双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH和用途

摘要

本发明公开了一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH和用途，以解决现有猪瘟病毒抗原诊断试剂研发过程中存在的无法获得高纯度、高亲和力的抗猪瘟病毒抗体的生产和制备的问题。一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH，所述的抗体具有核苷酸序列：SEQIDNO.1，SEQIDNO.2或SEQIDNO.3。所述的双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH在制备检测猪瘟病毒抗原诊断试剂中的应用。本发明的发明特点是首次获得利用双峰驼筛选获得抗猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株抗原蛋白E2的VHH抗体编码序列；ELISA实验结果表明，

说明书

技术领域

本发明属于疫苗领域，具体涉及一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH。

背景技术

   猪瘟又称猪霍或者古典猪瘟(Classical swine fever,CSF)，其病原是猪瘟病毒(CSF virus,CSFV)。猪瘟是猪的重要传染病之一，其病理特征是小血管壁变性，导致内脏器官多发性出血、坏死和梗死。我国是养猪大国，预防接种猪瘟兔化弱毒疫苗(C-strain)是防控猪瘟的最有效方式，尽管如此，猪瘟仍是养猪业危害最为严重的传染病之一，在我国预防和控制猪瘟的发生，具有重要的经济意义和社会意义。在CSFV感染的或者C-strain疫苗免疫后的猪体内，特异性抗病毒中和抗体是机体最主要的抗病毒免疫反应，CSFV基因组编码地E2蛋白是机体产生抗猪瘟病毒血清抗体的最主要抗原蛋白，是研制基因工程疫苗和抗原、抗体诊断方法的最重要的候选蛋白。

1993年，Hamers等首先发现在骆驼和鲨鱼等血清中存在一种天然缺失轻链，仅有重链的IgG2和IgG3型的抗体，其抗原结合位点仅由重链可变区单结构域组成，故也称为单域重链抗体（variable domain of the heavy chain of HCAbs，VHH）。大量研究证实，缺失了轻链和 CH1恒定区VHH抗体仍保持同普通IgG抗体相同的生物学功能，并且表现出普通IgG抗体和单克隆不具备的新的生物学功能。VHH抗体拥有更长的抗原互补结合区（CDR3）氨基酸序列，不仅可与抗原表面的抗原表位结合，还能够深入具有裂缝凹陷结构的抗原内部，如酶的活性位点，病毒与宿主细胞结合位点等；因其是分子量小（单克隆抗体的1/10），所以组织穿透性能力强于常规IgG抗体，研究发现其甚至可以跨过血脑屏障，到达普通IgG抗体分子无法接触的位置，充分发挥VHH抗体的生物学功能；VHH抗体FR2 区存在一些不同于常规IgG抗体的亲水性氨基酸，使得 VHH 抗体在水溶液中具有良好的稳定性，可以实现抗体规模化生产和纯化，获得水溶性好、稳定性强、生物活性和抗体结构更加接近天然抗体的高纯度重组抗体；VHH与抗原结合的亲和力达到纳摩尔级，与单链抗体亲和力相当，该抗体作为一种小型化的基因工程抗体在病原学研究，高敏感性抗原诊断方法领域有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH，以解决现有猪瘟病毒抗原诊断试剂研发过程中存在的无法获得高纯度、高亲和力的抗猪瘟病毒抗体的生产和制备的问题。

本发明的另一个目的是提供一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH的用途。

本发明技术方案如下：一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH，其特征在于所述的抗体具有核苷酸序列：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。

进一步的，本发明提供一种重组表达载体，含有所述的核苷酸序列。

进一步的，本发明提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞为含有所述的核苷酸序列的原核细胞。所述的宿主细胞为含有所述的表达载体的原核细胞。

进一步的，本发明提供一种双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH在制备检测猪瘟病毒抗原诊断试剂中的应用。

本发明的发明特点是首次获得利用双峰驼筛选获得抗猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株抗原蛋白E2的VHH抗体编码序列；ELISA实验结果表明，E.coli中表达的重组VHH抗体与猪瘟病毒多克隆抗血清具有相同的抗原结合能力，可代替猪瘟病毒多克隆抗体用于猪瘟病毒抗原诊断试剂的研究中。

附图说明

图1为VHH抗体氨基酸特征分析图；

图2为SDS-PAGE分析抗CSFV E2 VHH抗体在E.coli中的表达图；

图2中 1：VHH-E2-1 包涵体，2：VHH-E2-1 上清；3：VHH-E2-2 包涵体，4：VHH-E2-2 上清；5 VHH-E2-3 包涵体；M： 蛋白质标准分子量（由上而下

