asn→Gln和83Glu→Gln或15Leu→Val和46Gln→Lys和83Glu→Gln或34Asn→Gln和46Gln→Lys和83Glu→Gln或9Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln和46Gln→Lys或9Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln和83Glu→Gln或9Ala→Ser和15Leu→Val和46Gln→Lys和83Glu→Gln或9Ala→Ser和34Asn→Gln和46Gln→Lys和83Glu→Gln或15Leu→Val和34Asn→Gln和46Gln→Lys和83Glu→Gln或表5的LC2：9Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln和46Gln→Lys和83Glu→Gln，或者其中SEQ ID NO:1的功能活性变体包含下列突变(LC3)，即9Ala→Ser或12Ala→Ser或15Leu→Val或83Glu→Gln或85Asp→Glu或9Ala→Ser和12Ala→Ser或9Ala→Ser和15Leu→Val或9Ala→Ser和83Glu→Gln或9Ala→Ser和85Asp→Glu或12Ala→Ser和15Leu→Val或12Ala→Ser和83Glu→Gln或12Ala→Ser和85Asp→Glu或15Leu→Val和83Glu→Gln或15Leu→Val和85Asp→Glu或83Glu→Gln和85Asp→Glu或9Ala→Ser和12Ala→Ser和15Leu→Val或9Ala→Ser和12Ala→Ser和83Glu→Gln或9Ala→Ser和12Ala→Ser和85Asp→Glu或9Ala→Ser和15Leu→Val和83Glu→Gln或9Ala→Ser和15Leu→Val和85Asp→Glu或9Ala→Ser和83Glu→Gln和85Asp→Glu或12Ala→Ser和15Leu→Val和83Glu→Gln或12Ala→Ser和15Leu→Val和85Asp→Glu或12Ala→Ser和83Glu→Gln和85Asp→Glu或15Leu→Val和83Glu→Gln和85Asp→Glu或9Ala→Ser和12Ala→Ser和15Leu→Val和83Glu→Gln或9Ala→Ser和12Ala→Ser和15Leu→Val和85Asp→Glu或9Ala→Ser和12Ala→Ser和83Glu→Gln和85Asp→Glu或9Ala→Ser和15Leu→Val和83Glu→Gln和85Asp→Glu或12Ala→Ser和15Leu→Val和83Glu→Gln和85Asp→Glu或表5的(LC3)：9Ala→Ser和12Ala→Ser和15Leu→Val和83Glu→Gln和85Asp→Glu，或者其中SEQ ID NO:1的功能活性变体包含下列突变(LC4)，即9Ala→Ser或12Ala→Ser或15Leu→Val或34Asn→Gln或83Glu→Gln或85Asp→Glu或9Ala→Ser和12Ala→Ser或9Ala→Ser和15Leu→Val或9Ala→Ser和34Asn→Gln或9Ala→Ser和83Glu→Gln或9Ala→Ser和85Asp→Glu或12Ala→Ser和15Leu→Val或12Ala→Ser和34Asn→Gln或12Ala→Ser和83Glu→Gln或12Ala→Ser和85Asp→Glu或15Leu→Val和34Asn→Gln或15Leu→Val和83Glu→Gln或15Leu→Val和85Asp→Glu或34Asn→Gln和83Glu→Gln或34Asn→Gln和85Asp→Glu或83Glu→Gln和85Asp→Glu或9Ala→Ser和12Ala→Ser和15Leu→Val或9Ala→Ser和12Ala→Ser和34Asn→Gln或9Ala→Ser和12Ala→Ser和83Glu→Gln或9Ala→Ser和12Ala→Ser和85Asp→Glu或9Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln或9Ala→Ser和15Leu→Val和83Glu→Gln或9Ala→Ser和15Leu→Val和85Asp→Glu或9Ala→Ser和34Asn→Gln和83Glu→Gln或9Ala→Ser和34Asn→Gln和85Asp→Glu或9Ala→Ser和83Glu→Gln和85Asp→Glu或12Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln或12Ala→Ser和15Leu→Val和83Glu→Gln或12Ala→Ser和15Leu→Val和85Asp→Glu或12Ala→Ser和34Asn→Gln和83Glu→Gln或12Ala→Ser和34Asn→Gln和85Asp→Glu或12Ala→Ser和83Glu→Gln和85Asp→Glu或15Leu→Val和34Asn→Gln和83Glu→Gln或15Leu→Val和34Asn→Gln和85Asp→Glu或15Leu→Val和83Glu→Gln和85Asp→Glu或34Asn→Gln和83Glu→Gln和85Asp→Glu或9Ala→Ser和12Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln或9Ala→Ser和12Ala→Ser和15Leu→Val和83Glu→Gln或9Ala→Ser和12Ala→Ser和15Leu→Val和85Asp→Glu或9Ala→Ser和12Ala→Ser和34Asn→Gln和83Glu→Gln或9Ala→Ser和12Ala→Ser和34Asn→Gln和85Asp→Glu或9Ala→Ser和12Ala→Ser和83Glu→Gln和85Asp→Glu或9Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln和83Glu→Gln或9Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln和85Asp→Glu或9Ala→Ser和15Leu→Val和83Glu→Gln和85Asp→Glu或9Ala→Ser和34Asn→Gln和83Glu→Gln和85Asp→Glu或12Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln和83Glu→Gln或12Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln和85Asp→Glu或12Ala→Ser和15Leu→Val和83Glu→Gln和85Asp→Glu或12Ala→Ser和34Asn→Gln和83Glu→Gln和85Asp→Glu或9Ala→Ser和12Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln和83Glu→Gln或9Ala→Ser和12Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln和85Asp→Glu或9Ala→Ser和12Ala→Ser和34Asn→Gln和83Glu→Gln和85Asp→Glu或9Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln和83Glu→Gln和85Asp→Glu或12Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln和83Glu→Gln和85Asp→Glu或表5的(LC4)：9Ala→Ser和12Ala→Ser和15Leu→Val和34Asn→Gln和83Glu→Gln和85Asp→Glu，或者其中SEQ ID NO:1的功能活性变体包含下列突变(LC5)，即15Leu→Pro、22Ser→Thr、47Ala→Pro、80Asp→Asn、87Ala→Thr、89Thr→Asn或15Leu→Pro和22Ser→Thr或15Leu→Pro和47Ala→Pro或15Leu→Pro和80Asp→Asn或15Leu→Pro和87Ala→Thr或15Leu→Pro和89Thr→Asn或22Ser→Thr和47Ala→Pro或22Ser→Thr和80Asp→Asn或22Ser→Thr和87Ala→Thr或22Ser→Thr和89Thr→Asn或47Ala→Pro和80Asp→Asn或47Ala→Pro和87Ala→Thr或47Ala→Pro和89Thr→Asn或80Asp→Asn和87Ala→Thr或80Asp→Asn和89Thr→Asn或87Ala→Thr和89Thr→Asn或15Leu→Pro和22Ser→Thr和47Ala→Pro或15Leu→Pro和22Ser→Thr和80Asp→Asn或15Leu→Pro和22Ser→Thr和87Ala→Thr或15 Leu→Pro和22Ser→Thr和89Thr→Asn或15Leu→Pro和47Ala→Pro和80Asp→Asn或15Leu→Pro和47Ala→Pro和87Ala→Thr或15Leu→Pro和47Ala→Pro和89Thr→Asn或15Leu→Pro和80Asp→Asn和87Ala→Thr或15Leu→Pro和80Asp→Asn和89Thr→Asn或15Leu→Pro和87Ala→Thr和89Thr→Asn或22Ser→Thr和47Ala→Pro和80Asp→Asn或22Ser→Thr和47Ala→Pro和87Ala→Thr或22Ser→Thr和47Ala→Pro和89Thr→Asn或22Ser→Thr和80Asp→Asn和87Ala→Thr或22Ser→Thr和80Asp→Asn和89Thr→Asn或22Ser→Thr和87Ala→Thr和89Thr→Asn或47Ala→Pro和80Asp→Asn和87Ala→Thr或47Ala→Pro和80Asp→Asn和89Thr→Asn或47Ala→Pro和87Ala→Thr和89Thr→Asn或80Asp→Asn和87Ala→Thr和89Thr→Asn或15Leu→Pro和22Ser→Thr和47Ala→Pro和80Asp→Asn或15Leu→Pro和22Ser→Thr和47Ala→Pro和87Ala→Thr或15Leu→Pro和22Ser→Thr和47Ala→Pro和89Thr→Asn或15Leu→Pro和22Ser→Thr和80Asp→Asn和87Ala→Thr或15Leu→Pro和22Ser→Thr和80Asp→Asn和89Thr→Asn或15Leu→Pro和22Ser→Thr和87Ala→Thr和89Thr→Asn或15Leu→Pro和47Ala→Pro和80Asp→Asn和87Ala→Thr或15Leu→Pro和47Ala→Pro和80Asp→Asn和89Thr→Asn或15Leu→Pro和47Ala→Pro和87Ala→Thr和89Thr→Asn或15Leu→Pro和80Asp→Asn和87Ala→Thr和89Thr→Asn或22Ser→Thr和47Ala→Pro和80Asp→Asn和87Ala→Thr或22Ser→Thr和47Ala→Pro和80Asp→Asn和89Thr→Asn或22Ser→Thr和47Ala→Pro和87Ala→Thr和89Thr→Asn或22Ser→Thr和80Asp→Asn和87Ala→Thr和89Thr→Asn或47Ala→Pro和80Asp→Asn和87Ala→Thr和89Thr→Asn或15Leu→Pro和22Ser→Thr和47Ala→Pro和80Asp→Asn和87Ala→Thr或15Leu→Pro和22Ser→Thr和47Ala→Pro和80Asp→Asn和89Thr→Asn或15Leu→Pro和22Ser→Thr和47Ala→Pro和87Ala→Thr和89Thr→Asn或15Leu→Pro和22Ser→Thr和80Asp→Asn和87Ala→Thr和89Thr→Asn或15Leu→Pro和47Ala→Pro和80Asp→Asn和87Ala→Thr和89Thr→Asn或22Ser→Thr和47Ala→Pro和80Asp→Asn和87Ala→Thr和89Thr→Asn或表5的(LC5)：15Leu→Pro和22Ser→Thr和47Ala→Pro和80Asp→Asn和87Ala→Thr和89Thr→Asn和/或其中SEQ ID NO: 2的功能活性变体包含氨基酸5、7、11、12、17、20、38、40、43、55、61、65、66、67、76、81、82、87、91、93、112、113和/或116位处的一个或多个突变，特别选自5His→Val、7Pro→Ser、11Leu→Val、12Val→Lys、17Pro→Ser、20Leu→Val、38Lys→Arg、40Arg→Ala、43Arg→Gln、55Asp→Glu、61Asn→Ala、65Lys→Gln、66Asp→Gly、67Lys→Arg、76Ser→Thr、81Ile→Met、82Gln→Glu、87Thr→Arg、91Ser→Thr、93Val→Lys、112Thr→Leu、113Leu→Val和116Ser→Val，或者其中SEQ ID NO:2的功能活性变体包含下列突变(HC1)，即43Arg→Gln或67Lys→Arg或116Ser→Val或43Arg→Gln和67Lys→Arg或43Arg→Gln和116Ser→Val或67Lys→Arg和116Ser→Val或表6的(HC1)：43Arg→Gln和67Lys→Arg和116Ser→Val，或者其中SEQ ID NO:2的功能活性变体包含下列突变(HC2)，即43Arg→Gln或55Asp→Glu或67Lys→Arg或116Ser→Val或43Arg→Gln和55Asp→Glu或43Arg→Gln和67Lys→Arg或43Arg→Gln和116Ser→Val或55Asp→Glu和67Lys→Arg或55Asp→Glu和116Ser→Val或67Lys→Arg和116Ser→Val或43Arg→Gln和55Asp→Glu和67Lys→Arg或43Arg→Gln和55Asp→Glu和116Ser→Val或43Arg→Gln和67Lys→Arg和116Ser→Val或55Asp→Glu和67Lys→Arg和116Ser→Val或表6的(HC2)：43Arg→Gln和55Asp→Glu和67Lys→Arg和116Ser→Val，或者其中SEQ ID NO:2的功能活性变体包含下列突变(HC3)，即17Pro→Ser或116Ser→Val或表6的(HC3)：17Pro→Ser和116Ser→Val，或其中SEQ ID NO:2的功能活性变体包含下列突变(HC4)，即17Pro→Ser或93Val→Lys或116Ser→Val或17Pro→Ser和93Val→Lys或17Pro→Ser和116Ser→Val或93Val→Lys和116Ser→Val或表6的(HC4)：17Pro→Ser和93Val→Lys和116Ser→Val，或者其中SEQ ID NO:2的功能活性变体包含下列突变(HC5)，即：17Pro→Ser或55Asp→Glu或116Ser→Val或17Pro→Ser和55Asp→Glu或17Pro→Ser和116Ser→Val或55Asp→Glu和116Ser→Val或表6的(HC5)：17Pro→Ser和55Asp→Glu和116Ser→Val，或者其中SEQ ID NO:2的功能活性变体包含下列突变(HC6)，即12Val→Lys或55Asp→Glu或93Val→Lys或116Ser→Val或12Val→Lys和55Asp→Glu或12Val→Lys和93Val→Lys或12Val→Lys和116Ser→Val或55Asp→Glu和93Val→Lys或55Asp→Glu和116Ser→Val或93Val→Lys和116Ser→Val或12Val→Lys和55Asp→Glu和93Val→Lys或12Val→Lys和55Asp→Glu和116Ser→Val或12Val→Lys和93Val→Lys和116Ser→Val或55Asp→Glu和93Val→Lys和116Ser→Val或表6的(HC6)：12Val→Lys和55Asp→Glu和93Val→Lys和116Ser→Val，或者其中SEQ ID NO:2的功能活性变体包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或全部下列突变(HC6)：5His→Val、7Pro→Ser、11Leu→Val、12Val→Lys、17Pro→Ser、20Leu→Val、38Lys→Arg、40Arg→Ala、43Arg→Gln、61Asn→Ala、65Lys→Gln、66Asp→Gly、67Lys→Arg、76Ser→Thr、81Ile→Met、82Gln→Glu、87Thr→Arg、91Ser→Thr、112Thr→Leu、113Leu→Val。

