胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂,它们的制备以及作为凝结因子IIa和Xa的选择性抑制剂的用途

摘要

本发明提供了制造和使用具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的方法；其中n是在1和2之间的整数，含1和2；m是在0和2之间的整数，含0和2；X选自由CH或N组成的组；R

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年12月21日提交的美国临时申请号61/425,597 的权益，通过引用将其以整体结合于此。

发明领域

本发明涉及有机化学领域、丝氨酸蛋白酶（具体地凝血酶和Xa因 子）、血栓形成和止血，并且涉及血液凝结的治疗调控。

发明背景

凝血酶和Xa因子是血液凝结的关键酶。Xa因子（FXa）从它的前 体X因子被活化，这是通过内在性tenase复合物（IXa因子/VIIIa因子）或者 通过外在性性tenase复合物（组织因子/FVIIa）。Xa因子将凝血酶原活化为 凝血酶，当Fxa结合进入由Va因子、Ca和磷脂组成的凝血酶原酶复合物时 这个反应被增大400,000倍。凝血酶催化纤维蛋白原向纤维蛋白的转换并且活 化血小板，这两者都导致血凝块形成。凝血酶在凝结系统内部和外部具有另 外的功能。通过活化因子VIII、V、和XI，凝血酶将其自身的产生进行放大 但是凝血酶对蛋白质C的活化促成凝结的下调。凝血酶对因子XIII连同凝血 酶可活化的纤维蛋白溶解抑制剂（TAFI）的活化影响纤维蛋白溶解系统并且 促成凝块稳定，并且凝血酶的一些细胞功能和炎症功能主要通过结合至蛋白 酶活化受体而被介导。

凝血酶和Xa因子两者均是用于抗凝血剂治疗的被证实的目标。临 床中使用的多数抗凝血剂药物具有抗凝血酶或者抗FXa活性，或者两者均具 备。直接的凝血酶抑制减弱了纤维蛋白的形成、凝血酶介导的V、VIII、XI 和XIII因子的活化以及凝血酶诱导的血小板活化和聚集。

因为其在凝结反应顺序中处于凝血酶的上游位置，Xa因子已经变 成了用于抗凝血治疗的具有吸引力的靶标。一个Xa因子分子的活化导致了 1000个凝血酶分子的产生，这一事实意味着少量的Xa因子抑制剂可以有效 地阻断凝血酶产生，而不需要高全身水平的抗凝血药物浓度，同时低水平的 凝血酶保留活性以保证初级止血作用和凝血酶的其它功能。选择性的Xa因子 抑制在许多动物研究中已经显示以提供对初级止血作用的标记有很少或没有 影响的抗凝血疗效（Leadley（利德里）等人，Curr.Top.Med.Chem.（《药物 化学当前论题》）1,151-159,2001）。

在凝结级联中肝素将包括凝血酶和Xa因子的多种酶作为靶标。这 是60多年来抗凝血治疗的主要依据，但是它的使用与许多缺点相连。肝素的 限制来源于它间接的、抗凝血酶（AT）依赖的抑制模式以及来源于至血浆蛋 白和细胞的非特异性结合。低分子的肝素（抗Xa和抗凝血酶活性）以及硫酸 化的戊多糖（选择性的抗Xa制剂）的缺乏不会展示相同的非特异性结合亲和 力并且已经在一些临床环境中替代了未分级肝素。然而，已经被证明的是凝 块相关联的凝血酶以及凝血酶原酶促成血栓的生长和凝血酶的产生（Orfeo （欧菲欧）等人J Biol.Chem.（《生物化学期刊》）283,9776-9786,2008以及 Brufatto（布鲁法陀）等人，J.Thromb.Haemost.（《血栓形成与止血法期刊 》）1,1258-1263,2003），但是它们针对AT依赖性抗凝血剂（例如肝素、 LMWH以及戊多糖）是被保护的（Weitz等人,J Clin.Invest.（《临床调查杂志 》）86,385-391,1990）。

同时将凝血酶和Xa因子作为靶标的小分子直接抑制剂具有减弱凝 血酶产生和凝血酶活性的的潜力，与AT依赖性抗凝血剂相比更有效。凝血酶 和Xa因子的双重抑制概念还受到Gould（古尔德）等人的发现支持（J  Thromb.Haemost.（《血栓形成与止血法期刊》）4,834-841;2010），这证明了 在体外以及在血栓形成动物模型中将低剂量的直接凝血酶抑制剂与直接Xa因 子抑制剂结合的协同性抗凝血作用。既然与每一药物单独使用的累加作用相 比流血时间没有增加，那么作者建议多种凝结酶的直接抑制可以提供改进的 疗效/安全性比例。来源于将未分级肝素、LMWH、戊多糖和直接的选择性 Xa因子抑制剂相比较的体外研究进一步支持以下概念：多治疗性制剂与某些 单一靶标制剂相比在预防表面诱导的凝块形成方面是更有效的抗凝血剂 （Montalescot（蒙塔克莱斯科特）和Walenga（韦林噶）， Clin.Appl.Thromb.Hemost.（《血栓形成与止血法的临床应用》）15,183- 196,2009）。

在过去的10年中，数目日益增加的小分子、选择性的Xa因子和凝 血酶抑制剂已经被公开并且在一些评论性的文章中被总结。

Xa因子的活性位点的一些合成抑制剂得以披露。将区分两种类别 的抑制剂：口服抑制剂以及用于非经肠道使用的抑制剂。在临床使用或在临 床研发中的口服抗凝血剂的实例是：拜瑞妥（利伐沙班），具有0.4nM的Ki （抗FXa），（Perzborn（珀茨班）等人，J Thromb Haemost（《血栓形成止 血法期刊》）3:514-21,2005），在2008年推出；以及阿哌沙班 （Apixaban），具有0.08nM的Ki（抗FXa）（BMS652247，在WO- 03026652中提出权利要求；2003年4月；《阿哌沙班，口服的、直接的和高 选择性的Xa因子抑制剂：在体外，抗凝血和抗溶血的研究》，Wong（翁） 等人，J.Thromb.Haemostasis，（《血栓形成止血法期刊》）6,820-829,2008） 。

相似地，凝血酶的活性位点的合成抑制剂（IIa因子），所谓的直 接凝血酶抑制剂（DTI）已经得以披露，例如希美加群（Exanta）（西米拉坦 （Ximelagatran）；Eriksson（埃里克森）等人，J.Thromb.Haemost.（《血栓 形成止血法期刊》）1,2490-2496,2003），其具有2nM的Ki，在2006年已经 从市场上撤销，以及达比加群酯（Pradaxa）（达比加群（Dabigatran）），其 具有0.41nM的Ki，在WO-9837075中第一次提出权利要求；Baetz（贝耶 茨）和Spinler（斯宾乐），Pharmacotherapy（《药物疗法》），28,1354- 1373,2008）。

阿加曲班（Argatroban）是小分子的基于精氨酸的DTI，具有27-39 nM的Ki（Berry（贝里）等人,Br.J.Pharmacol.（《英国药理学期刊》） 113,1209-14,1994）。在研发中的非经肠道的DTI的实例是美拉加群 （Melagatran）（停止使用；1.3nM的Ki）、夫洛加群（Flovagatran）（派昂 （Paion））或NU172（Nuvelo）（Gross（格罗斯）和Weitz（维茨），Clin  Pharmacol Therapeut（《临床药理学治疗》）86,139-146,2009；Weitz.（维 茨）Thromb.Haemost.（《血栓止血法》）103,62–70,2010）。

相似地，存在选择性的直接Fxa抑制剂处于不同研发阶段，例如奥 米沙班（Otamixaban）（Guertin（古尔汀）等人，Bioorg.Med.Chem.Lett. （《生物有机化学与医药化学通讯》）12,1671-1674,2002）以及选择性模拟 肽的FXa抑制剂（（唐尼克）等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.《生物有 机化学与医药化学通讯》17,3322–3329,2007）。