分子量依次为：75, 65, 40, 35, 14 kDa）；6：VHH-E2-3 上清；7和8：空载体对照；9：未加IPTG对照组；图中箭头指示的是目的条带；

图3为 Western blotting分析VHH-E2蛋白图。

具体实施方式

下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

一、双峰驼免疫、外周血淋巴细胞分离和cDNA合成

1.材料和方法

1.1材料—试验动物、抗原、佐剂

选择两峰年龄在1岁左右的雌性幼双峰驼作为免疫受体动物（这些双峰驼常年散养在甘肃金昌市附近的戈壁滩上，主要是剪驼毛销售。畜主仅在冬季草枯、夏季极度干旱和母驼产羔时召回补充饲草、水和盐，从未接种过任何疫苗，是制备VHH抗体的合适受体动物。），佐剂用206佐剂，抗原为E2-GST抗原。

猪瘟兔化弱毒疫苗株（CSFV）E2抗原制备采用现有方法：利用亲和层析方法纯化可溶性E2融合蛋白（GST-tag）作为免疫双峰驼的抗原，筛选特异性重链单域抗体（VHH）的E2抗原。利用SDS-PAGE电泳确定蛋白纯度，通过紫外吸收法定量。

1.2方法

用206佐剂和E2-GST抗原等体积充分混匀乳化完全，分别在双峰驼的颈部、双后肢和背部皮下多点注射，首次免疫剂量为300μg/次（2mL），第14天、第21天、第35天、第49天和第54天加强免疫，免疫剂量为200μg/次（2mL）。每次免疫前采集静脉血，分离血清，用间接ELISA试验测定血清抗体滴度。双峰驼用E2抗原免疫后，体内抗E2蛋白特异性抗体滴度随着免疫时间延长而逐渐上升，第4次（35天时）免疫后，抗体水平达到最高水平，第5次免疫后抗体滴度无显著提高，根据血清抗体消长特点，第6次免疫后5天采集颈静脉外周血。

分别采集两峰实验动物外周静脉血各200mL混匀作为样品，然后用3.8%枸橼酸钠作为抗凝剂与样品按1:9的体积比混合，加入淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞（PBMC），共收集与2×10⁹个淋巴细胞，淋巴细胞按照1×10⁸个/管分装，保存在液氮中。用Trizol 试剂提取细胞总RNA，反转录合成第一链cDNA，以其作为模板采用扩增VHH的引物（见表1—表达抗E2的VHH抗体序列的引物），进行3轮PCR扩增得到大小约450bp的特异性VHH片段用于构建噬菌体展示文库。

二、 猪瘟VHH免疫文库的构建

1.制备VHH噬菌体抗体初级库

取6μg菌纯化的VHH抗体片段和28μg的噬菌体载体pHEN4分别用限制性内切酶PstIand 内切酶NotI消化后，在22℃温度下，用T₄ DNA连接酶过夜连接，在65℃温度下对酶进行灭活，灭活10min后，用冰浴冷却，连接产物利用Biorad电转仪电转化到大肠杆菌（E.coli）TG1超级感受态细胞，转化后菌液在37^oC温度下，以160rpm/min的转速震荡培养1小时，恢复抗性，浓缩后涂布在2×YT培养板上（培养板上的培养液为浓度2%的葡萄糖100μg 、100μg/ml 氨苄青霉素），同时取浓缩后的菌液10μL后的菌液稀释至10⁴个菌落，然后涂板，在37℃温度下过夜培养，经过三次大量连接和转化，得到库容为1.29×10⁸的骆驼免疫单域抗体库。将培养板上的单克隆菌落用LB液体培养基洗下来，在其中加入浓度为10%甘油，分装后保存在-80 ^oC冰箱中，制备成为VHH噬菌体抗体初级库。

2.建立VHH免疫抗体库

在VHH噬菌体抗体初级库中加入辅助噬菌体M13K07拯救文库，经3批次拯救后获得噬菌体抗体库滴度分别达到1.2×10⁸，4.0×10⁸，8.0×10⁸库容量(表2—三次拯救后VHH免疫抗体库库容量和多样性表)，测序引物为：L1 :5'-TggAATTgTgAgCggATAACAATT-3'；S6 :5'-gTAAATgAATTTTCTgTATgAgg-3'。