在表4、表5和表6的情况下，根据实施例中描述的考虑事项，引入位置和突变。可能只有一个突变，或多个突变的组合，特别是表4、表5和表6给出的组合的任一个。此外，肽或肽复合物可包含上列变体轻链之一的一个或多个突变连同上列变体重链的一个或多个，例如包含下列突变/功能变体的组合之一或由下列突变/功能变体的组合之一组成：LC1和HC1、LC1和HC2、LC1和HC3、LC1和HC4、LC1和HC5、LC1和HC6、LC1和HC7、LC2和HC1、LC2和HC2、LC2和HC3、LC2和HC4、LC2和HC5、LC2和HC6、LC2和HC7、LC3和HC1、LC3和HC2、LC3和HC3、LC3和HC4、LC3和HC5、LC3和HC6、LC3和HC7、LC4和HC1、LC4和HC2、LC4和HC3、LC4和HC4、LC4和HC5、LC4和HC6、LC4和HC7、LC5和HC1、LC5和HC2、LC5和HC3、LC5和HC4、LC5和HC5、LC5和HC6、LC5和HC7。 

此外，可能需要加入例如用于检测或纯化本发明的肽或肽复合物的标记。合适的标记包括而不限于标签(例如6 His (或六His)标签、7 His、8 His、GlyGlyGlyGlySer、(GlyGlyGlyGlySer)₂ Strep标签、HA标签、c-myc标签或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签)、荧光标记(例如FITC、荧光素、罗丹明、Cy染料或Alexa)、酶标记(例如青霉素酶、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、放射性标记(例如³H、³²P、³⁵S、¹²⁵I或¹⁴C)。此外，可将多肽(复合物)加至支持体，特别是固体支持体例如阵列、珠粒(例如玻璃珠或磁珠)、纤维、膜等。技术人员能够通过选择合适的其它组分，使包含本发明的多肽或多肽复合物的结合分子和其它组分适于既定用途。 

按照本发明的另一个实施方案，肽或肽复合物显示下列特性A-E的一个或多个(即A或B或C或D或E或A和B或A和C或A和D或A和E或B和C或B和D或B和E或C和D或C和E或A和B和C或A和B和D或A和B和D或A和B和E或A和C和D或A和C和E或A和D和E或B和C和D或B和C和E或B和D和E或A和B和C和D或A和B和C和E或A和C和D和E或B和C和D和E或A和B和C和E)： 

A) 根据表11提供的数据的动态结合常数(用表面等离振子共振测定，例如通过Biacore)。

B) 轻链的分子量如下：23.73+/-0.05 kDa或23.73 kDa (LC1)或23.74 +/-0.05 kDa或23.7 kDa (LC2)或23.75 +/-0.05 kDa或23.8 kDa (LC3)或23.77 +/-0.05 kDa或23.77 kDa (LC4)或23.79 +/-0.05 kDa或23.79 kDa (LC5) 50.31 +/-0.05 kDA，和/或重链的分子量如下：50.31 kDa (HC1)或50.33 +/-0.05 kDA或50.33 kDa (HC2)或50.30 +/- 0.05 kDa或50.30 kDa (HC3)或50.33 +/- 0.05 kDa或50.33 kDa (HC4)或50.32 +/- 0.05 kDa或50.32 kDa (HC5)或50.35 +/- 0.05 kDa或50.35 kDa (HC6)或50.19 +/- 0.05 kDa或50.19 kDa (HC7)， 

C) 抑制经洗涤人血小板与胶原结合的IC50值为<0.1、<0.09、<0.08、<0.07、<0.06、<0.05、<0.04、<0.03、<0.02或< 0.01 μg/ml，在静态条件下测定，

D) 抑制来自富含血小板的血浆的人血小板与胶原结合的IC50为<0.3、<0.2、<0.1、<0.15、<0.14或<0.13 μg/ml，在静态条件下测定，

E) 用大小排阻层析法测定的聚集百分比<10、<9、<8、<7、<6、<5、<4、<3、<2.5、<2、<1.5、<1或<0.5%。

第五方面，本发明涉及编码本发明的肽或肽复合物的一种或多种核酸。 

本发明的核酸分子可呈RNA的形式例如mRNA或cRNA，或呈DNA的形式，包括例如cDNA和基因组DNA，例如通过克隆获得或通过化学合成技术产生或通过其组合产生的。DNA可以是三链、双链或单链的。单链DNA可以是编码链，亦称有义链，或者它可以是非编码链，亦称反义链。除其它之外，本文所用核酸分子还指单链和双链DNA、作为单链和双链RNA的混合物的DNA、作为单链区和双链区的混合物的RNA、包含DNA和RNA的可以是单链或更常为双链或三链或单链和双链区的混合物的杂交分子。另外，本文所用核酸分子是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。 

此外，核酸可含有一个或多个修饰碱基。这类核酸例如在核糖-磷酸骨架中还可含有修饰以提高这类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。因此，具有出于稳定性或出于其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA是“核酸分子”，因为该特征是本文预期的。此外，包含不常见碱基(例如肌苷)或修饰碱基(例如三苯甲基化碱基)的DNA或RNA (仅举2个例子来说)是本发明情况范围内的核酸分子。应理解已对用作本领域技术人员已知的许多有用目的的DNA和RNA进行大量修饰。本文采用的术语核酸分子包括核酸分子的这类化学、酶或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(尤其包括简单细胞和复杂细胞)特有的DNA和RNA的化学形式。例如，可进行不影响由核酸编码的多肽的核苷酸取代，因此编码上文定义的抗原或其片段或功能活性变体的任何核酸分子都包括在本发明内。 

此外，可采用标准技术例如标准克隆技术，将编码本发明一种或多种多肽(包括其片段或功能活性变体)的任何核酸分子与任何所需调节序列、前导序列、异源标记序列或异源编码序列功能性地连接以产生融合蛋白。 

一般而言，本发明的核酸可通过内切核酸酶和/或外切核酸酶和/或聚合酶和/或连接酶和/或重组酶或者本领域技术从业人员已知的产生核酸的其它方法操作核酸，而最初在体外或在培养物的细胞中形成。 

在本发明不同方面的另一个实施方案中，一个或多个核酸位于载体中。载体可另外包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点、一个或多个治疗性基因和/或选择标记基因和本领域已知的其它遗传元件，例如指导所编码的蛋白质转录、翻译和/或分泌的调节元件。可使用载体转导、转化或感染细胞，从而使细胞表达除细胞原有核酸和/或蛋白质以外的核酸和/或蛋白质。载体任选包括有助于实现核酸进入细胞的物质，例如病毒颗粒、脂质体、蛋白质外壳等。本领域已知通过标准分子生物学技术用于蛋白质表达的合适表达载体的很多类型。这类载体选自常规载体类型，包括昆虫例如杆状病毒表达系统或酵母、真菌、细菌或病毒表达系统。其多种类型是本领域已知的其它合适的表达载体也可用于此目的。用于获得这类表达载体的方法是众所周知的(参见例如Sambrook等, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York (1989))。在一个实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体包括但不限于逆转录病毒和腺病毒载体。 

用于通过该方法转染的合适宿主细胞或细胞系包括细菌细胞。例如，大肠杆菌的不同菌株在生物技术领域作为宿主细胞是众所周知的。枯草芽胞杆菌(B. subtilis)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)的不同菌株和其它杆菌等也可用于该方法。可获得本领域技术人员已知的酵母细胞的许多菌株作为表达本发明的肽的宿主细胞。其它真菌细胞或昆虫细胞例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugipedera) (Sf9)细胞也可用作表达系统。或者，可使用哺乳动物细胞，例如人293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、猴COS-1细胞系或来源于瑞士的鼠3T3细胞、BALB/c或NIH小鼠。还有其它合适的宿主细胞以及用于转染、培养、扩增、筛选、生产和纯化的方法是本领域已知的。 

在本发明不同方面的一个实施方案中，可使用杂交瘤细胞系，表达所需单克隆抗体的杂交瘤细胞系通过众所周知的常用技术产生。在本发明的情况下，杂交瘤细胞能够产生与α2整联蛋白、特别是与α2β1整联蛋白特异性结合的抗体。杂交瘤细胞可通过使正常激活的产抗体B细胞与骨髓瘤细胞融合来产生。具体来讲，杂交瘤细胞可如下产生：从已用有关抗原攻击的动物脾脏中取出B细胞。然后使这些B细胞与可在培养物中无限生长的骨髓瘤肿瘤细胞融合。通过使细胞膜更通透来进行这种融合。作为癌细胞的融合杂交细胞(称为杂交瘤)可快速且无限地繁殖，并可产生大量的所需抗体。它们需通过有限稀释进行选择，随后克隆。含有白介素-6 (例如briclone)的补充培养基通常对于该步骤是必需的。通过将新融合的原代杂交瘤细胞在选择培养基中，具体地讲为含有1 x浓度HAT的培养基中培养大约10-14天以进行选择。在使用HAT后，常常需要使用含有HT的培养基。在鉴定出阳性原代杂交瘤细胞后进行克隆。 

可通过在合适的宿主细胞中表达本发明的核酸来产生本发明的肽或肽复合物。因此，另一方面，本发明涉及用于产生本发明的肽或肽复合物的方法，所述方法包括使包含本发明核酸的宿主细胞在允许抗体表达的条件下培养，任选从宿主细胞中回收肽或肽复合物。 

为此，宿主细胞可通过例如常规方法转染，例如用至少一种含有本发明核酸的表达载体在转录调节序列控制下进行电穿孔。然后将转染或转化的宿主细胞培养在允许蛋白质表达的条件下。通过本领域技术人员已知的合适方法，从细胞中(或从培养基中，如果胞外表达的话)回收、分离并任选纯化表达的蛋白质。例如，在细胞裂解后分离可溶形式的蛋白质，或采用已知技术提取入例如氯化胍中。如有需要，产生本发明的多肽作为融合蛋白。这类融合蛋白为上文描述的融合蛋白。或者，例如，可能需要产生融合蛋白以提高蛋白质在选定宿主细胞中的表达或改进纯化。包含本发明的多肽的分子可采用各种常规方法的任一种进一步纯化，包括但不限于：例如正向或反相液相层析法，采用HPLC、FPLC等；亲和层析法(例如含无机配体或单克隆抗体)；大小排阻层析法；固定化金属螯合层析法；凝胶电泳等。本领域的技术人员可在不偏离本发明范围的情况下选择最合适的分离和纯化技术。这类纯化提供呈基本上不含微生物的其它蛋白质性和非蛋白质性物质形式的抗原。 

合适的宿主细胞为例如来源于多细胞生物的真核细胞或细胞系(例如上述定义，例如CHO细胞或BHK细胞)、真核单细胞生物例如酵母(例如粟酒裂殖酵母(s. pombe)或酿酒酵母(s. cerevisiae))或原核细胞例如大肠杆菌。各种合适的宿主细胞是本领域已知的。 