Stürzebecher（斯特泽波克）等人已经描述了一系列的对丝氨酸蛋 白酶上具有不同作用的N端磺酰化苯甲脒模拟肽。在这个类别中包括的是Xa 因子抑制剂，作为抗凝血剂和抗血栓药是有用的（美国专利号6,841,701）； 尿激酶抑制剂，作为肿瘤抑制剂是有用的（美国专利申请公开号 2005/0176993，美国专利号6,624,169）；血浆激肽释放酶抑制剂（PK）、 XIa因子和XIIa因子，作为抗凝血剂和抗血栓药是有用的（美国专利申请公 开号2006/0148901）；以及蛋白裂解酶抑制剂，作为肿瘤抑制剂是有用的 （美国专利申请公开号2007/0055065）。已经描述了这些抑制剂的临床应用 。

所有这些DTI和FXa抑制剂的共有特征是它们仅仅对一种酶（凝 血酶或者Fxa）有显著的特异性抑制。但是未分级肝素（UTF）抑制凝血酶和 FXa至相似的程度，众多FXa抑制剂并且尤其是基于与低分子量的肝素 （LMWH）相比链长缩短的硫酸化的葡萄糖胺聚糖（例如临床应用的戊聚糖 钠（Arixtra）（磺达肝素（Fondaparinux））、法安明（Fragmin）（达肝素 （Dalteparin））或者达纳肝素（Danaparoid））对FXa的抑制展现了更高的 选择性（Eikelboom（艾克博姆）和Weitz（维特兹）,Circulation（《循环 》）,121,1523-1532,2010）。Idrabiotaparinux（其是经修饰的、具有解毒药识 别部分的磺达肝素）也是间接FXa抑制剂的实例。与LMWH、磺达肝素和单 选择性凝血酶抑制剂或者FXa抑制剂相比，UFH不仅仅间接地抑制凝血酶和 FXa，还抑制XIa因子并且在较低程度上，抑制XIIa，并且因此在调控接触活 化途径中是有效的。“这可能部分解释了为什么早期试图使用LMWH来预防 心脏侧支循环中的凝块并没有显示任何希望，以及为什么使用磺达肝素与使 用UFH相比心导管的血栓形成的风险较高。”（Hirsh（赫什）等人， Circulation（《循环》）116,552-560,2007）。

与具有显著的单特异性的抑制剂相比，双重抑制剂的概念与天然凝 结抑制剂（也就是肝素）具有吸引人的相似性，肝素抑制凝血酶和FXa两者 并且对这两种酶有同等活性。肝素的缺点或者不良作用并没有被归因于它的 多重抑制模式。此外，它的多重靶标活性（也涉及接触阶段蛋白酶的抑制） 可能在血液与外来表面接触而不促成出血作用的情况中是一个优势。新研发 的单选择性的合成FXa抑制剂和凝血酶抑制剂用于再现肝素的有利作用以及 治疗效果的能力已经受到质疑（Fareed（法瑞德）等人， Semin.Thromb.Hemost.（《血栓形成止血法研讨会》）34,58-73,2008）。在大 部分随机化的实验中，选择性制剂到目前为止关于局部缺血端点没有证明优 于UFH或LMWH的优势，这表明像UFH或LMWH的具有多作用位点的化 合物在具有急性冠状综合征的病人中导致了更好的局部缺血结果（Cohen（科 恩），Am.J Med.（《美国医药期刊》）123,103-110,2010）。像组织因子/VII 因子抑制剂rNAPc2和选择性的间接FXa抑制剂磺达肝素的选择性制剂已经 在经受PCI治疗的ACS病人中显示了不足的抗凝血活性（Chan（陈）等人， J Thromb.Thrombolysis（《血栓形成与血栓溶解期刊》）28,366-380,2009）。 使用磺达肝素与UFH相比导管血栓形成的发病率增加了，这表明需要另外的 凝血酶抑制以预防接触介导的活化，所述接触介导的活化是在心肺分流外科 手术中（CPB）更加相关的现象。

来源于在体外将UFH、LMWH、磺达肝素和奥米沙班相比较的研 究的数据支持以下概念：包括UFH和依诺肝素（enoxaparin）的多治疗性制 剂与某些单靶标制剂相比在预防表面诱导的凝块形成方面是更有效的抗凝血 剂（Montalescot（蒙塔克莱斯特）和Walenga（韦林噶）， Clin.Appl.Thromb.Hemost.（《血栓形成与止血法的临床应用》）15,183- 196,2009）。凝血酶和FXa的双重抑制具有有效地阻止凝血酶生成和凝血酶 活性的潜力。通过凝血酶和Fxa的同时抑制的协同性抗凝血作用在体外和动 物模型中被证明，并且已经发现关于疗效和出血2-3的抗Xa/抗凝血酶活性的 比例是最优的（Gould（古尔德）等人，J.Thromb.Haemost.（《血栓形成与止 血法期刊》）4,834-841,2006）。

在文献中披露了以下双重凝血酶/FXa抑制剂：Tanogitran（Linz （林茨）等人，WO2004/000818；Ries（瑞希）等人，WO2004/000310）， Tanogitran的特征在于具有0.1的FXa/凝血酶的比例，RWJ445167（Tianbao （天宝）等人，US7,402,586；Maryanoff（玛瑞亚纳夫）等人，Chem. Biol.Drug Des（《化学生物药物设计》）68:29–36,2006）），RWJ445167具 有的<0.02的比例，一系列基于噁唑并吡啶的双重抑制剂（Deng（邓）等人， Bioorg.Med.Chem.Lett.（《生物有机化学医药化学通讯》）15,4411-4416, 2005）以及一系列基于喹喔啉酮的双重抑制剂（Ries（瑞希）等人，Bioorg. Med.Chem.Lett.（《生物有机化学医药化学通讯》）13,2297-2302,2003）。 还有两个基于LMWH的产品：M118（Momenta（莫门塔公司）；Kishimoto （基什莫托）等人，Thromb.Haemost.（《血栓形成与止血法》）102,900– 906,2009）和EP217609，（Endotis Pharma（因多地茨法玛尔公司）； Petitou（派提托）等人，Thromb.Haemost（《血栓形成与止血法》）102, 804–810,2009），两者对凝血酶和FXa是等效的并且分享其作用受解毒药控 制的特异特征。

发明的简要说明

已经发现化具有化学通式I的化合物，

或其药学上可接受的盐，是凝血酶和Xa因子有效的和选择性的双重抑 制剂，其中X、R₁至R₄、n、以及m如下定义。相应地本发明提供了具有化 学式I的化合物、用于制备具有化学式I的化合物的方法以及包括具有化学式 I的化合物的药用组合物。本发明通过具有化学式I的化合物的给药还提供了 在病人中抑制凝血酶和Xa因子的方法、用于凝血级联的治疗调控的方法，特 别是在病人中用于血栓形成疾病的治疗的方法。

本发明进一步提供了用于在以下方面使用这些化合物的方法：制造 用于在病人中抑制凝血酶和Xa因子的药物以及用于凝结级联的治疗调控的药 物。可以用本发明组合物进行治疗的受试者包括但不限于，经历血栓形成和 血栓栓塞疾病的病人，处于要求建立再灌注或延迟血液循环闭塞情况中的病 人，例如经历急性冠状综合征、心房颤动、深静脉血栓形成和肺部栓塞、急 性弥散性血管内凝血以及肝素诱导的血小板减少（HIT）的病人，以及需要经 皮冠状动脉介入治疗、用于心脏手术的心肺分流、用于体外生命维持的体外 膜式氧合回路、介入性心脏病学（血管形成术和支架植入术）以及血液过滤 的病人。

发明详细说明

本发明提供了具有以下化学式(I)的化合物

或其药学上可接受的盐；

其中：

n是在1和2之间的整数，含1和2；

m是在0和2之间的整数，含0和2；

X选自由CH或N组成的组；

R选自由-CH₂NH₂和组成的组；

R₂选自下组，该组由以下各项组成：-H、-OH、-NH₂和乙酰基；

R₃选自下组，该组由以下各项组成：-H、苄氧基羰基和苄基磺酰 基；并且

R₄选自下组，该组由以下各项组成：-OH，

其中p 是在0和2之间的整数，含0和2，Y选自下组，该组由以下各项组成：-O- 、-S-、-S(=O)-、-SO₂-、亚甲基、-CH(OH)-、-CH(NH₂)-、-CH(CH₂-OH)-、- CH(CH₂-NH₂)-或-N(R₆)-，R₅选自由-H或简单的(C₁-C₃)烷基组成的组并且R₆选自下组，该组由以下各项组成：-H、简单的(C₁-C₃)烷基或简单的(C₁-C₃)酰 基。