对每一批次测序结果表明，得到序列利用DNAstar比较后均为单一序列，BLAST比较分析确定3批中选择测定的特异性克隆均为来源于骆驼属的重链抗体VHH序列，说明构建免疫抗体库多样性较好。

三、特异性抗E2的VHH抗体筛选

（一） 采用3轮亲和淘洗技术筛选免疫抗体库中与E2特异性结合的VHH抗体，基本技术路线如下：

1.包被：将靶分子按猪瘟病毒E2抗原:碳酸盐包被缓冲液=1:4稀释混合均匀，50ul/孔，4度包被过夜，1×PBS洗3次；

2.封闭: PBS洗3次，用2% M-PBS，300 ul/孔，37℃ 1h； 

3.结合噬菌体：PBS洗3次，取5ul phage+45ul 1.0% M-PBS混匀50ul/孔，37℃条件下静置1.0 h；

4.一抗：0.1%PBST洗3次，用1.0% M-PBS按1：3000稀释Rabbit anti-M13 pAb 50ul/，37℃静置1.0h；

5.二抗：0.1%PBST洗3次，用1.0% M-PBS按1：3000稀释HRP-goat anti-rabbit IgG pAb  50ul/孔，37℃静置1.0h；

6.显色：0.1%PBST洗4次，取0.2M/l Na₂HPO4 + 0.1M/L 柠檬酸各4.5ml 加入少量 OPD，60ul H₂O₂混匀50ul/孔，2M硫酸终止25ul/孔，OD₄₉₀nm 检测。

   三轮淘洗具体结果见表3。

（二）筛选

1.第一次筛选：直接包被E2抗原多克隆ELISA筛选特异性克隆，基本技术路线如下：

1.1包被：将CSFVE2用pH 9.6碳酸盐包被液稀释至15 ug/ml，4℃ 过夜；

1.2封闭：加入2% MPBS，100 uL/孔，37℃温育 1.0h；

1.3结合：噬菌体用终浓度0.5% MPBS按10倍稀释，其余加0.5% MPBS，37 ℃温度育1.0 h；

1.4一抗：兔抗M13；

1.5二抗：HRP-羊抗兔；

1.6显色：OPD显色，结果见表4—直接包被E2抗原多克隆ELISA。

2.第二次筛选：直接包被E2抗原多克隆ELISA筛选特异性克隆，基本技术路线如下：

 1.1包被：将CSFV E2用pH 9.6包被液稀释至10 ug/ml，4 ℃ 过夜；

1.2封闭：2% MPBS，37℃ 1.0h；

1.3结合：噬菌体用终浓度0.5% MPBS按10倍稀释，其余孔加0.5% MPBS，37℃ 1.0h；

1.4一抗：兔抗M13；

1.5二抗：HRP-羊抗兔，显色。

筛选结果见表5—直接包被E2抗原多克隆筛选单克隆phage ELISA，其中单克隆第17,19和24阴阳性差异最显著，再次进行第三轮单克隆ELISA筛选E2特异性VHH抗体。

第三次筛选：直接包被E2抗原多克隆ELISA筛选特异性克隆，基本技术路线如下：

1.1包被：将CSFV E2用pH9.6包被液稀释至10 ug/ml，4℃温度下过夜；

1.2.封闭：2% MPBS，37℃ 1.0h；

1.3结合：噬菌体用终浓度0.5% MPBS按10倍稀释，其余孔加0.5% MPBS，37 ℃ 1.0 h；

1.4一抗：兔抗M13；

1.5二抗：HRP-羊抗兔；

1.6显色。

第三轮筛选结果见表6—直接包被E2抗原多克隆筛选单克隆phage ELISA，其中单克隆第3，9，17，19和24阴阳性差异最显著，其中17,19和24在第三轮筛选后依然表现出与E2抗原具有稳定和特异性的结合，说明在经过3轮筛选、和高洗脱强度条件下依然能够从免疫库中获得特异性的E2 VHH抗体。

四、VHH单克隆菌落测序比对

将3，9，17，19和24共5个克隆进行核苷酸测序和序列分析，结果发现3和9，17和24是重复序列，定义为相同的克隆；19为单独克隆，结果见表7—特异性VHH DNA序列测序和分析，测得的序列见序列表。