本发明不同方面的一个实施方案涉及产生肽或肽复合物的重组细胞，其中肽或肽复合物由所述细胞/宿主细胞异源表达。肽或蛋白质(在此为肽或肽复合物)的异源表达意指重组细胞来源于天然不表达肽或蛋白质或肽复合物而经过修饰(例如经转染或转化)以表达肽或蛋白质的细胞；例如携带允许由所述细胞表达所述肽或肽复合物(例如抗体或其片段)的核酸(例如携带编码肽或肽复合物的插入序列的人工核酸构建体(载体))。重组细胞可来源于上述定义的任何细胞、细胞系或宿主细胞，包括真核以及原核细胞。 

因此，本发明第六方面涉及异源表达一种本发明核酸的细胞。 

第七方面，本发明涉及用于产生本发明的肽或肽复合物的方法，所述方法包括将本发明的细胞在允许肽或肽复合物表达的条件下培养，任选从宿主细胞中回收肽或肽复合物。 

本发明的第八方面涉及用作药物的组合物，所述组合物包含至少一种肽或肽复合物或含有本发明的肽或肽复合物的缀合物和/或至少一种本发明的核酸。 

本发明的(药物)组合物还可包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。可用于本发明的药学上可接受的载体和/或赋形剂是常规的，可包括缓冲剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂和增溶剂。Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 第15版(1975)，描述了适于本文公开的多肽/核酸的药物递送的组合物和制剂。药物组合物中活性成分(多肽或核酸)的含量不受限制，只要可用于治疗或预防，但优选含有0.0000001-10%重量/总组合物。 

一般而言，载体或赋形剂的性质将取决于待采用的特定给药方式。例如，胃肠外制剂通常包含注射用流体，其包括药学上和生理上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为溶媒。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学上的中性载体以外，待给予的药物组合物可含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或单月桂山梨坦。 

适量的药学上可接受的盐一般用于载体以使制剂等渗。载体的实例包括但不限于盐水、林格氏液和葡萄糖溶液。优选可接受的赋形剂、载体或稳定剂优选在所用剂量和浓度下是无毒的，包括缓冲剂例如柠檬酸、磷酸和其它有机酸；成盐反荷离子，例如钠和钾；低分子量(> 10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白或明胶；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如组氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬酰胺、精氨酸或甘氨酸；碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖或糊精；单糖；二糖；其它糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；螯合剂，例如EDTA；非离子型表面活性剂，例如Tween、Pluronics或聚乙二醇；抗氧化剂包括甲硫氨酸、抗坏血酸和生育酚；和/或防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚。 

药物组合物包括至少一种本发明的肽、肽复合物或核酸；然而，它还可含有混合物(cocktail) (即简单混合物)，其含有一种或多种不同的本发明的肽和/或肽复合物和/或核酸。可以药学上可接受的盐的形式使用一种或多种本发明的肽或肽复合物。能够与本发明的肽形成盐的合适的酸和碱为本领域技术人员所熟知，包括无机和有机酸和碱。 

优选药物组合物可用于治疗或预防α2整联蛋白相关疾病或病症。在本发明的情况下，2整联蛋白相关疾病或病症可理解为涉及一种或多种α2整联蛋白功能或活性、由一种或多种α2整联蛋白功能或活性引起、造成或影响的任何不需要的状况。实例包括涉及α2整联蛋白介导性异常细胞反应的信号转导途径或过程，例如胶原介导的细胞增殖或细胞因子分泌增加或异常、导致例如新血管生成、炎性病况或伤口愈合病症。具体实例包括(但不限于)：血栓形成、血管病、癌症包括新血管生成和转移、胰腺癌、结肠癌、例如结肠癌扩散到其它器官(例如肺和肝)的转移和黑素瘤、炎症、炎性疾病、自身免疫病和其特征在于血管生成异常或增加的疾病、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、移植反应、视神经炎、脊髓创伤、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化、雷诺综合征、斯耶格伦综合征、硬皮病、心血管病、银屑病、动脉粥样硬化和诱导炎性反应的感染。 

在本发明的一个实施方案中，药物组合物可用于治疗或预防血管病和/或血栓形成，特别用于治疗某些临床适应证，例如急性冠状动脉综合征、经皮冠状动脉介入、缺血性中风、颈动脉狭窄或外周动脉闭塞性疾病。 

在本发明的情况下，治疗或预防可影响需要治疗的任何动物(非人或人，尤其哺乳动物例如人，农场动物或宠物动物) (即以减轻或消除发病状态或病症，或者防止或延迟仍未显示发病状态或病症的个体的发病状态或病症发作)。 

α2β1整联蛋白在治疗或预防血栓形成中是引人关注的靶标。用α2β1敲除小鼠的体内研究表明在动脉血栓形成模型中血栓形成减少，至闭塞的时间增加以及尾出血时间延长。在α2整联蛋白缺乏和多态性相关临床研究中，患者显示轻度到重度出血病症和血小板的胶原反应缺陷。多态性导致α2β1表达增加，引起年龄<62岁的个体中非致死性心肌梗死的独立风险因子、年龄<50岁的患者中的中风风险增加和II型糖尿病人中发生糖尿病视网膜病的风险增加。此外，血小板和α2整联蛋白参与血管生成、肿瘤进程/转移。因此，癌症是又一个引人关注的治疗领域。已表明α2整联蛋白的抑制在体外拮抗间质肿瘤侵袭，且整联蛋白-ECM/α2整联蛋白介导的I型胶原粘附在体外特别参与促进胰腺癌恶性表型。在抑制多能人结肠直肠癌细胞分化和阻抑人鳞状细胞癌异种移植物生长和血管生成的大鼠模型中，抗α2拮抗性mAb在体内防止手术诱导的肝转移增加。 

对于结肠直肠癌，已表明摘除原发性结肠直肠癌反常地增加转移发生的风险，因为积累的证据表明手术创伤可刺激肿瘤生长。手术期间操作原发性肿瘤导致肿瘤细胞脱落，这就克服了复杂细胞变化的需要。另外，手术性创伤引起内皮下ECM暴露，从而有利于通过正常表达的整联蛋白的结合、促进肿瘤细胞粘附。在动物模型中，在腹部手术后，阻断肿瘤细胞上的α2整联蛋白完全消除手术诱导的粘附，并且完全恢复肝转移向外生长的增加。 

对于胰腺癌，现有疗法常常是不足够的，因为它仅延长生命4个月。整联蛋白-ECM和α2β1-整联蛋白介导的I型胶原粘附在体外特别参与促进胰腺癌的恶性表型。在动物模型中使用α2β1整联蛋白功能抑制剂例如mAb的研究得到证实，并且在胰腺癌治疗中针对治疗功效进行了评价。 

根据这些研究结果，功能性阻断α2和/或a2β1整联蛋白可提供令人关注的治疗机会，特别是用于结肠直肠癌和胰腺癌。 

本发明的第九方面涉及诊断与α2整联蛋白表达改变有关的疾病的方法，所述方法包括 

a) 使来自受试者的包含α2整联蛋白的样品与本发明的肽或肽复合物接触；

b) 检测α2整联蛋白与肽或肽复合物的结合；和

c) 将步骤b)的结合与参比进行比较，

其中相对于参比，样品中α2整联蛋白结合发生改变表明有所述疾病。结合改变可通过例如与参比样品比较时的信号改变(即信号增加或减弱)来鉴定，按步骤b测定。

本发明的肽(复合物)还可用于诊断测定。上文详述的α2整联蛋白和/或其突变表达的改变可与特定疾病有关。因此，可使用肽(复合物)确定与α2整联蛋白的结合。如果结合(定量或定性)相对于对照或参比发生改变，则可表明有所述疾病。 

因此，本发明的另一方面涉及诊断与α2整联蛋白改变有关的疾病的方法，所述方法包括 

a) 使所取个体的样品与本发明的肽或肽复合物接触；和

b) 检测α2整联蛋白与肽或肽复合物的结合；和

c) 将步骤b)的结合与α2整联蛋白与一个或多个参比样品中的肽或肽复合物的结合进行比较，

其中相对于一个或多个参比样品中检测到的结合，所取样品中的结合改变表明有所述疾病。

总的来讲，可使获自受试者的试验样品与特异性结合α2整联蛋白的本发明的肽(复合物)接触。任选，可将肽(复合物)固定在固体支持体上，然后使抗体与试验样品接触以利于复合物的洗涤和随后的分离。固体支持体的实例包括呈例如微量滴定板、玻璃显微镜载片或盖玻片、棒状物(stick)、珠粒或微珠粒形式的玻璃或塑料。 

在将样品与抗体一起孵育后，洗涤混合物，并且可检测所形成的肽(复合物)/α2整联蛋白/复合物。这可通过将经洗涤的混合物与检测试剂一起孵育来实现。这种检测试剂可为通过使用检测标记。各种标记和检测方法为技术人员所知。就检测标记而言，可使用本领域已知的任何检测标记。例如，检测标记可以是放射性标记(例如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、³²P和³³P)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶等)、化学发光标记(例如吖啶 酯、吖啶硫酯、吖啶磺酰胺、菲啶酯、鲁米那(luminal)、异鲁米诺(isoluminol)等)、荧光标记(例如荧光素(例如5-荧光素、6-羧基荧光素、3′6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯-荧光素、6-四氯荧光素、荧光素异硫氰酸酯等))、罗丹明、藻胆蛋白、R-藻红蛋白、量子点(quantum dot) (例如硫化锌封端的硒化镉(zinc sulfide-capped cadmium selenide))、测温标记(thermometric label)、标签(如上定义)或免疫-聚合酶链反应标记。 

在整个测定中，在各试剂每次混合后，可能需要孵育和/或洗涤步骤。孵育步骤可从约5秒钟到几小时，优选从约5分钟到约24小时变化。然而，孵育时间将取决于测定方式、生物标记(抗原)、溶液体积、浓度等。通常可在环境温度下进行测定，但是可在各种温度下进行，例如10℃-40℃。 

为方便起见，肽(复合物)可以试剂盒提供，例如使用说明与预定量的试剂的包装组合，包括用于进行诊断测定。如果肽(复合物)用酶标记，则试剂盒可包括酶所需的底物和辅因子(例如提供可检测生色团或荧光团的底物前体)。试剂盒中可包括其它添加剂，例如稳定剂、缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。试剂盒中提供的各种试剂的相对量可大幅变化，以提供例如基本上使测定灵敏度最优化的试剂的溶液中的浓度。试剂可以干粉(通常是冻干的)提供，包括赋形剂，例如在溶解时可提供具有适当浓度的试剂溶液。 

参比可以是来自健康受试者的样品，或者对一组健康受试者测定的：或者，它可以是已知的参考值。本领域技术人员了解评价两个值是否彼此具有显著性差异的统计程序，例如学生t检验或χ2检验。此外，技术人员了解如何选择合适的对照。 

术语“来自受试者的样品”和“试验样品”涉及所有生物流体、分泌物和自任何指定受试者(特别人)分离的组织。在本发明的情况下，这类样品包括但不限于血液、血清、血浆、乳头抽吸物、尿液、精液(semen/seminal fluid)、精浆、前列腺液、排泄物、泪液、唾液、汗液、活检样品、腹水、脑脊液、乳汁、淋巴液、支气管和其它灌洗样品或组织提取样品。血液样品通常是用于本发明情况的优选的试验样品。 

第十方面，本发明涉及包含以下的制品 

a) 包装材料(例如用于肽或肽复合物一个或多个容器和瓶签或包装说明书)

b) 本发明的肽或肽复合物或其药学上可接受的盐，

c) 标签物(例如含书面信息和/或条码和/或任何其它种类的信息)或包装说明书(即任何种类的数据载体，例如芯片、传单、小册子等)，装在所述包装材料内的包装说明书标明所述肽或肽复合物有效用于治疗例如本文定义的疾病或病症，特别是α2整联蛋白相关疾病/病症。

第十一方面，本发明涉及用于诊断α2整联蛋白相关病症或疾病的诊断试剂盒，其包含本发明的肽或肽复合物和合适的包装，及可能地合适的使用说明，其用于在检测α2整联蛋白时使用所述肽或肽复合物。 

本发明第九方面的诊断试剂盒是优选与空间上组装的单元组合并预期用于α2整联蛋白相关病症或疾病诊断的制品，所述制品包括至少第九方面定义的组分和任选一种或多种其它组分(例如缓冲液和进行样品中α2整联蛋白检测所必需的或适宜的其它试剂，或者用于检测α2整联蛋白或指定疾病的其它标志物或阴性/阳性标准品的其它装置(means)、用于检测和/或显现和/或定量测定α2整联蛋白-(肽/肽复合物)复合物的一种或多种第二抗体(合适标记的)，其适宜地装在一个或多个合适的容器内)。 