在优选实施例中，R₃选自下组，该组由以下各项组成：苄氧基羰基 和苄基磺酰基。

在另一优选实施例中，R₄选自下组

其中R₅是-H或甲 基。

在另一个优选实施例中，R₁是-CH₂NH₂，并且R₄选自下组：

并且其中R₅是-H 或者甲基

以下描述的是本发明的化合物的代表性实例。

或其药学上可 接受的盐

本发明化合物的药学上可接受的盐优选地通过添加在药用盐的形成 中有用的任何已知的酸而形成。用于盐形成的优选的酸包括HCl、HBr、硫酸 、磷酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、三氟乙酸、和对-甲基苯磺酸。

本发明还提供了包括本发明的一种或多种化合物的药用组合物，与 一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂相结合。此些赋形剂包括但不限 于，填充剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、水、缓冲剂和崩解剂。所述组合物 可以处于固体或液体的形式、用于口服给药的化合的形式、或者处于适合用 于非经肠道给药的溶液或悬浮液的形式。具体地，提供了适合用于非经肠道 给药的缓冲盐溶液，如适合用于重构成为缓冲盐溶液的粉末状或者冻干的组 合物。

药学上可接受的载体和赋形剂是那些可以被用于生产适合于给药至 受试者的本发明的化合物的配制品的化合物、溶液、物质或材料。具体地， 本发明的载体和赋形剂是在制备药用组合物中有用的那些，所述药用组合物 总的来说是安全的、非毒性的并且并非生物学上地或者其它不希望的，并且 可以展示药理学有利的方面，并且包括兽医用途和人类药用用途可接受的载 体和赋形剂。合适的药学上可接受的载体和赋形剂对于本领域的普通技术人 员是熟知的并且可以由那些本领域的普通技术人员按照临床授权来确定。熟 练的业内人士将理解稀释剂包括在术语载体和赋形剂的范围内。合适的载体 和赋形剂的实例包括盐水、缓冲盐溶液、葡萄糖、水、丙三醇、乙醇、丙二 醇、聚山梨酯80（Tween-80^TM）、聚(乙烯)乙二醇300和400（PEG300and 400）、聚乙二醇化的蓖麻油（例如，聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL））、 泊洛沙姆407和188、环糊精或环糊精衍生物（包括HPCD（(2-羟丙基)-环糊 精）和(2-羟乙基)-环糊精；见，例如，美国专利申请公开20060194717），亲 水和疏水载体，以及其组合。疏水载体包括例如脂肪乳液、脂类、聚乙二醇 化磷脂、聚合物基质、生物相容聚合物、lipospheres、囊泡、颗粒以及脂质体 。

在配制品中包括的赋形剂根据例如药物的性质以及给药的模式具有 不同的目的。通常使用的赋形剂的实例包括但不限于：稳定剂、增溶剂和表 面活性剂、缓冲剂、抗氧化剂和防腐剂、张度剂、膨胀剂、润滑剂、乳化剂 、悬浮剂或粘度剂、惰性稀释剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、润湿剂、润滑 剂、抗菌剂、螯合剂、增甜剂、加香剂、调味剂、着色剂、给药助剂，以及 其组合。所述组合物可以包含普通载体和赋形剂，例如玉米淀粉或明胶、乳 糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠、藻酸、交联 羧甲基纤维素钠和羧基乙酸淀粉钠。使用的具体载体、稀释剂或赋形剂将取 决于活性成分被应用的方法和目的。药学上可接受的赋形剂还包括使组合物 与血液相容的张度剂。在可注射的配制品中张度剂是尤其希望的。

具有通式I的化合物可以通过使用合适选择的保护基团连续形成酰 胺键和磺酰胺键进行制备。术语“保护基团”是指展示以下特征的化学基 团：1）与特殊的官能度反应以给出受保护的底物，所述受保护的底物对于所 希望保护的目标反应是稳定的；2）可以选择性地从所述受保护的底物移除以 产生所希望的官能度；并且3）通过试剂以良好产率移除，所述试剂与此些目 标反应中存在的或产生的其它官能基团相容。合适的保护基团的实例可以发 现于Wuts（欧茨）和Greene（格雷内）（2007）的Protective Groups in  Organic Synthesis（《有机合成中的保护基》）4^thEd.（John Wiley&Sons，Inc. （约翰威立父子出版公司），纽约）中。优选的氨基保护基团包括但不限 于，苄氧基羰基（CBz）、叔-丁氧羰基（Boc）、叔-丁基二甲基甲硅烷基 （TBDMS）、9-芴甲基-氧基羰基（Fmoc）、6-硝基藜芦基氧基羰基 （Nvoc）、硝基胡椒基、芘基甲氧基羰基、苄基、硝基苄基、二甲氧基苄基 、5-溴-7-硝基二氢吲哚基，以及类似物。优选的羟基保护基团包括乙酰基、 苯甲酰基、苄基、四氢吡喃基、TBDMS、甲氧基或乙氧基甲醚，以及类似物 。优选的羧基保护基团包括但不限于，甲基、乙基、苄基、TBDMS、2,2,2-三 氯乙基、2-(三甲基硅烷基)乙基、(2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基、苯基和硝基 苯基酯、乙基、甲基和苯基硫酯，以及类似物。

可以一些途径制备本发明的化合物。优选的合成途径涉及在预合成 组分之间的酰胺键和磺酰胺键的形成。

如在此使用的，衍生自给定的酸的表达“活化的羧酸”是指对胺具 有反应性的羧酸衍生物，包括但不限于活性酯、混合酸酐和酰基卤化物，这 在肽合成领域中是公认的。合适的实例包括但不限于，N-羟基苯并三唑酯、 O-酰化异脲、五氯-和五氟-苯酯、酰氯、与受阻酸的混合酸酐以及碳酸单酯。 另外的合适的实例是酰氧基鏻盐。优选的活化的羧酸是通过与氯甲酸异丁酯 或N-羟基苯并三唑酯反应而获得的混合酸酐。这些活化的羧酸衍生物可以纯 态形式使用或者使用本领域普通技术人员熟知的方法在反应混合物中瞬间产 生。

具有结构的化合物，其中P¹是本领域已知的氨基保 护基团并且例如可以通过在Nelson（尼尔森）等人，J.Org.Chem.（《有机化 学期刊》）69，3620-3627，2004和Selnik（塞尔尼克）等人，WO 02/50056，2002中描述的方法而获得。具有结构的化合物同是 本领域已知的并且可以通过描述于Young（杨）等人，J.Med.Chem（《医药 化学期刊》）47，2995-3008，2004中的方法获得。

在本发明的实施例中，本发明的化合物可以通过以下进行制备：使 用衍生自具有化学式A的酸的活化羧酸对具有结构的化合物进 行酰化，其中R₁选自由CH₂NHP¹和组成的组并且P¹是氨基保护基团

其中n是在1和2之间的整数，含1和2；m是在0和2之间的整数，含 0和2；X选自由CH或N组成的组；R₂选自下组，如果X是CH，则该组由 以下各项组成：-H、-OH和-NHP²并且如果X是N，则该组由以下各项组 成：-P²或乙酰基；R₃选自下组，该组由以下各项组成：-H、苄氧基羰基和苄 基磺酰基；R₄并且选自下组，该组由以下各项组成：-OP³、 其中p是在1和2之间的整 数，含1和2，Y选自下组，该组由以下各项组成：-O-、-S-、-S(=O)-、-SO₂- 、亚甲基、-CH(OH)-、-CH(NHP²)-或-N(R₆)-，R₅选自由-H或简单的(C₁-C₃)烷 基组成的组并且R₆选自下组，该组由以下各项组成：-P²、简单的(C₁-C₃)烷基 或简单的(C₁-C₃)酰基；P²各自独立地是氨基保护基团；并且P³是羧基保护基 团。氨基保护基团P¹和P²或者氨基保护基团P¹和P²以及羧基保护基团P³随 后的裂解给出本发明的化合物。

