抗甘蓝根肿菌的芸苔属植物及其种子和植物部分以及其获得方法

摘要

本发明涉及抗甘蓝根肿菌的芸苔属植物。本发明更具体地涉及在其基因组中包含两个以上传递抗性的遗传因子的抗甘蓝根肿菌的芸苔属植物，其中，通过数量性状遗传位点1（QTL1）和数量性状遗传位点3（QTL3）和/或数量性状遗传位点5（QTL5）的存在能够确定传递抗性的遗传因子的存在。

说明书

本申请涉及抗甘蓝根肿菌(Plasmodiophora brassicae-resistant)的芸 苔属植物(Brassica plant)，尤其涉及抗甘蓝根肿菌的甘蓝植物(Brassica  oleracea plant)并涉及其种子、果实和/或植物部分。根据另一方面，本发 明涉及用于获得抗甘蓝根肿菌的芸苔属植物的方法。此外，本发明涉及提 供本甘蓝根肿菌抗性和分子标记物的数量性状遗传位点(QTL)，尤其是 任意扩增的微卫星多态(RAMP)标记物，用来识别本数量性状遗传位点 (QTL)。

土结的(soil-bound)微生物甘蓝根肿菌是十字花科植物(十字花) (Brassicaceae)中甘蓝根肿病的病因。芸苔属是十字花科(family  Brassicaceae)(以前为十字花科(Cruciferae))中的一种植物属。该属的 成员全部被称作甘蓝(卷心菜，cabbage)或芥(mustard)。芸苔属包括许 多重要的农业作物和园艺作物，包括油菜(rape)、花椰菜(cauliflower)、 红球甘蓝(red cabbage)、皱叶甘蓝(savoy cabbage)、白球甘蓝(white  cabbage)、牛心甘蓝(oxheart cabbage)、羽衣甘蓝(curly cale cabbage)、 绿花椰菜(broccoli)、孢子甘蓝(Brussels sprouts)、大白菜(Chinese  cabbage)、球茎甘蓝(rurnip cabbage)和葡萄牙甘蓝(Porruguese cabbage) (tronchuda)。

植物的几乎所有部分被用作食物，如根(大头菜)、茎(球茎甘蓝)、 叶(白球甘蓝和红球甘蓝、皱叶甘蓝)、腋芽(球芽甘蓝)、花(花椰菜、 绿花椰菜)、苗和种子(油菜)。为了观赏目的也培养了具有白花或紫花或 具有不同颜色或形状的叶子的一些物种。

甘蓝根肿菌的感染通过甘蓝植物的根毛发生。当甘蓝根肿菌的游动孢 子已经渗透根部时，孢子诱导感染部位周围的细胞过度增长(细胞肿大) 和增生(细胞分裂)。用于这些过程的荷尔蒙刺激物在植物中进一步传播， 以便在未感染的细胞中也能够发生这些结构改变。

甘蓝根肿菌在植物中没有形成菌丝，而是以发生在组织细胞内的原质 团的形式出现。该原质团通过形成游动孢子囊给根部带来进一步的伤害， 新的游动孢子从游动孢子囊中释放。该疾病的特征为根部高度肿大，在该 疾病过程的进一步发展中，根部由于腐烂而瓦解。病原体的成形卵孢子在 释放到该处的地面上释放。由于损坏的根系阻碍水和矿物的吸收，宿主植 物的地上部分在生长上进一步落后。

假定世界上10%生长甘蓝的地区感染有甘蓝根肿菌。这导致每年的 产量大量减少。

考虑到用于食物生产的芸苔属植物的重要性和由病原体甘蓝根肿菌 造成的经济损害，本发明为了其目的必须提供抗甘蓝根肿菌的芸苔属植物 及其获得的方法。

通过缺乏合适、经济有效且高效的方法对抗这种疾病，如农药对这种 病原体无效，进一步强调了需要用于食物生产的抗甘蓝根肿菌的芸苔属植 物。甘蓝根肿菌是世界上十字花科植物最重要的病原体中的一个。

根据第一方面，通过提供根据所附权利要求1所述的抗甘蓝根肿菌芸 苔属植物实现了本发明的上述目的之一。

根据第一方面，通过在其基因组中包含两个以上传递抗性的遗传因子 的抗甘蓝根肿菌芸苔属植物实现了本发明的上述目的之一，其中通过数量 性状遗传位点1(QTLl)和数量性状遗传位点3(QTL3)和/或数量性状 遗传位点5(QTL5)的存在能够确定传递抗性的遗传因子的存在，其中