按照第九方面的一个实施方案，试剂盒还装有数据载体，其包括本发明第七方面或第十一方面及其实施方案任一个的方法的使用说明。 

第十二方面，本发明涉及使用一种或多种本发明的肽或肽复合物和/或一种或多种核酸治疗或诊断α2整联蛋白相关病症或疾病的方法。 

因此，本发明的方面涉及诊断与α2整联蛋白改变有关的疾病的方法，所述方法包括 

a) 使所取个体的样品与本发明的肽或肽复合物接触；和

b) 检测和/或定量测定α2整联蛋白与肽或肽复合物的结合；和

c) 将步骤b)的结合与α2整联蛋白与一个或多个参比样品中的肽或肽复合物的结合进行比较，

其中相对于一个或多个参比样品中检测到的结合，所取样品中的结合改变表明有所述疾病。可采用已知方法或仅仅借助例如通过在与参比样品比较时标记的抗肽/肽复合物的抗体引起的肽/肽-复合物-α2整联蛋白复合物的信号(强度)，来检测或定量测定用亲和力(例如KD、Koff、Kon速率)表示的结合。

在本发明的情况下，术语“参比/参考”，尤其在“参比个体”、“参比样品”或“参考值”的情况下，是指某些(健康)状态、疾病等特有的或代表性的比较或标准。因此，参考值某些参数(例如某些指示物/生物标记分子的表达水平)的标准值，其对于某些状态(例如疾病状态或健康状态)是典型的，参比个体是被选择用于比较且具有某些健康状态或疾病的个体，参比样品可为例如来自参比个体的样品或具有某些指示物或生物标记的特有水平的人工样品，所述水平对于疾病状态或健康状态是典型的。 

本文所用术语“参比样品”是指按与目标样品基本相同的方式进行分析且将其信息与目标样品信息进行比较的样品。参比样品因此提供允许评价获自目标样品的信息的标准。 

参比样品可来源于健康的或正常的组织、器官或个体，从而提供组织、器官或个体的健康状态的标准。正常参比样品的状态和目标样品的状态之间的差异可表示疾病发生的风险或这类疾病或病症的存在或进一步发展。 

参比样品可来源于异常的或患病的组织、器官或个体，从而提供组织、器官或个体的患病状态的标准。异常参比样品的状态和目标样品的状态之间的差异可表示疾病发生的风险降低或这类疾病或病症不存在或好转。 

参比样品还可来源于与目标样品相同的组织、器官或个体，但在较早时间点获取。较早获取的参比样品的状态和目标样品的状态之间的差异可表示疾病的进展，即疾病随时间推移而好转或恶化。在参比样品获取和目标样品获取之间已过去一段时间的情况下，参比样品取自较早或较晚的时间点。这样的一段时间可为数年(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100年)、数月(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月)、数周(例如1、2、3、4、5、6、7、8周)、数天(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500天)、数小时(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时)、数分钟(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60分钟)或数秒钟(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60秒钟)。 

疼痛状态或分期的代表性参比样品可来自已知患有待诊断的病症或疾病(即例如本文定义的α-2整联蛋白相关病症或疾病)的对照受试者。对照受试者可以是哺乳动物例如人、啮齿动物(例如大鼠、仓鼠或小鼠)或猴，或者可以是哺乳动物以外的另一种动物例如鸟类。 

优选样品或值和参比样品或参考值两者来自相同物种(例如人)、更优选为同一性别(例如女性或男性)和/或相似年龄或生命阶段(例如婴儿、幼儿、少年、成人或老年人)的受试者。 

本发明不同方面和实施方案的参比或参比样品优选来源于健康个体、患病个体，或来源于与目标样品相同的个体。如果参比(例如参考值)或参比样品取自与目标样品相同的个体，则参比(例如参考值)或参比样品优选取自比目标样品较早或随后较晚的时间点。参比(例如参考值)或参比样品获取与参比(例如参考值)或目标样品或目标值获取之间已过去的时间段优选为数年(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100年)、数月(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月)、数周(例如1、2、3、4、5、6、7、8周)、数天(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500天)、数小时(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时)、数分钟(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60分钟)或数秒钟(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60秒钟)。备选或另外地，参比样品是具有健康个体代表性α2整联蛋白水平或者存在或不存在α2整联蛋白相关病症或疾病时的代表性α2整联蛋白水平或者发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险增加或降低的代表性α2整联蛋白水平的参比样品。 

在实施方案中，其中参比或参比样品来源于健康个体或发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险降低的个体或具有不存在α2整联蛋白相关病症或疾病时的代表性α2整联蛋白水平的个体，则与所述参考值或参比样品比较时，参比样品或参考值中或者目标样品或目标值中α2整联蛋白的水平升高表明个体中(a)存在α2整联蛋白相关病症或疾病，和/或(b)发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险增加，和/或(c) α2整联蛋白相关病症或疾病有进展。在实施方案中，其中参比来源于患病个体或发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险增加的个体或者具有存在α2整联蛋白相关病症或疾病时的代表性值的个体，则α2整联蛋白的相似水平表明个体中(a)存在α2整联蛋白相关病症或疾病，和/或(b)发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险增加，和/或(c) α2整联蛋白相关病症或疾病有进展。 

在实施方案中，其中参比(值)或参比样品是(来自)与较早时间点的目标个体相同的个体，则目标个体/值/样品中α2整联蛋白的水平升高表明个体中(a)存在α2整联蛋白相关病症或疾病，和/或(b)发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险增加，和/或(c) α2整联蛋白相关病症或疾病有进展。在实施方案中，其中参比(值)或参比样品是(来自)与较早时间点的目标个体相同的个体，则目标样品中α2整联蛋白水平降低表明(a) α2整联蛋白相关病症或疾病发生改变或者α2整联蛋白相关病症或疾病得到改善或不存在，和/或(b)发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险降低，和/或(c) α2整联蛋白相关病症或疾病的进展减慢。 

在实施方案中，其中参比(值)或参比样品是(来自)与较早时间点的目标样品/值相同的个体，则目标样品中α2整联蛋白的相似水平表明个体中(a)发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险相似，和/或(b) α2整联蛋白相关病症或疾病的进展停滞，和/或(c) α2整联蛋白相关病症或疾病持续。 

在实施方案中，其中参比(值)或参比样品来源于健康个体，或来源于发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险降低的个体，或包含健康个体或疾病不存在状态或发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险降低的代表性α2整联蛋白水平的个体，则其中α2整联蛋白的水平升高表明个体中(a)存在α2整联蛋白相关病症或疾病，和/或(b)发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险增加，和/或(c) α2整联蛋白相关病症或疾病有进展。 

在实施方案中，其中参比(值)或参比样品来源于患病个体，或来源于发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险增加的个体，或包含患病个体或疾病存在状态或发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险增加的代表性α2整联蛋白的水平或量的个体，则其中α2整联蛋白的相似水平表明个体中(a)存在α2整联蛋白相关病症或疾病，和/或(b)发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险增加，和/或(c) α2整联蛋白相关病症或疾病有进展。 

在实施方案中，其中参比(值)或样品来源于与目标样品相同的个体，并取自较早时间点，则目标样品中α2整联蛋白的水平升高表明个体中(a)存在α2整联蛋白相关病症或疾病，和/或(b)发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险增加，和/或(c) α2整联蛋白相关病症或疾病有进展。 

在实施方案中，其中参比(值)或参比样品来源于与目标样品相同的个体并取自较早时间点，则目标样品中α2整联蛋白水平降低表明(a) α2整联蛋白相关病症或疾病发生改变，或α2整联蛋白相关病症或疾病改善或不存在，和/或(b)发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险降低，和/或(c) α2整联蛋白相关病症或疾病的进展减慢。在实施方案中，其中参比样品来源于与目标样品相同的个体并取自较早时间点，则目标样品中α2整联蛋白的相似水平表明个体中(a)发生α2整联蛋白相关病症或疾病的风险相似，和/或(b) α2整联蛋白相关病症或疾病的进展停滞，和/或(c) α2整联蛋白相关病症或疾病持续。 

按照本发明不同方面的优选实施方案，肽或肽复合物包含(是)分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，或者由分离的单克隆抗体或其抗原结合片段组成。下面列举了与分离的单克隆抗体或其抗原结合片段相关的一些优选实施方案： 

1. 分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段与人α2整联蛋白的I结构域特异性结合，所述抗体或片段包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述抗体或片段与非人灵长类动物α2整联蛋白交叉反应，但不与非灵长类动物α2整联蛋白交叉反应。

2. 分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段与人α2整联蛋白的I结构域特异性结合，所述抗体包含重链可变区(VH)结构域和轻链可变区(VL)结构域，其中所述抗体或片段与参比抗体竞争结合参比抗体的表位，所述参比抗体包含由以登记号DSM 23944保藏于DSMZ的质粒编码的轻链和由(i)以登记号DSM 23946保藏于DSMZ的质粒或(ii)以登记号DSM 23945保藏于DSMZ的质粒编码的重链。 

3. 实施方案1或2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或片段以nM结合亲和力与人α2整联蛋白的I结构域特异性结合。 

4. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或片段体外抑制人α2整联蛋白与胶原的相互作用，从而抑制血小板活化，其因所述血小板与所述胶原粘附而引起。 

5. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区结构域包含SEQ ID NO:5的重链HCDR3。 

6. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区结构域包含SEQ ID NO:3 (HCDR1)、SEQ ID NO:4 (HCDR2)和SEQ ID NO:5 (HCDR3)的重链CDR或其功能活性变体。 

7. 实施方案6的抗体或其抗原结合部分，其中HCDR2的功能活性变体包含氨基酸6位处的突变Asp→Glu。 

8. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，所述轻链可变区结构域包含SEQ ID NO:8的轻链LCDR3。 

9. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，所述轻链可变区结构域包含SEQ ID NO:6 (LCDR1)、SEQ ID NO:7 (LCDR2)和SEQ ID NO:8 (LCDR3)的轻链CDR或其功能活性变体。 

10. 实施方案9的抗体或其抗原结合部分，其中LCDR1的功能活性变体包含氨基酸11位处的突变Asn→Gln。 

11. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区(VH)结构域与SEQ ID NO: 2的VH序列有至少90%、95%、97%或99%序列同一性。 

12. 实施方案11的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区(VH)结构域包含SEQ ID NO:2的序列或其功能活性变体。 

13. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，所述轻链可变区(VL)结构域与SEQ ID NO: 1的VL序列具有至少90%、95%、97%或99%序列同一性。 

14. 实施方案13的抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链可变区(VL)结构域包含SEQ ID NO:1的序列或其功能活性变体。 

15. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链可变区(VH)结构域包含在选自以下位置处的一个或多个氨基酸取代：H5、H7、H11、H12、H17、H20、H38、H40、H43、H55、H61、H65、H66、H67、H76、H81、H82、H87、H91、H93、H112、H113和H116。 

16. 实施方案15的抗体或其抗原结合部分，其中一个或多个氨基酸取代选自5His→Val、7Pro→Ser、11Leu→Val、12Val→Lys、17Pro→Ser、20Leu→Val、38Lys→Arg、40Arg→Ala、43Arg→Gln、55Asp→Glu、61Asn→Ala、65Lys→Gln、66Asp→Gly、67Lys→Arg、76Ser→Thr、81Ile→Met、82Gln→Glu、87Thr→Arg、91Ser→Thr、93Val→Lys、112Thr→Leu、113Leu→Val和116Ser→Val。 

17. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链可变区(VL)结构域包含在选自以下位置处的一个或多个氨基酸取代：L9、L12、L15、L22、L34、L46、L47、L80、L83、L85、L87和L89。 

18. 实施方案17的抗体或其抗原结合部分，其中一个或多个氨基酸取代选自9Ala→Ser、12Ala→Ser、15Leu→Val、15Leu→Pro、22Ser→Thr、34Asn→Gln、46Gln→Lys、47Ala→Pro、80Asp→Asn、83Glu→Gln、85Asp→Glu、87Ala→Thr和89Thr→Asn。 

19. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区(VH)结构域与选自以下的VH序列具有至少90%、95%、97%或99%序列同一性：SEQ ID NO: 38 (HC1)、SEQ ID NO:39 (HC2)、SEQ ID NO:40 (HC3)、SEQ ID NO:41 (HC4)、SEQ ID NO:42 (HC5)、SEQ ID NO:43 (HC6)和SEQ ID NO:44 (HC7)。 