如果P¹和一个或全部P²基团是相同的氨基保护基团，或者是在相 同条件下被移除的保护基团，那么最后的脱保护可以作为单一的步骤来进行 。例如，如果P¹和P²全部是叔丁氧羰基保护基团，则它们可以在单一的质子 传递步骤中被全部移除，方法是通过使用强酸进行处理，比如在二氯甲烷中 的三氟乙酸或在二噁烷中的盐酸。相似地如果P¹是叔丁氧羰基基团并且一个 或全部P²基团是苄氧基羰基基团，则它们可以在单一的合成步骤中被全部移 除，方法是通过使用强酸进行处理，比如在乙酸中的氢溴酸。相比之下，所 述保护基团的移除可以在两个分离步骤中进行。因此，如果P¹是叔丁氧羰基 保护基团并且一个或全部P²基团是9-芴甲氧羰基基团，那么P²的移除可以在 随后的步骤中使用强碱试剂（比如单独的或在二甲基甲酰胺中的哌啶）进 行，P¹的移除可以通过使用强酸处理来进行，例如在二氯甲烷中的三氟乙酸 或在二噁烷中的盐酸。

相似地，P³可以与P¹和/或P²一致地被移除或者它可以在分离的步 骤中被移除。例如，如果P³是叔丁基保护基团并且P¹是叔丁氧羰基基团，则 它们可以通过使用强酸进行处理（比如在二氯甲烷中的三氟乙酸或在二噁烷 中的盐酸）被全部移除。相比之下，P³可以在与P¹和/或P²的移除相分离步 骤中被移除。因此如果P³是甲基基团并且P¹是叔丁氧羰基基团，那么P³可以 通过使用强亲核体（例如在二噁烷/水中的氢氧化锂）处理被移除，并且P¹可 以在分离的步骤中通过使用强酸（例如在二氯甲烷中的三氟乙酸或在二噁烷 中的盐酸）处理被移除。

本发明的化合物的最终纯化优选地通过制备型反相色谱、结晶和/ 或重结晶来进行。具体的，本发明的化合物的合适结晶盐的选择可以是用于 本发明的化合物大规模最终纯化的优选方法，如在本领域是常规的。

在本发明的实施例中，具有通式A的化合物可以进一步通过以下 制备：使用衍生自结构G的活化羧酸对具有通式的胺进行酰化，其中p是在1和2之间整数，含1和2，Y选自下 组，该组由以下各项组成：-O-、-S-、-S(=O)-、-SO₂-、亚甲基、-CH(OH)-、- CH(NHP²)-或-N(R₆)-，R₅选自由-H或简单的(C₁-C₃)烷基组成的组并且R₆选自 下组，该组由以下各项组成：-P²、简单的(C₁-C₃)烷基或简单的(C₁-C₃)酰基

其中n是在1和2之间的整数（含1和2）；m是在0和2之间的整数 （含0和2）；X选自由CH或N组成的组；R₂选自下组，如果X是CH，则 该组由以下各项组成：-H、-OH和-NHP²并且如果X是N，则该组由以下各 项组成：-P²或乙酰基；R₃选自下组，该组由以下各项组成：苄氧基羰基和苄 基磺酰基；P¹是羧基保护基团；并且每个P²独立地是氨基保护基团。保护基 团P¹的随后裂解给出了具有通式A的化合物。脱保护步骤的顺序例如在 [00034]段中讨论。

在本发明的另外实施例中，具有通式A的化合物可以进一步通过 使用衍生自具有化学式I的酸的活化羧酸对具有化学式H的胺的酰化来制备

其中n是在1和2之间的整数，含1和2；m是在0和2之间的整数，含 0和2；X选自由CH或N组成的组；P¹是羧基保护基团；R₂选自下组，如果 X是CH则该组由以下各项组成：-H、-OH和-NHP²，并且如果X是N则该 组由以下各项组成：-P²或乙酰基；R₃选自下组，该组由以下各项组成：苄氧 基羰基和苄基磺酰基；并且R₄选自下组，该组由以下各项组成：-OP³、 其中p是在1和2之间的整数 （含1和2），Y选自下组，该组由以下各项组成：-O-、-S-、-S(=O)-、-SO₂- 、亚甲基、-CH(OH)-、-CH(NHP²)-或-N(R₆)-，R₅选自下组，该组由以下各项 组成：-H或简单的(C₁-C₃)烷基并且R₆选自下组，该组由以下各项组成：-P²、简单的(C₁-C₃)烷基或简单的(C₁-C₃)酰基；每一个P²独立地是氨基保护基 团；并且P³是羧基保护基团。保护基团P¹的随后裂解给出了具有通式A的化 合物。脱保护步骤的顺序在[00034]段中讨论。

在本发明的另外的实施例中，本发明的化合物可以通过以下进行制 备：使用衍生自具有化学式B的酸的活化羧酸对具有结构的化 合物进行酰化，其中R₁选自由CH₂NHP¹和组成的组并且P¹是氨基保护 基团

其中n是在1和2之间的整数，含1和2；m是在0和2之间的整数，含 0和2；X选自由CH或N组成的组；R₂选自下组，如果X是CH则该组由以 下各项组成：-H、-OH和-NHP²，并且如果X是N则该组由以下各项组成：- P²或乙酰基；R₄选自下组，该组由以下各项组成：-OP⁴、其中p是在1和2之间的整数，含1和2，Y选自下 组，该组由以下各项组成：-O-、-S-、-S(=O)-、-SO₂-、亚甲基、-CH(OH)-、- CH(NHP²)-或-N(R₆)-，R₅选自下组，该组由以下各项组成：-H或简单的(C₁-C₃) 烷基并且R₆选自下组，该组由以下各项组成：-P²、简单的(C₁-C₃)烷基或简单 的(C₁-C₃)酰基；每一个P²独立地氨基保护基团；P³是氨基保护基团，其可以 在P¹、P²和P⁴存在下被裂解，并且P₄是羧基保护基团。氨基保护基团P³随 后被裂解并且在裂解氨基保护基团P¹和P²以及羧基保护基团P⁴之前，用苄基 磺酰基卤化物处理所产生的脱保护的氨基基团。脱保护步骤的顺序例如在 [00034]段中讨论。

在本发明的另外实施例中，本发明的化合物可以通过使用衍生自具 有化学式E的酸的活化羧酸对具有化学式D的胺进行酰化来制备

其中n是在1和2之间的整数，含1和2；m是在0和2之间的整数，含 0和2；X选自由CH或N组成的组；R₁选自由-CH₂NHP¹和组成的组并 且P¹是氨基保护基团；R₂选自下组，如果X是CH则该组由以下各项组成：- H、-OH和-NHP²，并且如果X是N则该组由以下各项组成：-P²或乙酰基； R₃选自由苄氧基羰基和苄基磺酰基组成的组；并且R₄选自下组，该组由以下 各项组成：-OP³、、其中p是在 1和2之间的整数（含1和2），Y选自下组，该组由以下各项组成：-O-、- S-、-S(=O)-、-SO₂-、亚甲基、-CH(OH)-、-CH(NHP²)-或-N(R₆)-，R₅选自下 组，该组由以下各项组成：-H或简单的(C₁-C₃)烷基并且R₆选自下组，该组由 以下各项组成：-P²、简单的(C₁-C₃)烷基或简单的(C₁-C₃)酰基；P²各自独立是 氨基保护基团；并且P³是羧基保护基团。

保护基团P¹、P²和P³的随后裂解给出了本发明的化合物。脱保护步骤的 顺序在[00034]段中讨论。

具有通式D的化合物可以进一步通过以下来获得：使用衍生自具 有结构（其中m是在0和2之间整数（含0和2），X选自由CH 或N组成的组，R₂选自下组，如果X是CH则该组由以下各项组成：-H、- OH和-NHP²并且如果X是N，则该组由以下各项组成：-P²或乙酰基，并且 P²和P⁴各自是氨基保护基团，藉此P⁴可以在P²存在下被选择性地移除）的 化合物的活化羧酸对具有结构（其中R₁选自由-CH₂NHP¹和 组成的组并且P¹是氨基保护基团）的化合物进行酰化；并且随后裂解 保护基团P⁴。