五、 VHH 序列特征分析

从图 1看：Val37Phe, Gly44Glu, Leu45Arg, and Gly47Trp等氨基酸是组成重链VHH抗体的标志性特征，说明筛选获得的3个VHH克隆是来自双峰驼的重链抗体。比较发现，同E2抗原特异性结合的3个不同的VHH序列的CDR3之间的高变区氨基酸差异显著，VHH-E2-1的CDR3长度有18个氨基酸，其余两个克隆CDR3区由20氨基酸组成，说明3个VHH抗体是来自与E2抗原的3个不同抗原表位，是独立的3个抗体序列。通过对不同种属CDR3区氨基酸长度分析发现，重链VHH抗体CDR3区比普通IgG抗体CDR3区氨长，VHH抗体的这一特征是缺失轻链的重链抗体功能性补偿行进化的结果，虽然骆驼VHH抗体缺失轻链，但是通过自然进化后延长了CDR3区，因此，VHH抗体仍然同普通IgG抗体具有完美的抗原结合能力。

六、VHH抗体在E.coli中表达、纯化和Western blotting

将3个VHH片段分别克隆到表达载体p-SMK（80μg/ml，卡那霉素, Kan^r）上，阳性重组资料转化到EcoliBL21-CodonPlus (DE3)（34μg/ml, 氯霉素，Cm^r）受态细胞中，挑取单克隆致5 ml LB液体培养基中，37 ℃，220rpm过夜培养。次日按照2%比例接种到新配置的100ml LB培养基，培养OD₆₀₀值到0.6，加入终浓度0.1mM的IPTG诱导，20℃，220rpm 诱导20h，离心收菌，SDS-PAGE分析大小约39 kDa的目标条带（图2），图2中1：VHH-E2-1 包涵体，2：VHH-E2-1 上清；3：VHH-E2-2 包涵体，4：VHH-E2-2 上清；5 VHH-E2-3 包涵体；M： 蛋白质标准分子量（由上而下分子量依次为： 75, 65, 40, 35, 14 kDa）；6：VHH-E2-3 上清；7和8：空载体对照；9：未加IPTG对照组。

Western blotting实验得到特异性条带（图3），图3中1：VHH-E2-1；2：VHH-E2-2；3：VHH-E2-3。超声波裂解诱导的菌体，分析表明VHH蛋白以可溶形式表达，用亲和层析纯化VHH重组蛋白。

七、双抗体夹心ELISA测定VHH与重组E2蛋白和CSFV C-strain结合能力实验

三种VHH（15.5 μg/ml，100μl/孔）分别作为捕获抗体直接包被96孔酶标板，兔抗猪瘟多克隆高免血清(1：3000稀释)作为阳性对照，纯化E2重组蛋白（E2-GST标签和浓缩C-strain细胞毒作为中间抗原，正常骆驼和兔子血清作为阴性对照，猪抗CSFV高免血清作为第二抗体，TMB作为底物，测定吸光度OD450，结果见表8—双抗体夹心检测VHH与E2重组蛋白和CSFV C-strain结合能力实验（OD450）。

表8实验结果表明，VHH可以与重组E2抗原和C-strain全病毒抗原特异性结合。OD₄₅₀值比较发现，VHH抗体略低于兔抗CSFV高免血清，可能是由于VHH抗体仅由1个单一的抗CSFV E2的抗原结合表位构成，而CSFV高免血清中不但含有抗E2抗原的抗体，还包含有抗E0蛋白的抗体，因此同样条件下多克隆抗血清结合猪瘟病毒抗原的数量会多于VHH抗体。

八、猪瘟病毒抗原双抗体夹心ELISA的研制

1．VHH抗体包被：用0.05 M碳酸盐包被缓冲(pH 9.6)液将混合后的3株VHH抗体稀释至含量为15.5 μg/ml。在酶标板反应孔中加100μl/孔，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用1×PBST洗涤缓冲液，200μl/孔，洗板4 次。加入200μl/孔封闭液（1×PBST，5%脱脂奶粉）37℃封闭1小时，用1×PBST洗涤缓冲液，200μl/孔，洗板4 次。

2. 加入抗原：所有样品做两孔（见表9—猪瘟病毒抗原双抗体夹心ELISA方法操作示意），用1×PBS 将待检样品做1:2稀释，100μl/孔于上述已包被的反应孔中，同时加入空白对照（样品稀释液），阴性对照孔（健康猪组织悬液）及阳性对照（猪瘟弱毒细胞培养物，750兔体反应/mL），放置于湿盒中，37℃作用2小时，用1×PBST洗涤缓冲液，200μl/孔，洗板4 次。