20. 实施方案19的抗体或其抗原结合部分，所述重链可变区(VH)结构域包含选自以下的VH序列：SEQ ID NO: 38 (HC1)、SEQ ID NO:39 (HC2)、SEQ ID NO:40 (HC3)、SEQ ID NO:41 (HC4)、SEQ ID NO:42 (HC5)、SEQ ID NO:43 (HC6)和SEQ ID NO:44 (HC7)。 

21. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，所述轻链可变区(VL)结构域与选自以下的VL序列具有至少90%、95%、97%或99%序列同一性：SEQ ID NO: 33 (LC1)、SEQ ID NO:34 (LC2)、SEQ ID NO:35 (LC3)、SEQ ID NO:36 (LC4)和SEQ ID NO:37 (LC5)。 

22. 实施方案21的抗体或其抗原结合部分，所述轻链可变区(VL)结构域包含选自以下的VL序列：SEQ ID NO: 33 (LC1)、SEQ ID NO:34 (LC2)、SEQ ID NO:35 (LC3)、SEQ ID NO:36 (LC4)和SEQ ID NO:37 (LC5)。 

23. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或结合部分是嵌合抗体或人源化抗体。 

24. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗原结合部分选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv和(scFv)₂。 

25. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，其选自多特异性抗体、双重特异性抗体、同种型抗体、双重可变结构域抗体和双特异性抗体。 

26. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，其包含选自以下的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、结构域、人IgG4恒定结构域、人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。 

27. 前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分，其包含人IgG4恒定结构域。 

28. 一种分离的核酸，其编码前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合部分的氨基酸序列。 

29. 一种重组表达载体，其包含实施方案28的核酸。 

30. 一种宿主细胞，其包含实施方案29的重组表达载体。 

31. 一种产生实施方案1-26中任一个的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括将实施方案30的宿主细胞培养在使得宿主细胞产生抗体的条件下。 

32. 一种药物组合物，其包含实施方案1-27中任一个的抗体或其抗原结合部分和一种或多种药学上可接受的载体。 

33. 一种治疗、预防或诊断α2整联蛋白相关病症或疾病的方法，所述方法包括给予有需要的受试者实施方案32的药物组合物。 

34. 实施方案33的方法，其中所述α2整联蛋白相关疾病或病症选自血栓形成、血管病、癌症包括新血管生成和转移、炎症、炎性疾病、自身免疫病和其特征在于血管生成异常或增加的疾病、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、移植反应、视神经炎、脊髓创伤、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化、雷诺综合征、实验性自身免疫性脑脊髓炎、斯耶格伦综合征、硬皮病、心血管病、银屑病和诱导炎性反应的感染。 

35. 实施方案33的方法，其中所述α2整联蛋白相关疾病或病症选自急性冠状动脉综合征、经皮冠状动脉介入、缺血性中风、颈动脉狭窄或外周动脉闭塞性疾病。 

36. 一种诊断与α2整联蛋白改变有关的疾病的方法，所述方法包括 

a) 使含有α2整联蛋白的样品与实施方案1-27中任一个的抗体或抗原结合片段接触；

b) 检测α2整联蛋白与抗体或抗原结合片段的结合；和

c) 将步骤b)的结合与参比进行比较，其中相对于参比，样品中的α2整联蛋白结合改变表明有所述疾病。

37. 一种制品，其包括 

a) 包装材料，

b) 实施方案1-27中任一个的抗体或抗原结合片段，

c) 标签物或包装说明书，包装说明书装入所述包装材料内，标明所述抗体或抗原结合片段有效用于治疗或诊断α2整联蛋白相关疾病/病症。

本发明不限于本文描述的具体方法、方案和试剂，因为它们可以改变。此外，本文所用术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不意味着限制本发明的范围。本文和随附权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。同样地，措词“包含”、“含有”和“包括”应解释为包括在内的而非排它性的。 

除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语和任何首字母缩略词具有本发明领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文描述的类似或等同的任何方法和材料可用来实施本发明，但是优选本文描述的方法和材料。 

通过下列实施例对本发明作进一步说明，但要理解包括实施例仅仅是为了说明目的，并不意味着限制本发明的范围，除非另有明确说明。 

附图：

图1A和B显示根据HUVEC MesoScale技术自杂交瘤上清液纯化的抗α2整联蛋白mAB的结合。

图2显示自杂交瘤上清液纯化的抗α2整联蛋白mAb对HUVEC血管生成的作用。抗α2整联蛋白mAb能够以剂量依赖性方式抑制FGF2诱导的血管生成。 

图3显示抗α2整联蛋白mAB-Fab对流动中的血小板与胶原的粘附的抑制。将抗凝人血与DiOC6(3)染料和连续稀释的抗α2整联蛋白Fab在37℃下孵育10分钟。然后使血液以3000s-1的剪切速率通过胶原涂覆的毛细管流动。从作为覆盖表面的代表性实例的10张照片，计算表面覆盖度。数值表示作为抗α2整联蛋白Fab的剂量依赖性作用的所述表面覆盖度的抑制百分比。 

图4：显示通过使用来自杂交瘤上清液和猕猴(图4a和b)和人(图4c和d)血样的α2 mAb的FACS分析进行的种间交叉反应性研究，图4a和4c表示只使用第二抗体而不使用第一抗体的阴性对照。 

图5：图5a)显示通过杂交瘤产生的抗α2整联蛋白单克隆小鼠抗体可变轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)和编码序列(SEQ ID NO:12)。图5b)表示抗α2整联蛋白单克隆小鼠抗体可变重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)和编码序列(SEQ ID NO:13)。在氨基酸序列中，CDR用粗体字和下划线标示。 

图6：显示抗α2整联蛋白单克隆小鼠抗体的不同CDR的氨基酸序列，其中图6a表示重链CDR而图6b表示轻链CDR，且HCDR1为SEQ ID NO:3、HCDR2为SEQ ID NO:4、HCDR3为SEQ ID NO:5的、LCDR1为SEQ ID NO:6、LCDR2为SEQ ID NO:7、LCDR3为SEQ ID NO:8。 

图7显示按实施例中的详述通过使上述鼠可变轻链区(SEQ ID NO: 1)或可变重链区(SEQ ID NO: 2)与人恒定区(的部分)偶联所产生的嵌合构建体的序列。图7a表示嵌合轻链的氨基酸(SEQ ID NO :9)和编码(SEQ ID NO: 14)序列，图7b表示嵌合重链的氨基酸(SEQ ID NO: 10)和编码(SEQ ID NO: 15)序列，图7c表示嵌合重链Fab片段的氨基酸(SEQ ID NO: 11)和编码(SEQ ID NO: 16)序列。在氨基酸序列中，CDR用下划线表示，代表α2可变结构域的序列以粗体输入，His标签用斜体字书写。

图8显示用于产生嵌合构建体的不同人恒定区的氨基酸序列：SEQ ID NO:17是人IGKC蛋白的氨基酸序列，根据Swiss-Prot登记号Q502W4的轻链恒定区，用于产生SEQ ID NO:9的轻链嵌合体；SEQ ID NO:18是人突变IGHG4的氨基酸序列，根据Swiss-prot登记号P01861.1的重链恒定区，用于构建SEQ ID NO:10的重链嵌合体(突变的氨基酸用粗体字输入)，SEQ ID NO:19是人IGHG1蛋白的氨基酸序列，根据Swiss-Prot登记号Q569F4的重链恒定区，用于产生SEQ ID NO:11的重链Fab片段嵌合体。 

图9显示人α2和β1整联蛋白的氨基酸和编码序列，且SEQ ID NO: 20为根据NP__002194.2的α2整联蛋白前体蛋白质的氨基酸序列。用于实验和在大肠杆菌中重组表达的I结构域用下划线和粗体字输入。SEQ ID NO: 21是根据NCBI登记号NM_002203.3的α2整联蛋白的编码序列，SEQ ID NO: 22是根据NCBI登记号NP_002202.2的β1整联蛋白同种型1A前体蛋白质的氨基酸序列，SEQ ID NO:23是根据NCBI登记号NM_002211.3的β1整联蛋白同种型1A的编码序列。 

图10显示来自小鼠杂交瘤的原始鼠抗α2整联蛋白抗体并通过MS证实的氨基酸和编码序列：SEQ ID NO: 45 (图10a)是编码抗α2整联蛋白mA B的LC的cDNA的核苷酸序列，SEQ ID NO: 46 (图10b)是编码HC抗α2整联蛋白mAB的cDNA的核苷酸序列，SEQ ID NO: 47 (图10c)是自杂交瘤分泌的抗α2整联蛋白mAB的LC的氨基酸序列，SEQ ID NO:48 (图10d)是自杂交瘤分泌的抗α2整联蛋白mAB的LC的氨基酸序列。SEQ ID NO: 53 (图10e)是比较物mAb TMC2206的LC的氨基酸序列，SEQ ID NO: 54 (图10f)是比较物mAb TMC2206的HC的氨基酸序列。 

图11显示通过Biacore测定的不同α2整联蛋白抗体的解离常数。结果显示在许多情况下好于或至少等于mAb TMC2206的解离常数。 

图12显示使用Biacore测定的比较物mAb TMC2206与被非人源化Fab预先结合的整联蛋白α₂ I结构域的结合(时间为(s)秒钟(x轴)与响应差异为(RU)响应单位) (y轴))。可由图12获知，TMC2206与被非人源化Fab预先结合的整联蛋白I结构域结合。 

图13显示非人源化Fab与被比较物mAb TMC2206预先结合的整联蛋白α₂ I结构域的结合(时间为(s)秒钟) (x轴)与响应差异为(RU)响应单位(y轴))。可由图13获知，非人源化Fab与被比较物mAb TMC2206预先结合的整联蛋白α₂ I结构域结合。 

图14显示使用经洗涤的血小板在静态条件下血小板与胶原粘附的抑制。批次660对应于LC1/HC1，批次661对应于LC2/HC2，批次662对应于LC3/HC3，批次663对应于LC3/HC4，批次664对应于LC4/HC5，批次665对应于LC4/HC6，批次666对应于LC5/HC7，而批次667是比较物。结果还可得自表12。批号660、662和663显示血小板与胶原的粘附的抑制与mAb TMC2206至少相等或更好。 

实施例

实施例1：功能性抗α2整联蛋白mAb和Fab的产生和选择 

A – 自α2整联蛋白mAB克隆细胞分离序列

自杂交瘤产生和纯化α2整联蛋白mAb

使一个装有2x10⁶个α2整联蛋白mAB细胞库的细胞的冷冻小瓶在37℃下快速融化。将细胞转移到T-25 cm2培养瓶的5 mL新鲜培养基中，在5% CO₂的空气中于潮湿环境下在37℃培养箱中，在定轨式摇床平台中以110 rpm旋转，培养基由补充10% FBS、1X ITS (Gibco 41 400-045)、1 X丙酮酸钠(Gibco 11 360-039)、150 μg/mL草酰乙酸、2 mM谷氨酰胺(Gibco 25030-024)和100 U/ml青霉素/链霉素(Gibco 15070-063)的Dulbecco改良Eagle培养基(Gibco 31053-028)组成。

从杂交瘤中纯化的mAb的同种型分型(Isotyping)通过使用通过使用得自Serotec的标准市售同种型分型试剂盒(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Test Kit (小鼠单克隆抗体同种型分型试验试剂盒)；ref. MMT1)进行，显示为mCk、mIgG2a同种型。 

每2-3天使细胞继代培养用于细胞扩增。对于生产，将细胞以1.8 x 10⁵ C/mL接种于6个T500培养瓶(200 mL)中的Iscove改良Dulbecco培养基(Sigma I3390)中达10天，培养基补充了10% FBS、1 X ITS、1 X丙酮酸钠、150 μg/mL草酰乙酸、2 mM谷氨酰胺和100 U/ml青霉素/链霉素。 

对于纯化，直接从G蛋白亲和层析法(Hitrap Protein G，GE Healthcare)中的上清液俘获抗α2整联蛋白mAb，并用0.1 M乙酸洗脱。通过使用Superdex 200 (GE Healthcare)的SEC和超滤精制(polishing)蛋白质后，在指定实验中使用蛋白质。 

α2整联蛋白mAb重链和轻链序列的测定 

如下获得编码单克隆抗体可变结构域的cDNA：用得自Qiagen的Oligotex试剂盒从杂交瘤细胞中提取mRNA。通过使用Gene Racer试剂盒(Invitrogen)、转录酶SuperScript III于55℃ (Invitrogen)和表1所示引物(RACEMOG2a或CKFOR)的RACE方法，通过RT-PCR使相应的cDNA扩增。用聚合酶Phusion于55℃ (Finnzymes)和同样是表1所示引物，通过PCR扩增cDNA片段。