本发明的另外实施例中，本发明的化合物可以通过以下制备：使用 衍生自结构F的活化羧酸对具有通式的胺进行 酰化，其中p是在1和2之间整数，含1和2，Y选自下组，该组由以下各项 组成：-O-、-S-、-S(=O)-、-SO₂-、亚甲基、-CH(OH)-、-CH(NHP²)-或-N(R₆)- ，R₅选自由-H或简单的(C₁-C₃)烷基组成的组并且R₆选自下组，该组由以下各 项组成：-P²、简单的(C₁-C₃)烷基或简单的(C₁-C₃)酰基

其中n是在1和2之间的整数，含1和2；m是在0和2之间的整数，含 0和2；X选自由CH或N组成的组；R₁选自由-CH₂NHP¹和组成的组， 其中P₁是氨基保护基团；R₂选自下组，如果X是CH，则该组由以下各项组 成：-H、-OH和-NHP²并且如果X是N，则该组由以下各项组成：-P²或乙酰 基；R₃选自下组，该组由以下各项组成：苄氧基羰基和苄基磺酰基；并且P²各自独立是氨基保护基团。氨基保护基团P¹和P²的随后裂解给出了本发明的 化合物。脱保护步骤的顺序在[00034]段中讨论。

具有通式F的化合物可以通过在段落[00033]至[00042]中任一个所 描述的方法来制备，其中R₄是OP³并且P³是可以在所有其它保护基团存在下 被移除的羧基保护基团。P³的随后移除给出了具有通式F的化合物。

在段落[00033]至[00043]中描述的方法中所使用的、导致本发明的 化合物的关键中间产物本身是本发明的实施例。这包括具有通式A的化合物

其中n是在1和2之间的整数，含1和2；m是在0和2之间的整数，含 0和2；X选自由CH或N组成的组；R₂选自下组，如果X是CH则该组由以 下各项组成：-H、-OH和-NHP²，并且如果X是N则该组由以下各项组成：- P²或乙酰基；R₃选自下组，该组由以下各项组成：-P²、苄氧基羰基和苄基磺 酰基；并且R₄选自下组，该组由以下各项组成：-OP³、其中p是在1和2之间的整数，含1和2，Y选自下 组，该组由以下各项组成：-O-、-S-、-S(=O)-、-SO₂-、亚甲基、-CH(OH)-、- CH(NHP²)-或-N(R₆)-，R₅选自下组，该组由以下各项组成：-H或简单的(C₁-C₃) 烷基并且R₆选自下组，该组由以下各项组成：-P²、简单的(C₁-C₃)烷基或简单 的(C₁-C₃)酰基；P²各自独立是氨基保护基团；并且P³是羧基保护基团。

相似地，还包括具有通式C的化合物作为本发明的实施例

其中n是在1和2之间的整数，含1和2；m是在0和2之间的整数，含 0和2；X选自由CH或N组成的组；R₂选自下组，如果X是CH则该组由以 下各项组成：-H、-OH、-NHP²，并且如果X是N则该组由以下各项组成：- P²或乙酰基；R₄选自下组，该组由以下各项组成：-OP⁴、其中p是在1和2之间的整数（含1和2），Y选自 下组，该组由以下各项组成：-O-、-S-、-S(=O)-、-SO₂-、亚甲基、-CH(OH)- 、-CH(NHP²)-或-N(R₆)-，R₅选自下组，该组由以下各项组成：-H或简单的 (C₁-C₃)烷基并且R₆选自下组，该组由以下各项组成：-P²、简单的(C₁-C₃)烷基 或简单的(C₁-C₃)酰基；P²各自独立是氨基保护基团；P⁴是羧基保护基团；并 且P³是氨基保护基团，其可以在P²的存在下被裂解。

相似地，还包括具有通式F的化合物作为本发明的实施例

其中n是在1和2之间的整数，含1和2；m是在0和2之间的整数，含 0和2；X选自由CH或N组成的组；R₁选自由-CH₂NHP¹和组成的组， 其中P₁是氨基保护基团；R₂选自下组，如果X是CH，则该组由以下各项组 成：-H、-OH和-NHP²并且如果X是N，则该组由以下各项组成：-P²或乙酰 基；R₃选自下组，该组由以下各项组成：-P²、苄氧基羰基和苄基磺酰基；并 且P²各自独立是氨基保护基团。

相似地，还包括具有以下化学式G的化合物作为本发明的实施例

其中n是在1和2之间的整数，含1和2；m是在0和2之间的整数，含 0和2；X选自由CH或N组成的组；R₂选自下组，如果X是CH，则该组由 以下各项组成：-H、-OH和-NHP²并且如果X是N，则该组由以下各项组 成：-P²或乙酰基；R₃选自下组，该组由以下各项组成：-P²、苄氧基羰基和苄 基磺酰基；P¹是羧基保护基团；并且P²各自独立是氨基保护基团。

在本发明的化合物的制备中使用的中间产物的代表性实例被描述但 不限于在实例部分中的化合物。这些中间产物本身是本发明的化合物。

本发明还提供了用于在病人中治疗或预防心血管紊乱、血栓形成紊 乱或者血栓栓塞事件的方法，所述方法包括将有效量的至少一种具有化学式I 的化合物给药至需要其的病人。

本发明的化合物对于凝血级联的治疗调控是有用的。如在此使用 的，“治疗调控”包括指示需要抗凝作用的病情，以及先天止血活性的体内 稳定化和促进。具体地，所述化合物对于在病人中治疗或预防心血管紊乱、 血栓形成疾病或血栓栓塞事件是有用的。在这些病人中，需要在病人中建立 再灌注或延迟血液循环的再闭塞，这可以通过本发明的化合物的给药来进行 。需要此种治疗的病人包括正在经历外科手术的那些，具体地是器官移植和 心脏手术程序，以及那些正在罹受获得性或先天性止血扰乱的那些。

可以使用本发明组合物进行治疗的受试者包括但不限于，经历急性 冠状综合征、心房颤动、深静脉血栓形成和肺部栓塞、急性弥散性血管内凝 血以及肝素诱导的血小板减少（HIT）的病人，以及需要经皮冠状动脉介入治 疗、用于心脏手术的心肺分流、用于体外生命维持的体外膜式氧合回路、介 入性心脏病学（血管形成术和支架植入术）以及血液过滤的病人。

在其它优选实施例中，本发明的化合物可以被用于在病人中治疗或 预防凝血酶诱导的炎症，包括其中所述炎症是通过选自下组的疾病引发的情 况，该组由以下各项组成：成人呼吸窘迫综合征、感染性休克、败血症和再 灌注损伤；它们可以被用于在病人中抑制由结合凝块的凝血酶引发的血栓堆 积；它们可以被用于在病人中抑制血小板依赖性血栓形成；并且它们可以被 用于在病人中治疗或预防弥散性血管内凝血。

优选地，所述这个化合物或这些化合物是以如上描述的药用组合物 形式给药。本领域的普通技术人员将理解的是合适的剂量将会随着具体的化 合物、给药的途径、有待治疗的病情以及病人的止血状态而改变。总的来 讲，在1mg至500mg的范围的每日剂量将是有效的。有效剂量水平可以通 过剂量范围研究来确定，这是常规的并且很好地处在本领域的普通技术人员 能力之内。剂量可以是连续的（例如，通过静脉导管），或者单位剂量可以 按照维持有效体内浓度所需而每日一次或多次给药。优选地，在希望治疗调 控凝血级联期间对剂量进行调节以维持范围从0.01μg/ml至10μg/ml的平均 血液水平。

本发明进一步提供了在需要其的病人中双重抑制人类凝血酶和Xa 的方法，所述方法包括将有效量的一种或多种具有化学式I的化合物给药至 所述病人。有效剂量是如以上描述而确定。