3．加入多克隆抗体：将兔抗猪瘟病毒抗体稀释至1:3000后，加入各反应孔中，100μl/孔，37℃作用1小时，重复洗板步骤。

4. 兔抗猪酶标抗体：将辣根过氧化物酶标记兔抗猪酶标抗体做1:100稀释，100μl/孔加入各反应孔中，37℃作用1小时，重复洗板步骤。

5. 底物显色：加入新鲜配制的TMB 底物溶液100μl/孔，37 ℃避光显色12-15min。

6. 终止反应：加入1.5M H₂SO₄终止液100μl/孔。

7. 结果判定：在酶标仪于450nm处读取结果，所有样品取两孔的平均值作为结果判定值。以空白对照孔调零后（所有样品孔OD值-空白孔OD值）作为各样品孔实际检测的OD值。

（1）实验结果成立判定：若阳性标准OD₄₅₀≥阴性对照OD₄₅₀值的2.1倍，实验结果成立。

（2）结果判定：待测样品OD₄₅₀≥阴性对照OD₄₅₀值的2.1倍，判定为阳性。对于阴性样品，可以通过聚合酶链式反应（PCR）进行再次检测。

（九）、猪瘟病毒抗原双抗体夹心ELISA田间样品检测

  将本申请人保存的1984年至2006年的73份样品[5]用双抗体夹心ELISA进行检测，检测结果如下(表10—双抗体夹心ELISA和PCR两种方法检测猪瘟抗原结果表)。

表10中73份样品均为通过PCR方法检测后确定为CSFV核酸为阳性。VHH抗体作为捕获抗原的双抗体夹心ELISA方法检测出其中61份样品为病毒抗原阳性，阳性检出率为83.56%。双抗体夹心ELISA方法检测猪瘟病毒抗原为阳性，可以证实样品中确实存在CSFV感染，有助于送检猪场及时采取防疫措施对已发病猪进行处理，对受威胁的猪群采取紧急接种方式避免被病毒感染，从而最大程度减少经济损失。

序列表

<110>  中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>  双峰驼源抗猪瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重链抗体VHH和用途

<130>  Muyldermans S, Atarhouch T, Saldanha J, Barbosa JA, Hamers R. 

       Sequence and structure of VH domain from naturally occurring 

       camel heavy chain immunoglobulins lacking light chains. 

       1994,7(9):1129-35.

<160>  3     

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  372

<212>  DNA

<213>    Bactrian camel

<220>

<221>  gene

<222>  (1)..(372)

<400>  1

caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc     60

tcctgtgcag cctccggata tagctttatc gataagacta tggcctgggt ccgccaggct     120

ccagggaagg gtctagagtg ggtatcagcc attcggatgc ataacggtag cacatactac    180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attattgcgc gcgactgtcg    300

cgtaggattc aggctaagga taaggcgaag ttgaagtatt ggggtcaggg aaccctggtc    360

accgtctcga  gc                                                                   372

<210>  2

<211>  378

<212>  DNA

<213>    Bactrian camel

<220>

<221>  gene

<222>  (1)..(378)

<400>  2

gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg caggggggtc tctgagactc     60

tcctgtacag cctctggatt cacttttgat gattatgcca tggcctggtt ccgccagcct         120

ccaggaaagg agcgcgaggg ggtctcatgt attagctcga gtggtggtag cacatggtat    180

gcagactccg ttaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaaatga acagtctgaa acctgaggac acggccatgt attactgtgc ggcagactgg    300

gggcgactgt gtgtcgtcag aggtccacga aatgagtata agtactcggg ccaggggacc    360

caggtcactg  tctcctca                                                              378

<210>  3

<211>  378

<212>  DNA

<213>    Bactrian camel

<220>

<221>  gene

<222>  (1)..(378)

<400>  3

gatgtgcagc tagtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg caggggggtc tctgagactc     60

tcctgtacag cctctggatt cacttttgat gattatgcca tggcctggtt ccgccagcct       120

ccaggaaagg agcgcgaggg ggtctcatgt attagctcga gtggtggtag cacatggtat    180

gcagactccg ttaagggccg attcaccgtc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat    240

ctgcaattga acagtctgaa acctgaggac acggccatgt attactgtgc ggcagactgg    300

gtgaaaatgt attttgtggt gggtccacga aatgagtata agtactcggg ccaggggacc    360

caggtcactg  tctcctca                                                          378