表1. 用于RT-PCR和PCR的引物 

将编码重(VH)和轻(VL)链可变区的扩增片段克隆至得自Invitrogen的pCR4-Topo质粒，将其在大肠杆菌中扩增。然后对两条链的克隆cDNA进行测序。

蛋白质序列由质粒编码序列翻译，并计算重(HC)和轻(LC)链的质量(表2)。所得值与获自从相应杂交瘤培养物中纯化的mAb制备物的质谱数据完全一致，参见表2。如下在序列表中报告了HC和LC的核酸和氨基酸序列：SEQ ID NO 46和48对应于自杂交瘤上清液纯化的α2整联蛋白mAb的HC，SEQ ID NO. 45和47对应于自杂交瘤上清液纯化的α2整联蛋白mAb的LC。 

表2：得自杂交瘤的α2整联蛋白mAb的质谱分析 

B - 抗α2整联蛋白mAb的CDR序列的测定

采用KABAT命名法从蛋白质序列推导出CDR区的序列。

对于HC，CDR1对应于SEQ ID NO.3，CDR2对应于SEQ ID NO.4，CDR3对应于SEQ ID NO.5。 

对于LC，CDR1对应于SEQ ID NO.6，CDR2对应于SEQ ID NO.7，CDR3对应于SEQ ID NO.8。 

C - 嵌合抗α2整联蛋白mAb表达质粒的产生 

使用AccuPrimePfx SuperMix (Invitrogen；目录号：12344-040)和抗α2整联蛋白mAb重链和轻链cDNA (对于cDNA产生见上文)，通过PCR分别产生抗α2整联蛋白的可变重链和轻链mAb。在25μl PCR反应中，用引物α2mAB-VH FOR和REV (重链)或引物α2mAB-VL FOR和REV (轻链)引物运行5个循环(95℃，15秒钟；62℃，30秒钟；68℃，1分钟)。为了引入前导序列，采用与第一PCR相同的PCR条件，使用0.5μl第一PCR样品的每一种作为第二PCR的模板，且用前导序列FOR1-54和α2mAB-VL (或-VH) REV引物。最后，采用与第一反应相同的PCR条件，使用0.5μl的第二PCR作为第三PCR的模板，用前导序列FOR1-23和α2整联蛋白mAB-VL (或引物进行25个循环。按试剂盒方案所述，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen，目录号28104)对第三PCR的PCR产物进行纯化。按厂家手册所述，使用Invitrogen TOPO TA克隆试剂盒(目录号450001)，将PCR产物克隆至pCR2.1-TOPO，并使用克隆试剂盒中所包括的M13正向和M13反向引物测序。

鼠α2抗体可变轻链和重链的序列可获自图5，其中SEQ ID NO:1 是指氨基酸序列，SEQ ID NO:12是指可变轻链结构域的编码序列，而SEQ ID NO:2是指氨基酸序列，SEQ ID NO:13是指可变重链结构域的编码序列。 

通过用NheI/BsiWI和IGKC BsiWI/HindIII消化VL，使可变轻链结构域(根据SEQ ID NO:1)与恒定轻链(IGKC，Swiss-Prot：Q502W4)融合，得到根据SEQ ID NO:9和14的α2抗体VL-IGKC轻链嵌合体。使该融合物连接至附加型表达载体pXL (Durocher等(2002), Nucl. Acids Res. 30(2)) E9的NheI/HindIII位点，产生嵌合α2抗体轻链的哺乳动物表达质粒“pFF0033_pXLc-AscII-IGKC”，以登记号DSM 23944保藏于DSMZ。 

使可变重链结构域(根据SEQ ID NO:2)与人恒定重链的突变变体(IGHG4、Swiss-Prot P01861、S108P、L115E)融合，得到根据SEQ ID NO: 10/15的α2整联蛋白VH-IGHG4恒定重链嵌合体，或者为了产生Fab，与得自人恒定IGHG1 (Swiss-Prot：Q569F4)的带6x His标签的CH1结构域融合，得到根据SEQ ID NO:11/16的α2整联蛋白VH-IGHG1恒定重链Fab嵌合体。为此，VH用NheI/ApaLI消化，并分别与ApaI/HindIII消化的IGHG4或带His标签的CH1结构域融合。将这种融合物连接至附加型表达载体pXL的NheI/HindIII位点，分别产生嵌合α2抗体重链-IgG4的哺乳动物表达质粒“pFF0036_pXLc-AscII-IGHG4”，以登记号DSM 23946保藏于DSMZ，或者嵌合α2抗体重链-Fab的哺乳动物表达质粒“pFF0035_pXLc-AscII-CH1-Hi”，以登记号DSM 23945保藏于DSMZ。 

不同的质粒按下列登记号保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ)，不伦瑞克市：DSM 23945 (用于嵌合抗α2抗体重链Fab片段的真核生物表达的质粒)，DSM 23946 (用于嵌合抗α2抗体IgG4重链表达的质粒)和DSM 23944 (用于嵌合抗α2抗体IGKC轻链表达的质粒)。DSM 23945，DSM 23946和DSM 23944的保藏日期均为2010年8月25日。 

上述所用引物的序列 

实施例2：抗α2整联蛋白mAb和Fab的性质

A - 重组抗α2整联蛋白mAB和Fab片段的产生

嵌合抗α2整联蛋白-IgG4和抗α2整联蛋白-Fab分子的表达

使编码抗体重链和轻链的表达质粒在大肠杆菌DH5a增殖。使用Qiagen EndoFree质粒大量制备试剂盒从大肠杆菌中制备用于转染的质粒。

使用Fugene (Roche)转染试剂，将生长在Freestyle培养基(Invitrogen)中的HEK 293-FS细胞用所示的LC和HC质粒转染。7天后，细胞通过离心除去，上清液经过0.22μm过滤器以除去颗粒。 

嵌合抗α2整联蛋白-IgG4和抗α2整联蛋白-Fab分子的纯化 

IgG4蛋白用A蛋白亲和层析法(HiTrap Protein A HP Columns，GE Life Sciences)纯化。在用含100 mM NaCl pH 3.5的100 mM乙酸盐缓冲液从柱上洗脱后，使用HiPrep 26/10脱盐柱使单克隆抗体脱盐，按1 mg/mL浓度在PBS中配制，并经0.22 μm过滤。

Fab蛋白通过HiTrap IMAC HP柱(GE Life Sciences)上的IMAC纯化。在用线性梯度(洗脱缓冲液：20 mM磷酸钠、0.5 M NaCl、50-500 mM咪唑，pH 7.4)从柱上洗脱后，合并含蛋白质的流分，用HiPrep 26/10脱盐柱脱盐，以1 mg/mL的浓度在PBS中配制，并经0.22 μm过滤。 

蛋白质浓度通过测量280 nm处的吸光度来测定。使用Protein 200 Plus LabChip试剂盒在Agilent 2100生物分析仪上在还原和非还原条件下对每批进行分析，以测定各亚基和单体的纯度和分子量。 

B - 抗α2整联蛋白mAb或Fab的结合性质 

将Biacore 3000 (GE Healthcare)的表面等离振子共振技术用于纯化的抗体和相应的Fab片段的详细动力学表征。采用直接结合测定法，以抗整联蛋白抗体或Fab片段作为配体，整联蛋白α2β1 I结构域作为分析物。通常，通过胺反应性偶联将600 RU抗体或Fab片段固定在研究级CM5芯片上，对于与抗体和Fab片段结合的I结构域，分别得到80和140 RU的Rmax。以30 μl/分钟的流速，在补充4 mM MgCl2 (10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、0.005%表面活性剂P20)的HBS-P缓冲液中，在介于0.4至28 nM I结构域的浓度范围内测定结合动力学。芯片表面用10 mM甘氨酸pH 2.2再生。使用没有固定的抗整联蛋白抗体或Fab片段的流动池(flow cell)作为参比，用BIAevaluation程序包(4.1版)分析并计算动力学参数。将具有传质的1:1结合模型应用于对应于得自0.4-28 nM抗体或Fab片段的分析物浓度的曲线的数据的整体拟合。

表3：针对整联蛋白I结构域的抗α2整联蛋白mAb和Fab片段的结合动力学。 

阻断mAb和Fab显示对人α2β1-结构域的纳摩尔范围的亲和力(表3)。 

为了进一步评价抗a2整联蛋白mAb的结合性质，用HUVEC细胞(promocell C12200，批号6062203)进行了基于细胞的测定。将细胞涂于PBS中的高结合板(Meso Scale Discovery (MSD)，L15XB-3) (10.000个细胞/孔)上，在室温下孵育2小时。然后将板倒空，用PBS洗涤两次后，用封闭溶液(MSD，R93BA-4)封闭90分钟。如上所述再次倒空和洗涤板后，加入连续稀释的抗α2-mAb，与细胞一起在室温下孵育1小时。在如上所述的另一个洗涤步骤后，加入无表面活性剂的读数缓冲液T (Read buffer T) (Meso scale Discovery，R92TD-2)。在合适的设备(Meso scale Discovery，Sector图像仪)中读取电化学发光。采用Scatchard作图分析以确定受测mAb的KD (见图1)。 

C - 抗α2整联蛋白mAb的交叉反应性质 

借助使用血样或人血小板的FACS实验，针对其与来自猕猴和人的血小板特异性相互作用的能力，对抗α2整联蛋白mAb进行评价。将mAb与人血、猕猴血或人血小板的样品和与山羊-抗小鼠-IGg藻红蛋白(Phycoerithrin) (PE)偶联的第二mAb (Beckman Coulter #731856)一起孵育。样品用裂解溶液(BD #349202)处理，将血小板离心，重新悬浮，并通过FACS分析。

抗α2整联蛋白mAb显示用食蟹猴(macaca fascicularis) (97.3%阳性，图4b)血样与用人全血样品(>98%阳性，图4d)有类似的反应性，而用小鼠、大鼠、狗、豚鼠、猪或兔的全血测试时，未检测到针对这些物种的α2β1整联蛋白的反应性(数据未显示)。因此，按照FACS分析，用灵长类动物α2β1整联蛋白对来自猕猴血液的血小板似乎有抗体种间交叉反应性，而用小鼠、大鼠、狗、豚鼠、猪或兔的全血测试时，未检测到针对这些物种α2β1整联蛋白的交叉反应性。 

实施例3 - 抗α2 IgG和Fab的Fv结构域的人源化和工程改造 

人源化

利用MOE 2008中的抗体modeller应用，构建抗α2整联蛋白mAB抗体VL和VH序列的3D同源性模型。鉴定出出若干PDB模板，以构建LC和HC构架和CDR环。所有模板相对于VL和VH抗α2整联蛋白mAB序列的同一性超过83%，相对于H3环的最佳模板除外(56%同一性)。随后采用在MOE中执行的标准程序，使所得LC和HC模型能量最小化。随后在对蛋白质骨架的约束下并在500K温度下，在Generalized Born隐溶剂(implicit solvent)中达1.1纳秒，进行鼠VL/VH的最小化3D同源性模型的分子动力学(MD)计算。从该第一次MD运行中对于最后1ns每100 ps提取10个不同的构象。然后以对蛋白质骨架无约束下且在300K温度下，在Generalized Born隐溶剂达2.3纳秒，分别对这10个不同的构象进行MD。然后对于10次MD运行的每一次，使用来自MD轨迹的最后2,000张快照(每一皮秒一张)，来计算与参比medo?d位置比较的各个抗α2整联蛋白mAB氨基酸的均方根偏差(rmsd)。通过将给定氨基酸的10次独立MD运行的平均rmsd与所有抗α2整联蛋白mAB鼠氨基酸的总体平均rmsd进行比较，就能决定氨基酸是否有足够的柔性(如MD期间所见)以视为可能与T细胞受体相互作用，并负责免疫应答的活化。在抗α2整联蛋白mAB抗体中，64个氨基酸最终被鉴定为柔性，其中34个不位于CDR或其近邻(5?)。亦不考虑位于“游标(Vernier)”区的氨基酸(J. Mol. Biol. 1992，224，487-499)。