本发明还提供了具有化学式I的化合物在以下方面的用途：制造用 于凝血级联的治疗调控、双重抑制人类凝血酶和Xa因子的药物。

在本发明的另一个实施例中，本发明的化合物可以被用在制造组合 物，所述组合物用于涂覆有待插入病人的侵入型装置的表面。在优选实施例 中，侵入型装置是血液接触侵入型装置。此类装置的实例是假肢、支架、分 流器、导管或局部药物递送装置。如在此使用的，侵入型装置可以是任何合 适的可以被移植入人类或兽类患者的医用装置。此类可移植的装置的实例包 括但不限于自身可扩张的支架、球囊可扩张的支架、支架型嫁接物、嫁接物 （例如，大动脉嫁接物）、人工心脏瓣膜、脑脊液分流器、起搏器电极、导 管、心内膜电极、吻合装置和连接器、整形外科移植物（例如螺丝）、脊髓 移植物以及电刺激装置。所述装置的基本结构可以是几乎任何设计。所述装 置可以由金属材料或合金制成，比如但是不限于，不锈钢、钛、钽、镍钛合 金、铂铱合金、金、镁、或其组合。由聚合物（包括可生物吸收或可生物稳 定的聚合物）制成的装置也可以与本发明的实施例伴随使用。

在优选实施例中，使用本发明化合物治疗的病人是人类。

以下的实例通过举例提出，并且旨在详细说明或解释本发明。本发 明的范围并不限于所展示的实例。

实例

实例1：双重凝血酶/Xa因子抑制剂的合成

分析方法

A.1.1分析型HPLC1：

A.1.2分析型HPLC2

A.1.3制备型HPLC：

A.1.4质谱

用Esquire HCT ESI-MS（布鲁克道尔顿公司（Bruker Daltonics））或安捷伦 公司的单四级杆ESI-MS记录质谱。

缩写

Ac  乙酰基

Amb(2-AMe[Boc]-5-Cl)  (2-氨甲基-4-氯苄基)-氨基甲酸叔丁酯

Amb(2-AMe[Boc]-5-Cl)  4-氯-1,2-苯二甲胺

Asp     天冬氨酸

Aze     氮杂环丁烷-2-羧酸

Bn      苄基

Boc     叔-丁氧羰基

Bzls    苄基磺酰基

CAS     化学文摘服务登记号

Cbz     苄氧基羰基

DCM     二氯甲烷

DIEA    二异丙基乙胺

DMF     N,N-二甲基甲酰胺

EDCxHCl 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐

EtOH    乙醇

Fmoc    芴甲氧羰基

Glu     谷氨酸

HBTU    O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基-脲鎓-六氟-磷酸盐

HOBt    羟基苯并三唑

HPLC    高效液相色谱

Hyp     4-羟基吡咯烷-2-羧酸

iPrOH   2-丙醇

mCPBA   3-氯过氧苯甲酸

Me      甲基

MeOH    甲醇

MS      质谱

NMM     N-甲基吗啉

Pro     脯氨酸

PyBop   苯并三唑-1-基-氧基吡咯烷基鏻六氟磷酸盐

Sat.    饱和的

tBu     叔-丁基

TEA     三乙胺

TFA     三氟乙酸

THF     四氢呋喃

TLC     薄层色谱

1.前体的合成：

1.1Boc-D-Glu(吗啉代)-OBn

在0℃向在干DMF（60mL）中的Boc-D-Glu-OBn（3.4g，10.0 mmol）和吗啉（0.9mL，10.0mmol）溶液添加HBTU（4.2g，11.0mmol） 和DIEA（4.3mL，25.0mmol）。将混合物在在0℃搅拌15分钟并且室温放 置2小时。将溶剂在真空中蒸发，将残余物溶解在乙酸乙酯中，并且连续地 用5%的水性KHSO₄、饱和水性NaHCO₃以及盐水洗涤。将有机层用Na₂SO₄干燥，并在真空中将溶剂蒸发。

产率：4.4g（＞100%，白色粉末）

HPLC：76.7%B HPLC1；MS计算值：406.5，发现值407.1(M+H)⁺

1.2H-D-Glu(吗啉代)-OBn x TFA

向化合物1.1（4.1g，10.0mmol）在DCM（10mL）中的溶液添加 TFA（10mL）。将混合物在室温下搅拌1.0小时。将溶剂在真空中蒸发以获 得粗制的标题化合物。

产率：4.0g（98%，油）

HPLC：44.7%B HPLC1；MS计算值：306.2，发现值307.0(M+H)⁺

1.3Bzls-D-Glu(吗啉代)-OBn

在0℃向化合物1.2（3.0g，7.1mmol）在DCM（50mL）中的溶 液添加Bzls-氯化物（2.0g，10.7mmol）和TEA（3.0mL，21.4mmol）并且 该混合物搅拌3小时。将溶剂在真空中蒸发，将残余物溶解在乙酸乙酯中， 用5%的水性KHSO₄、饱和水性NaHCO₃和盐水洗涤。将有机层用Na₂SO₄干 燥，并且在真空中浓缩至干燥以给出标题化合物。将溶剂在真空中蒸发，将 残余物溶解在乙酸乙酯中，用5%的水性KHSO₄、饱和水性NaHCO₃和盐水洗 涤。将有机层用Na₂SO₄干燥，并且在真空中浓缩至干燥以给出标题化合物。

产率：3.0g（92%，油）

HPLC：73.4%B HPLC1；MS计算值：460.5，发现值461.0(M+H)⁺

1.4Bzls-D-Glu(吗啉代)-OH

在室温下，向化合物1.3（3.0g，6.5mmol）在乙醇（30mL）中的 溶液中添加10%Pd/C（30mg）。将氮用氢取代并且混合物在室温下搅拌4 小时。将混合物用氮进行洗脱，通过硅藻土进行过滤并且将溶剂在真空中蒸 发以给出粗制的该标题化合物。

产率：2.3g（95%，固体）。

HPLC：64.3%B HPLC1；MS计算值：370.4，发现值370.9(M+H)⁺

1.5Bzls-D-Asp(1-Boc-哌嗪-4-基)-OBn

根据针对化合物1.1所描述的程序、使用1.24（0.62g，1.65 mmol），Boc-哌嗪和PyBop作为偶联剂来制备所述标题化合物。

产率：1.4g（88%，白色泡沫）

HPLC：77.0%B HPLC1；MS计算值：545.2，发现值544.0(M-H)^-

1.6Bzls-D-Asp(1-Boc-哌嗪-4-基)-OH

将在二噁烷（5ml）中的苄酯1.5（1.42g，2.6mmol）和水性的 1M LiOH（5mL）的混合物在室温下搅拌4小时。通过添加5mL1N HCl终 止反应，将溶剂在真空中蒸发，将残余物溶解在乙酸乙酯中并且连续地使用 水性5%KHSO₄和盐水洗脱。将有机层用Na₂SO₄干燥，并且将溶剂在真空中 蒸发以给出标题化合物。

产率：1.1g（90%，白色泡沫）

HPLC：63.9%B HPLC1；MS计算值：455.2，发现值453.9(M-H)^-

根据针对化合物1.1所描述的程序来制备表1中列出的化合物，并 且根据针对化合物1.2或1.4所描述的程序来完成中间产物的脱保护：

表1

根据针对化合物1.3所描述的程序来制备表2中列出的化合物，并 且根据针对化合物1.2、1.4或1.6所描述的程序来完成中间产物的脱保护：

表2

1.21Bzls-D-Glu(OtBu)-OH

向H-D-Glu(OtBu)-OH x H₂O（1.0g，4.5mmol），水性的1M  NaOH（4.5mL，4.5mmol），二噁烷（30mL）和水（15mL）的混合物经 24h分30个部分Bzls-氯化物溶液（4.9g，25.8mmol）。通过添加水性的1 MNaOH将pH保持在8-9之间。持续搅拌直至通过TLC检测不到起始材料。 将溶剂在真空中蒸发，并且将残余物在乙酸乙酯和水性的5%KHSO₄之间进 行分配。将有机层用水性的5%KHSO₄和盐水进行洗涤，用Na₂SO₄进行干 燥，并且在真空中进行蒸发以给出标题化合物。

产率：1.6g（100%，白色固体）。

HPLC：66.5%B HPLC1；MS计算值：357.1，发现值355.8(M-H)^-

根据针对化合物1.21所描述的程序来制备表3中列出的化合物。

表3

1.25Boc-D-Asp-L-Pro-OtBu

向Boc-D-Asp(OBn)-OH（2.0g，6.2mmol），L-Pro-OtBu（1.3g， 6.2mmol）和HOBt（125mg，0.9mmol）在EtOH（15mL）中的混合物添 加DIEA（2.4mL，13.6mmol）。将混合物搅拌至完全溶解并且在冰浴中冷 却。添加EDC x HCl（1.4g，7.4mmol）并且将混合物在室温下搅拌6小时。 将混合物在真空下浓缩，吸收进100mL乙酸乙酯和50mL5%的NaH₂PO₄中 。将有机层进行收集，用50mL5%NaH₂PO₄和2x50mL饱和NaHCO₃进行 洗涤，用Na₂SO₄进行干燥并在真空中进行浓缩。通过SiO₂色谱进行纯化 （1%TEA在DCM中）后，根据针对化合物1.4所描述的程序使用MeOH作 为溶剂来完成所产生的中间产物的脱保护以给出标题化合物。

产率：1.82g（72%，白色泡沫）

HPLC：93.3%B HPLC2；MS计算值：386.2，发现值385.0(M-H)^-

1.26H-D-Asp(4-氨基-吡啶)-L-Pro-OH

向化合物1.25（908mg，2.4mmol）在THF（40mL）中的溶液添 加TEA（360μl，2.6mmol）。在-10℃（冰浴温度）逐滴添加氯甲酸异丁酯 （307μl，2.4mmol）。将混合物在-10℃搅拌1小时。将4-氨基吡啶（221 mg，2.4mmol）一次性添加。将混合物放置至本身回至室温并且总共搅拌6 小时。将挥发物在真空中移除。将混合物在100mL乙酸乙酯中溶解，随后添 加50mL的饱和NaHCO₃。使用Na₂CO₃调整pH值至9。将有机层进行分 离，并且将水层使用3x50mL的4:1的CHCl₃：iPrOH进行萃取。将合并的 有机物用Na₂SO₄干燥，通过1:1的SiO₂:硅藻土衬垫进行过滤并且在真空中 进行浓缩。根据针对化合物1.2所描述的程序对所得到的中间产物进行脱保护 以给出标题化合物，所述标题化合物在下一步骤中直接使用。

产率：不适用（使用的粗制物，浆料）。

HPLC：34.6%B HPLC2；MS计算值：306.1，发现值307.0(M+H)⁺

1.27Bzls-D-Asp(4-氨基-吡啶)-L-Pro-OH

根据针对化合物1.21所描述的程序使用未处理的粗制中间产物 1.26来制备化合物1.27。产生的粗制中间产物在下一步骤中直接使用。

产率：不适用的（使用的粗制物，胶）。

HPLC：37.4%B HPLC2；MS计算值：460.1，发现值461.2(M+H)⁺

根据针对化合物1.1所描述的程序来制备表4中列出的化合物，并 且根据针对化合物1.2、1.4或1.6所描述的程序来完成中间产物的脱保护：

表4

1.64Bzls-D-Asp(N-[1-Ac-哌啶-4-基]-N-[甲基]酰胺)-L-Pro-OMe

将针对1.44的甲酯前体根据1.2进行脱保护。向所得到结果中间产 物（470mg，0.8mmol）在DCM（50mL）中的溶液添加TEA（0.6mL，4.5 mmol）和乙酸酐（181mg，1.7mmol）。将混合物在室温下搅拌3.0小时。 将溶剂在真空中蒸发，将残余物溶解在乙酸乙酯中，并且连续地用5%的水性 KHSO₄、饱和水性NaHCO₃和盐水洗涤。将有机层用Na₂SO₄干燥，并且将溶 剂在真空中蒸发以给出标题化合物。

产率：413mg（100%，油）

HPLC：51.7%B HPLC1；MS计算值：536.2，发现值537.2(M+H)⁺

1.65Bzls-D-Asp(N-（1-Ac-哌啶-4-基)-N-氨甲基)-L-Pro-OH

根据针对化合物1.6所描述的程序，将化合物1.64（780mg，1.5 mmol）转变为标题化合物。

产率：135mg（18%，油）

HPLC：51.7%B HPLC1；MS计算值：522.2，发现值523.2(M+H)⁺

根据针对化合物1.64所描述的程序来制备表5中列出的化合物，并 且接下来根据针对化合物1.6所描述的程序来进行脱保护：

表5

1.68Bzls-D-Asp(硫代吗啉代)-L-Pro-OtBu

根据针对化合物1.1所描述的程序使用PyBop作为偶联剂将化合物 1.59（442mg，1.0mmol）和硫代吗啉偶联，并且根据针对化合物1.2所描述 的程序将所得到的中间产物转变为标题化合物。

产率：465mg（99%，油）

HPLC：58.4%B HPLC1；MS计算值：469.1，发现值467.9(M-H)^-

1.69Bzls-D-Asp(1-氧桥-硫代吗啉-4-基)-L-Pro-OtBu

在0℃向针对1.68（205mg，0.4mmol）的叔丁酯前体在乙醇（5 mL）中的溶液添加NaIO₄（111mg，0.5mmol）。将混合物在0℃搅拌1小 时，然后在室温下搅拌过夜。将混合物在150mL乙酸乙酯和80mL的水中溶 解。将有机层进行分离并且用3x50ml水以及2x50mL饱和盐水进行洗 涤，用Na₂SO₄进行干燥，并且在真空中进行蒸发。根据针对化合物1.2所描 述的程序，将所得到的中间产物转变为标题化合物。

产率：150mg（77%，油）

HPLC：50.4%B HPLC1；MS计算值：485.1，发现值483.9(M-H)^-

1.70Bzls-D-Asp(1,1-二氧桥-硫代吗啉-4-基)-L-Pro-OtBu

在室温下向针对1.68的叔丁酯前体在DCM（5mL）中的溶液添加 75%mCPBA（191mg，0.8mmol）并将混合物搅拌4天。将混合物在50 mL DCM和50mL的水中溶解。将有机层进行分离并用2x50ml NaHSO₃、3 x50mL饱和NaHCO₃以及2x50mL盐水进行洗涤，用Na₂SO₄进行干燥，并 且在真空中进行蒸发。根据针对化合物1.2所描述的程序，将所得到中间产物 转变为标题化合物。产率：52mg（26%，固体）

HPLC：57.1%B HPLC1；MS计算值：501.1，发现值499.9(M-H)^-

2.抑制剂的合成

2.1Bzls-D-Glu(吗啉代)-L-Pro-Amb(2-AMe-5-Cl)x1TFA

根据针对化合物1.1所描述的程序将化合物1.28（193mg，0,41 mmol）与(2-氨甲基-4-氯苄基)-氨基甲酸叔丁酯（CAS439116-15-1）偶联。将 所得到的中间产物根据针对化合物1.2所描述的程序进行脱保护并且通过制备 型反相HPLC进行纯化以给出标题化合物。

产率：170mg（56%，白色固体）

HPLC：52.2%B HPLC1；MS计算值：619.2，发现值620.3(M+H)⁺

根据针对化合物2.1所描述的程序来制备表6中列出的化合物：

表6

2.47Bzls-D-Asp((四氢-2H-吡喃-4-基)-N-甲基甲胺)-L-Pro-Amb(2-AMe-5-Cl) x2TFA

根据针对化合物1.1所描述的程序将化合物1.47（256mg，0.52 mmol）与(2-氨甲基-4-氯苄基)-氨基甲酸叔丁酯（CAS439116-15-1）偶联。将 所得到的中间产物（0.49mmol）溶解在6mL的4M HCl中（在二噁烷中） 并且在室温下搅拌17小时。然后将混合物在真空中进行浓缩并且通过制备型 反相HPLC进行纯化以给出标题化合物。

产率：223mg（57%，白色固体）

HPLC：78.0%B HPLC2；MS计算值：647.2，发现值648.1(M+H)⁺

2.48Bzls-D-Asp(1-氧桥-4-氨基-吡啶)-L-Pro-Amb(2-AMe-5-Cl)

在室温下向针对2.34（121mg，0.17mmol）的受Boc保护的前体 在DCM（10mL）中的溶液添加75%mCPBA（44mg，0.19mmol）并将混合 物搅拌4天。每4小时将另外的75%mCPBA（165mg，0.72mmol）分3部 分进行添加。将混合物在50mL DCM和50mL的水中溶解。将有机层进行分 离并用2x50ml NaHSO₃、3x50mL饱和NaHCO₃以及2x盐水进行洗涤，用 Na₂SO₄进行干燥，并且在真空中进行蒸发。将所得到的中间产物根据针对化 合物1.2所描述的程序进行脱保护并且通过制备型反相HPLC进行纯化以给出 标题化合物。