将最多34个柔性抗α2整联蛋白mAB氨基酸(不包括CDR+5?区)在20 ns (10x2ns)期间的运动与49个人种系同源性模型(其每一个都运行10x2ns MD模拟)的相应柔性氨基酸的运动进行比较。通过系统组合7个最常见的人种系轻链(vk1、vk2、vk3、vk4、vλ1、vλ2、λ3)和7个最常见的人种系重链(vh1a、vh1b、vh2、vh3、vh4、vh5、vh6)，来构建49个人种系模型。vk1-vh1b人种系抗体显示其柔性氨基酸较之于抗α2整联蛋白mAB的柔性氨基酸有62% 4D相似性；因此使用vk1-vh1b种系抗体以使集中于柔性氨基酸的抗α2整联蛋白mAB抗体人源化。对于抗α2整联蛋白mAB和vk1-vh1b氨基酸之间的成对氨基酸缔合，根据2个相应的同源性模型α碳的最佳3D重叠，对2条序列进行比对。 

稳定化 

最初提出使相对于其相应的规范序列(不包括CDR)低频率出现的轻链和重链的氨基酸突变成最常见的氨基酸(ΔΔGth > 0.5 kcal/mol；[E. Monsellier, H. Bedouelle. Improving the stability of an antibody variable fragment by a combination of knowledge-based approaches: validation and mechanisms (通过基于知识的方法的组合改进抗体可变片段的稳定性：验证和机制). J. Mol. Biol. 2006, 362,580-593])。LC和HC的共有序列突变的最初列表限于最密切人种系中存在的氨基酸(即vk1-vh1b)，即LC中的4个潜在突变和HC中的3个潜在突变。这些突变无一位于CDR、其近邻(+5埃)或“游标”区中(J. Mol. Biol. 1992，224，487-499)。考虑其它标准以将这些共有序列突变视为可能使抗α2整联蛋白抗体稳定。这些标准是表面亲水性的有利改变或突变体的基于分子力学的预测稳定。

通过移植人源化 

人源化始于分别鉴定抗α2整联蛋白mAB轻链和重链的最密切人种系。这通过执行相对于系统列举的全部人种系(κ和λ链的V和J结构域的所有可能的组合；重链的V、D和J结构域的所有可能的组合)的BLAST检索来进行。利用内部的内联网应用，执行BLAST检索。

鉴定出分别与抗α2整联蛋白轻链和重链有77%和68%同一性的下列最密切人种系： 

IGLKV79_IGLKJ2对应于SEQ ID NO: 49。IGHV11_IGHD33_IGHJ8对应于SEQ ID NO. 50。

通过进行2个比对序列(不包括CDR (Kabat编号)和游标区残基)的成对比较，来获得人源化突变。 

不需要的序列基序的突变 

考虑了下列的序列基序：Asp-Pro (酸不稳定键)、Asn-X-Ser/Thr (糖基化、X=Pro以外的任何氨基酸)、Asp-Gly/Ser/Thr (柔性区的琥珀酰亚胺/iso-asp形成)、Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cys (暴露的脱酰氨基化部位)、Met (暴露区的氧化)。相对于IEDB数据库(http://www.immuneepitope.org/home.do；2009年6月版)，针对序列相似性对所得人源化序列进行blast以确保无一序列含有任何已知的B细胞或T细胞表位。

1. 抗a2b1整联蛋白可变结构域的原始序列 

a. 轻链被突出显示，CDR区中1个NS可能有问题的基序用下划线表示)

b. 重链被突出显示，CDR区中的1个有问题的部位琥珀酰亚胺和iso-Asp形成部位]用下划线表示)

工程改造的序列

设计了轻链的5种形式(轻链变体LC1、LC2、LC3、LC4、LC5)和重链的7种形式(重链变体HC1、HC2、HC3、HC4、HC5、H6、H7)。LC1形式显示4个突变，其来源于抗α2整联蛋白mAB轻链和VK1人种系轻链的非CDR最柔性氨基酸之间的直接比较。LC2形式包括1个额外的突变以除去CDR区中可能的脱酰氨基化部位(N34Q)。LC3形式包括经预测以使抗α2整联蛋白mAB轻链最佳稳定的人源化和稳定化突变。LC4形式包括1个额外突变以除去可能的(N34Q)脱酰氨基化部位。LC5形式显示来源于移植方法的6个突变。

HC1形式显示3个突变，其来源于抗α2整联蛋白mAB重链和VH1b人种系的非CDR最柔性氨基酸间的直接比较。HC2形式包括另一个额外突变以除去CDR区中可能有问题的琥珀酰亚胺Iso-Asp形成部位(D55E)。HC3形式包括经预测以使抗α2整联蛋白mAB重链最佳稳定的人源化和稳定化突变。HC4形式包括额外突变以解决可能的聚集问题。HC5形式包括HC3突变和额外突变以除去CDR区中可能有问题的琥珀酰亚胺Iso-Asp形成部位(D55E)。HC6形式包括额外突变以解决可能的聚集问题。HC7形式显示来源于移植方法的20个突变。 

制备了总共7种组合： 

○ LC1/HC1 (只涉及人源化的突变)

○ LC2/HC2 (涉及人源化和LC/HC可能有问题的部位[NS和DS]的突变)

○ LC3/HC3 (涉及人源化和稳定化的突变)

○ LC3/HC4 (涉及人源化和稳定化和抗聚集的突变)

○ LC4/HC5 (涉及人源化和稳定化和LC可能有问题的部位[NS]和HC可能有问题的部位[DS]的突变)

○ LC4/HC6 (涉及人源化、稳定化、抗聚集及LC可能有问题的部位[NS]和HC可能有问题的部位[DS]的突变)

○ LC5/HC7 (涉及通过移植而人源化的突变)

表4：7 LCxHC组合的汇总表

表5：对于工程改造的抗α2β1 Fab轻链而引入突变的汇总表

表6：抗α2整联蛋白抗体的7个HC变体的突变

如实施例1C所述，人源化可变序列通过基因合成产生并克隆至相应的重链和轻链表达载体。

工程改造的轻链序列 

克隆5种形式的轻链变体(LC1、LC2、LC3、LC4、LC5)。通过可变链工程改造而引入的突变突出显示或用下划线表示。

LC1 (人源化突变用粗体下划线)： 

LC2 (突变突出显示，CDR NS部位的突变用粗体下划线输出)：

LC3 (突变突出显示)：

LC4 (突变突出显示，CDR NS部位的突变用粗体下划线表示)：

LC5 (突出显示)：

下面是LC抗α2β1整联蛋白与VK1-Vh1b人种系的比对

工程改造的重链序列

克隆7种形式的重链变体(HC1、HC2、HC3、HC4、HC5、HC6、HC7)。通过可变链工程改造而引入的突变突出显示。

HC1 (突变突出显示)： 

HC2 (突变突出显示，可能的问题基序[CDR DS部位])：

HC3 (突变突出显示)：

HC4 (突变突出显示，抗聚集突变)：

HC5 (突变突出显示，可能的问题基序[CDR DS部位])：

HC6 (突变突出显示，可能的问题基序[CDR DS部位]，抗聚集突变)：

HC7 (突出显示)：

下面是HC抗α21整联蛋白mAb与HC Vk1_Vh1b人种系的比对：

通过基因合成产生各抗整联蛋白α₂ mAb变体的可变重链和轻链(5个不同的轻链：VL1-VL5和7个不同的重链：VH1-VH7)，包括具有ApaLI的5’UTR-序列(5’-GTGCACAGC-3’)和具有ApaI (重链)或BsiWI (轻链)的3’UTR (5’-GCTTCCACCAAGGGCCC-3’)。将可变重链结构域连接至含有人恒定重链(IGHG4、Swiss-Prot P01861、S108P、L115E)的突变变体的修饰pXL表达载体的ApaLI/ApaI位点，得到抗整联蛋白α₂ VH-IGHG4恒定重链mAb。

将可变轻链结构域连接至含有人恒定轻链(IGKC、Swiss-Prot：Q502W4)的修饰pXL表达载体的ApaLI/BsiWI位点，得到抗整联蛋白α₂ VL-IGKC恒定轻链mAb。基因合成、克隆和DNA产生的整个过程由商业厂商(Geneart AG)实现。 

对于比较，使用本领域已知的人源化hIgG4抗α2整联蛋白抗体(TMC2206) (“比较物(comparator)”)。本文将比较物轻链和重链氨基酸序列作为SEQ ID NO: 53和54列于图10e中。 

表7：抗α2整联蛋白mAb的人源化变体列表 

为了验证序列，采用质谱法分析mAb。对于完整质量测量，捕获样品20分钟，在含2%乙腈/0.1% TFA (v/v)的整体捕获柱(monolithic trap column)中以20 μl/分钟脱盐后，以15%洗脱液A (H2O/0.05%TFA)-50%洗脱液B (乙腈/0.05% TFA)的梯度范围洗脱。

在整体柱(PS-DVB；100μm I.D. x 5 cm)上以37℃的温度按纳米流速(300 nl/分钟)操作对样品进行分离。使用外径365μm、内径75 μm和末端直径15 μm加鞘气(sheath gas)的新物镜的电喷雾针，进行样品引入。在获取后，在相应时间范围内对光谱求和，并应用与来自Applied Biosystems/MDS Sciex的BioAnalyst一起提供的蛋白质重建工具去卷积。 

从质粒编码序列翻译蛋白质序列，并计算HC和LC的质量(表8)。 

表8：纯化的人源化抗α2整联蛋白mAb的质谱分析。 

观测值与计算质量充分一致，验证了克隆的构建体。 

实施例4 –体外用生物化学和基于细胞的测定法对α2整联蛋白mAB进行评价 

对于固相测定法，使整联蛋白(α₂-I结构域：TBS/5mM Mn²⁺中的α₂-I结构域GST aa 140-339，50μl/孔)固定在96孔板(Corning Costar，3690)上，在室温下过夜。然后，加入25μl/孔的封闭溶液(5% BSA (未加工) (A7906)，1xTBS)，并弃去。加入200μl/孔的封闭溶液，在室温下静置3小时。在洗涤步骤(3次，用200μl/孔结合缓冲液：1xTBS和0.1% BSA (A7638)和2mM Mn²⁺；TBS:150mM NaCl、25mM Tris (Fluka 93371) pH7.4)后，使样品与50 μl以下成分在室温下静置孵育3小时：

a) 仅生物素化的胶原—对照(10μl结合缓冲液和40μl生物素化的胶原)

b) 10μl/孔化合物，40μl/孔生物素化的胶原

c) 空白对照：50μl/孔结合缓冲液

在洗涤步骤(用200μl/孔结合缓冲液3次)后，使样品与50μl/孔ExtrAvidin过氧化物酶(过氧化物酶缀合物，Sigma E2886；1:500的结合缓冲液)一起在室温下孵育30分钟，再次用200μl/孔结合缓冲液洗涤4次。在加入50 μl/孔过氧化物酶底物(ABTS溶液；2,2’-连氮基-双3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，Sigma A-1888；275μl (溶于0.5ml dH₂O的11mg ABTS；和5.5ml 0.1M乙酸钠(Sigma S-3272)/0.05M NaH₂PO₄ (Riedel de Haen 04270) pH5.0；和55μl H₂O₂ Sigma H-1009 (10μl (= 30%)和1045μl dH₂O)后，在室温下静置10-30分钟(直到得到绿色染色)并加入50 μl/孔2% SDS后，在405 nm处读取吸光度(SpectraMax 190)。在减去空白对照后，计算%抑制为100-((化合物平均值*100)/胶原阳性对照平均值)。

表9：胶原相互作用被α2整联蛋白mAB抑制 

总之，α2整联蛋白mAB显示对以下无作用：α1β1/胶原相互作用(固相测定)、α5β1/纤连蛋白相互作用(固相测定)、aIIbb3 (GPIIbIIIa)活化(FACS测定)、人血小板(hu plt)上的P-选择蛋白表达(FACS测定)、仅全血中或用ADP、TRAP、胶原刺激后的人血小板聚集、自人PBL的LDH-、TNFα-或IL1β释放(单独或与LPS组合)。

Huvec小管长度形成 

为了评价血管生成中整联蛋白抗a2 mab的活性，用HUVEC细胞进行了体外测定。将基质胶(BD Biosciences，#354230)与胶原I型(BD Biosciences #35429) (基质胶1/3.25、PBS 5x 1/5、胶原I 1mg/ml、qsp水)混合，在37℃、5% CO2下孵育1小时。用Acutase溶液仔细地使贴壁HUVEC细胞从培养瓶上脱离，离心后，以1.2 105个细胞/ml重新悬浮于培养基(EBM，FCS 2%，EGF bullet试剂盒)中。在连续稀释的抗a2 mab和FGF2 (Peptrotech，10ng/ml)存在或不存在下，将100μl的细胞悬液加入具有的基质各孔中，并在37℃、5% CO2下孵育18小时。对于小管形成(tubule formation)检测，加入甲酚紫(cresyl violet)溶液，在37℃下孵育30分钟。通过测量每孔的小管长度总和，来确定小管形成。应用Image Proand软件(MediaCybernetics)，相对于阴性对照(不含FGF2)和阳性对照(含FGF2但不含抗a2 mab)进行计算，每个条件测量6个重复。所得结果见图2。抗α2整联蛋白mAB能够以剂量依赖性方式抑制FGF2诱导的血管生成。