产率：2mg（2%，白色固体）

HPLC：67.9%B HPLC2；MS计算值：628.2，发现值629.2(M+H)⁺

2.49H-D-Glu(吗啉代)-L-Pro-Amb(2-AMe-5-Cl)x2TFA

将2mL的HBr/HOAc（32%）添加至化合物2.33（81mg，0.1 mmol）。将混合物在室温下搅拌4小时。将溶剂在真空中蒸发并且该残余固 体在2mL MeOH中溶解。添加50mL的乙醚并且收集沉淀物。将粗制产物通 过制备型反相HPLC进行纯化以给出标题化合物。

产率：33mg（42%，白色固体）

HPLC：35.3%B HPLC1；MS计算值：465.2，发现值466.1(M+H)⁺

2.50Bzls-D-Asp(哌嗪基)-L-Pro-Amb(2-AMe-5-Cl)x2TFA

根据针对化合物1.1所描述的程序将化合物1.15（126mg，0.22 mmol）与[[2-[[[(2S)-2-氮杂环丁烷基-羰基]氨基]甲基]-4-氯苯基]甲基]-氨基甲 酸-1,1-二甲基乙酯（CAS：439118-00-0）偶联。向所得到的中间产物在 干DMF（2mL）中的溶液添加哌啶（0.2mL）并且将混合物在室温下搅拌 3.5小时。将溶剂在真空中蒸发并且残余物在2.0mL DCM中溶解。添加TFA （2.0mL）并且将混合物在室温下搅拌1小时。将溶剂在真空中蒸发并且粗 制产物通过制备型反相HPLC进行纯化以给出标题产物。

产率：34mg（19%，白色固体）

HPLC：56.5%B HPLC2；MS计算值：590.2，发现值589.0(M-H)^-

实例2：人类IIa因子（h FIIa）和人类Xa因子（h FXa）的抑制常数的确定

以类似于先前披露的方法（Stürzebecher等人，J.Med.Chem.（《医 药化学杂志》），40，3091-3099（1997）），对针对单独的纯化酶的抑制效 果进行了确定。在以下混合物中在25℃进行反应来确定人类IIa因子和人类 Xa因子的抑制：

200μL的TBS（0.05M三羟甲基氨基甲烷；0.154M NaCI，2%乙醇， pH8.0）

25μL的底物（针对IIa因子的2mM，1mM和0.5mM的Mes-d-Cha- Gly-Arg-pNA（Pefachrome tPA来自DSM营养产品公司（DSM nutritional  products），Pentapharm部门）以及针对Xa因子的MeOCO-d-Cha-Gly-Arg- pNA（Pefachrome FXa来自DSM营养产品公司，Pentapharm部门），溶解在 水中）

测试化合物在水中的2μL的溶液

50μL的所述酶的溶液（来自酶研究实验室公司（Enzyme Research  Laboratories）的在0.05至0.1NIH U/mL在0.154M NaCl+0.1%BSA m/v中 的人类α凝血酶；来自酶研究实验室公司的在2.5至5mIU/mL在0.154M  NaCl+0.1%BSA m/v中的人类Xa因子）

通过在405nm的吸光度的改变来确定对硝基苯胺的释放（p-NA， 蛋白质水解活性的显色产物）。通过使用GraFit（来自Erithacus公司的第4 版）按照竞争性抑制速率方程式进行参数拟合将平衡速率用以计算抑制剂/酶 解离常数（K_i值）。将这些结果报道为表7中的K_i值（纳摩尔）并且这些结 果是至少三个测定的平均。

这些数据清楚地显示了本发明的化合物是非常有效力的凝血酶和 Xa因子两者的抑制剂。解离常数在纳摩尔范围，并且总的来讲低于50nM。

实例3：参考酶的抑制常数的确定

人类活化蛋白质C（h aPC）：人类aPC的抑制是通过在实例2中 描述的方法确定的，使用2.2nM的来自酶研究实验室公司的人类活化蛋白质 C以及2mM、1mM和0.5mM的H-D-Lys(Cbo)-Pro-Arg-pNA（Pefachrome  Pca来自DSM营养产品公司，Pentapharm部门）作为底物；结果报道为表7 中的Ki值（纳摩尔）。

人类脲激肽释放酶（h uKK）：人类uKK的抑制是通过在实例2中 描述的方法确定的，使用7.5nM的来自Lee Biosolutions公司的人类脲激肽释 放酶以及1mM、0.5mM和0.25mM的H-D-Val-Leu-Arg-pNA（S-2266来自 Chromogenix公司）作为底物；结果报道为表7中的Ki值（纳摩尔）。

人类补体成分1（h C1s）的亚成分“s”：人类C1s的抑制是通过 在实例2中描述的方法确定的，使用29nM的来自Calbiochem公司的天然人 类活化C1s补体成分以及8mM、6mM和4mM的H-D-Val-Ser-Arg-pNA（S- 2314来自Chromogenix公司）作为底物；结果报道为表7中的Ki值（纳摩 尔）。

人类补体成分1（h C1r）的亚成分“r”：人类C1r的抑制是通过在 实例2中描述的方法确定的，使用100nM的来自Calbiochem公司的天然人 类活化C1r补体成分以及16mM、12mM和8mM的Val-Ser-Arg-pNA（S- 2314来自Chromogenix公司）作为底物；结果报道为表7中的Ki值（纳摩 尔）。

人类尿激酶型纤溶酶原激活剂（h u-PA）：人类uPA的抑制是通过 在实例2中描述的方法确定的，使用100单位/ml的来自MEDAC GmbH公司 的u-pa“尿激酶HS medac以及2mM、1mM和0.5mM的H-Glu-Gly-Arg- pNA（L-1455来自Bachem公司）作为底物；结果报道为表7中的Ki值（纳 摩尔）。

人类组织型纤溶酶原激活剂（h t-PA）：人类t-PA的抑制是通过在 实例2中描述的方法确定的，使用200U/mL的来自Boehringer Ingelheim公司 的重组人类组织型纤溶酶原激活剂以及4mM、2mM和1mM 的Mes-d-Cha-Gly-Arg-pNA（Pefachrome tPA来自DSM营养产品公司， Pentapharm部门）作为底物；结果报道为表7中的Ki值（纳摩尔）。

人类纤溶酶（h纤溶酶）：人类纤溶酶的抑制是通过在实例2中描 述的方法确定的，使用1.7mU/mL的来自Calbiochem公司的活化人类纤溶酶 以及4mM、2mM和1mM的甲苯磺酰基-Gly-Pro-Lys-pNA（Chromozym PL 来自罗氏应用科学公司（Roche AppliedScience））作为底物；结果报道为表 7中的Ki值（纳摩尔）。

人类血浆激肽释放酶（h PK）：人类PK的抑制是通过在实例2中 描述的方法确定的，使用62ng/mL来自酶研究实验室公司的活化人类血浆激 肽释放酶以及3mM、1.5mM和1mM的H-D-Pro-Phe-Arg-pNA（S2302来自 Chromogenix公司）作为底物；结果报道为表7中的Ki值（纳摩尔）。

如描述于段[0101]中地计算解离常数。本发明示例性化合物的结果 在表7中显示。

在表7中的这些数据显示本发明的化合物对于凝血酶和Xa因子的 解离常数比对于在凝结级联中涉及的其它参考蛋白酶的那些解离常数至少低 一个数量级。事实上，对凝血酶和Xa因子的抑制活性比任何其它比较蛋白酶 通常大100倍，并且在一些例子中，例如化合物2.1、2.6、2.8、2.13、2.24、 2.36、2.41和2.45，对凝血酶和Xa因子的抑制活性比任何其它比较蛋白酶至 少大1000倍。

表7

示例性化合物对凝血酶、Xa因子和关键参考蛋白酶的解离常数（K_i）。

应当理解的是在此描述的实例以及实施例仅是为了说明性的目的， 并且根据它们的不同修改或变更对于本领域的普通技术人员将是建议性的并 且将会包含在本申请以及随附的权利要求的范围的精神和权限之内。

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