实施例5 - 在流动下和在静态条件下抗α2整联蛋白mAB-Fab对血小板与胶原的粘附的抑制 

对于蛋白质-蛋白质相互作用研究，使重组表达的整联蛋白α2β1整联蛋白或整联蛋白α2β1整联蛋白的I结构域在96孔板(Corning Costar 3690)的TBS缓冲液中在4℃下包被过夜。在洗出过量蛋白质后，将板用BSA溶液(5% Sigma A7906)封闭，并再次洗涤。将连续稀释的α2整联蛋白Mab以及生物素化胶原(大鼠尾，Sigma C8897)加入板中。这在4% HSA存在或不存在时进行。在室温下孵育2小时后，再次洗板。加入Extravidin过氧化物酶溶液(Sigma E2886)，将板避光孵育20分钟。在Elisa读数器(SpectraMax190 Molecular Devices)中于405nM进行测量。计算相对于已知标准物的抑制百分比和IC50。

对于血小板与胶原的结合研究，将板(Isoplate，Perkin Elmer，F1450 571)用TBS中的胶原(Sigma C8897)在室温下包被1小时。将孔用TBS重复洗涤后，加入连续稀释的抗α2整联蛋白MAb。加入用蛭素、PGE1和ReoPro抗凝并用CalceinAM (C-3099 Molecular Probes)标记的新制备的富含人血小板的血浆或分离的人血小板，在室温下避光孵育90分钟。在洗涤后，在M5读数器(Molecular Devices)中于492 nM EX、535 nM EM对板进行测量。计算相对于已知标准物的抑制百分比和IC50。 

在剪切下的实验中，针对其在流动下抑制血小板与胶原粘附的能力对抗α2整联蛋白mAB进行分析。玻璃毛细管在4℃下用胶原包被过夜。洗涤并用BSA封闭后，将它们安装在流动装置中。从志愿者中新抽取的抗凝人血用DiOC6(3)标记，与连续稀释的抗α2整联蛋白mAB一起在37℃下孵育10分钟。以模拟动脉流动的3000s-1的剪切速率使样品流动通过毛细管。在冲洗毛细管后，拍摄代表与流动血液接触的毛细管表面的10张照片。应用成像软件，测定表面覆盖度，计算相对于已知标准物的抑制百分比和IC50。 

对于凝血细胞(thrombocyte)粘附测定，如下富集凝血细胞：将蛭素(20μg/ml；Refludan (Pharmion))和血液以150g离心20分钟以产生抗凝人血。收集富含血小板的血浆(PRP)，如上再次离心并收集。通过以1940 g离心10分钟(2次)，从剩余血液中获得血小板贫乏的血浆。将PPP加入稀释的细胞(2mM Mg)中，调节细胞浓度至2 x 10⁵/μl。将细胞静置0.5小时后，稀释至5x10⁴/μl。此后使细胞与3μg/ml ReoPro (2.5μg/ml；Centocor B.V.，Leiden，NL)接触(10分钟，室温)，加入6mM MnCl₂x4H₂O (5mM) (孵育10分钟)。 

如下制板：将板(Perkin Elmer，IsoPlate，1450-571)与100μl/孔胶原I型10μg/ml (I型来自大鼠尾C8897 Sigma原液200μg/ml (0.01M)乙酸)一起在室温下孵育1小时。然后，将其用200μl/孔TBS (50mM Tris-HCl pH 7.4、120mM NaCl、2.7mM KCl、0.05mM CaCl₂、2mM MgCl₂ x 6 H₂O、0.1% BSA)洗涤3次。此后，加入10μl/孔化合物及ReoPro处理和Mn处理的凝血细胞(5x10⁴细胞/μl，50μl/孔)。将细胞孵育1.5小时(黑暗)，用200μl/孔TBS洗涤3次。加入2.5μM钙荧光素AM (50μl/孔，C-3099，Molecular Probes，MW 994.87，30分钟，RT)，接下来是洗涤步骤。在无细胞时，使用SpectraMax M5：Fluoreszenz激发492，发射535，截止值：530 Automatic进行读出步骤。在减去空白对照后，计算%抑制为100-((化合物平均值*100)/对照平均值)。 

可由图3获知，抗α2整联蛋白mAB在剪切应力下剂量依赖性地抑制血小板粘附，具有纳摩尔IC50。 

实施例6 - 通过大小排阻层析法测定的抗α2整联蛋白mAb的聚集行为 

测试所有人源化变体和比较物的聚集百分比。使用TSKgel G3000SWXL柱(7.8mm ID x 30.0 cm L，TosohBioscience)与TSKgel SWXL保护柱(TosohBioscience)，在探察器10 (GE Healthcare)上进行大小排阻层析法。以0.4-1mg/ml注入30μl样品，使用100 mM Na₂SO₄、100 mM Na₂HPO₄、0.05% NaN₃ pH 6.7作为运行缓冲液以1ml/分钟和280nm的检测波长进行层析法。柱使用凝胶过滤分子量标志物(Sigma Aldrich)校准。应用Unicorn软件v5.11 (GE Healthcare)进行数据评价。

表10：通过大小排阻层析法测定的抗α2整联蛋白mAb的聚集百分比。 

LC/HC组合聚集[%]峰高[mAU]LC1/HC1< 0.574.4LC2/HC2< 0.547.8LC3/HC3< 0.593.7LC3/HC42.367.2LC4/HC51.867.9LC4/HC6< 0.529.1LC5/HC7< 0.546.5TMC220611.820.7

可从表10中获知，α-2整联蛋白mAb的所有受试变体都具有低的聚集体百分比。当与比较物的聚集行为比较时，所有受试α-2整联蛋白抗体显示出低于比较物的聚集百分比值。 

实施例7 - 通过Biacore测定的抗α2整联蛋白mAb的动力学结合数据 

Biacore 3000 (GE Healthcare)的表面等离振子共振技术用于纯化的人源化抗体的详细动力学表征。俘获测定法与被抗人Fc特异性抗体(MAB1302，Millipore)俘获的抗整联蛋白抗体一起使用，且整联蛋白α₂ I结构域用作分析物。通常，在研究级CM5上通过固定化抗人Fc特异性抗体俘获120 RU抗整联蛋白抗体，导致与抗体结合的I结构域的Rmax为30 RU。以30 μl/分钟的流速，测量补充4 mM MgCl₂ (10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、0.005%表面活性剂P20)的HBS-P缓冲液中的I结构域(在0.8与25 nM间的浓度范围内)的结合动力学。芯片表面用10 mM甘氨酸pH 2.5再生。使用具有固定化抗人Fc特异性抗体的流动池作为参比，分析动力学参数，并在BIAevaluation程序包(4.1版)中进行计算。将具有传质的1:1结合模型应用于对应于来自0.8-25 nM抗体的分析物浓度的曲线的数据的整体拟合。

表11. 3种变体具有与非人源化mAb类似的K_D (Biacore中)： 

-组合LC1/HC1 (只涉及人源化的突变)

-组合LC3/HC3 (涉及人源化和稳定化的突变)

-组合LC3/HC4 (涉及人源化和稳定化和抗聚集的突变)。

通过移植的变体突变接近非人源化mAb。 

实施例8 - 抗α2整联蛋白抗体的表位确定 

为了验证具有比较物mAb的非人源化抗α2 mAb的表位，采用Biacore 3000 (GE Healthcare)表面等离振子共振技术进行表位表征。通过胺反应性偶联以500 RU将对应于非人源化抗α2 mAb的Fab片段固定在CM5芯片上。通过Fab片段以10μl/分钟俘获整联蛋白I结构域，在短暂解离期后，使抗体TMC2206以30μl/分钟与α₂ I结构域结合。用10mM甘氨酸缓冲液pH 2.0进行再生。在第二个实验中，在抗人Fc特异性抗体(MAB1302 Millipore)的表面上俘获比较物mAb TMC2206。然后结合整联蛋白I结构域，接着是非人源化Fab。结果可获自图13和14。结果清楚表明比较抗体TMC2206与被非人源化Fab预先结合的整联蛋白I结构域结合。

因此，非人源化Fab与被比较物mAb TMC2206预先结合的整联蛋白I结构域结合。非人源化Fab和比较物mAb与整联蛋白α₂ I结构域的同时结合表明Fab和比较物mAb两者的表位不相同。这就意味着本发明的抗α2抗体和比较抗体结合α2整联蛋白内的不同表位。 

实施例9 - 使用胶原包被的板和洗涤的血小板或富含血小板的血浆在静态条件下的血小板结合测定 

由于α2β1整联蛋白在血小板上表达，在其与胶原的粘附中起重要作用，因此采用使用这些细胞的体外测定系统用于血小板结合研究。对于血小板结合研究，将板(Isoplate，Perkin Elmer，F1450 571)用TBS中的胶原(Sigma C8897)在室温下包被1小时。各孔用TBS重复洗涤后，加入连续稀释的抗α2整联蛋白mAb。加入用蛭素、PGE1和ReoPro抗凝的和用钙荧光素AM (C-3099 Molecular Probes)标记的新制备的富含人血小板的血浆或新分离的人血小板，在室温下避光孵育90分钟。在洗涤后，在M5读数器(Molecular Devices)中以492 nM激发光、535 nM发射光对板进行测量。相对于使用α-2-整联蛋白或非人源化α-2 mAB的小分子抑制剂绘制的滴定曲线，计算抑制百分比和IC50。结果可获自表12。

表12：经洗涤血小板与胶原结合的抑制 

LC/HC组合IC50 μg/mlLC1/HC10.021LC2/HC20.092LC3/HC30.012LC3/HC40.016LC4/HC50.057LC4/HC60.068LC5/HC70.031TMC2206 (比较物)0.023

从表12所示结果可获知，在静态条件下使用经洗涤的血小板，由不同抗α2抗体变体所显示的血小板抑制与比较抗体所显示的血小板抑制相当，对于某些变体(LC3/HC3或LC3/HC4)甚至显著或略微(LC1/HC1)更强。

表13：富含血小板的血浆中血小板与胶原结合的抑制 

LC/HC组合MW IC50 μg/mlLC1/HC10.277LC2/HC23.963LC3/HC30.132LC3/HC40.193LC4/HC53.251LC4/HC64.113LC5/HC70.224TMC22060.110

从表13所示结果可获知，在静态条件下使用富含血小板的血浆，由不同抗α2抗体变体(变体LC1/HC1、LC3/HC3、LC3/HC4和LC5/HC7)所显示的血小板抑制与比较抗体所显示的血小板抑制相当。

从静态血小板结合测定可得出结论，在血浆存在或不存在时，抗α2整联蛋白抗体的人源化形式以浓度依赖性方式阻断新分离的人血小板的粘附。在生物测定中4种变体显示与非人源化mAb类似的抑制活性： 

-组合LC1/HC1 (只涉及人源化的突变)

-组合LC3/HC3 (涉及人源化和稳定化的突变)

-组合LC3/HC4 (涉及人源化和稳定化和抗聚集的突变)

-组合LC5/HC7 (涉及通过移植而人源化的突变)

在上述血小板结合实验中，涉及有问题的部位(NS；DS) LC2/HC2、LC4/HC5和LC4/HC6并显示较低血小板抑制的3种变体与在上述实施例7的Biacore实验(参见表11)中显示出比非人源化抗α2整联蛋白抗体弱的α2 I结构域结合活性的变体相同。因此，血小板结合测定的结果与得自Biacore评价的亲和力数据充分一致。

实施例10 - 不同的抗α2抗体变体的热稳定性 

有关热稳定性的结果概括于表14。抗体显示与比较物相当、相等或更佳的热稳定性。采用PCR热循环仪(My-IQ – 在介于10℃与90℃的温度范围以1℃/分钟的两个)进行热稳定性测量。用40XSYPRO Orange (Invitrogen)补充稀释于PBS缓冲液的2微克抗体。

表14：不同变体的热稳定性 

LC/HC组合解链温度℃ (1)解链温度℃ (2)LC1/HC164-LC2/HC263-LC3/HC36468LC3/HC466-LC4/HC56267LC4/HC666-LC5/HC76572TMC2206 (比较物)6571