数量性状遗传位点1(QTLl)的特征为选自由以下所组成的组中的 一种或多种RAMP标记物:具有引物组合SEQ ID No:1(1.1)和7的292-296 个bp的片段;具有引物组合SEQ ID No:2(1.2)和7的69-73个bp的片段; 具有引物组合SEQ ID No:3(1.3)和7的113-117个bp的片段;具有引物组 合SEQ ID No:4(1.4)和7的214-217个bp或215-219个bp的片段;以及 具有引物组合SEQ ID No:24(1.5)和7的201-205个bp的片段;

数量性状遗传位点3(QTL3)的特征为选自由以下所组成的组中的 一种或多种RAMP标记物:具有引物组合SEQ ID No:9(3.1)和7的157-161 个bp的片段;具有引物组合SEQ ID No:10(3.2)和7的133-137个bp的片 段;具有引物组合SEQ ID No:11(3.3)和7的218-222个bp的片段;以及 具有引物组合SEQ ID No:12(3.4)和7的73-77个bp的片段;

数量性状遗传位点5(QTL5)的特征为选自由以下所组成的组中的 一种或多种RAMP标记物:具有引物组合SEQ ID No:16(5.1)和7的 274-278个bp的片段;具有引物组合SEQ ID No:17(5.2)和7的533-537 个bp的片段;具有引物组合SEQ ID No:18(5.3)和7的333-341个bp的片 段;以及具有引物组合SEQ ID No:19(5.4)和7的217-225个bp的片段。

应该注意的是，依照根据本发明的植物的上述定义，本发明涉及包含 QTLl和QTL3的芸苔属植物，包含QTL1和QTL5的植物以及包含QTL1、 QTL3和QTL5的植物。

根据本发明的该第一方面，提供了抗甘蓝根肿菌的芸苔属植物。本植 物包含对甘蓝根肿菌的所有四种致病型的抗性。换言之，本植物包含对甘 蓝根肿菌的致病型0、I、II和III的抗性。

本文中使用的7号引物是商业上可购得的PAPD引物(Operon RAPD 10-mer kits A-01至BH-20，并包括BH-20)。

根据本发明的优选实施方式，本植物在其基因组中包含如如上限定的 数量性状遗传位点1(QTL1)和数量性状遗传位点3(QTL3)和/或数量 性状遗传位点5(QTL5)。

根据再一个优选实施方式，本植物对于数量性状遗传位点1(QTL1)、 数量性状遗传位点3(QTL3)和/或数量性状遗传位点5(QTL5)是纯合 的(同型结合的，homozygous)。

根据本发明的另一个优选实施方式，本植物在其基因组中还包含三个 以上传递抗性的因子，其中通过数量性状遗传位点2(QTL2)、数量性状 遗传位点4(QTL4)和/或数量性状遗传位点6(QTL6)的存在能够确定 传递抗性的遗传因子的存在，其中

数量性状遗传位点2(QTL2)的特征为选自由以下所组成的组中的 一种或多种RAMP标记物:具有引物组合SEQ ID No:5(2.1)和7的740-750 个bp的片段;具有引物组合SEQ ID No:6(2.2)和7的141-145个bp的片 段;具有引物组合SEQ ID No:7(2.3)和7的167-171个bp的片段;具有引 物组合SEQ ID No:8(2.4)和7的293-297个bp的片段;

数量性状遗传位点4(QTL4)的特征为选自由以下所组成的组中的 一种或多种RAMP标记物:具有引物组合SEQ ID No:13(4.1)和7的 314-318个bp的片段;具有引物组合SEQ ID No:14(4.2)和7的240-244 个bp的片段;具有引物组合SEQ ID No:15(4.3)和7的112-116个bp的片 段;以及

数量性状遗传位点6(QTL6)的特征为选自由以下所组成的组中的 一种或多种RAMP标记物:具有引物组合SEQ ID No:20(6.1)和7的 201-205个bp的片段;具有引物组合SEQ ID No:21(6.2)和7的291-295 个bp的片段;具有引物组合SEQ ID No:22(6.3)和7的183-187个bp的片 段;具有引物组合SEQ ID No:23(6.4)和7的375-379个bp的片段。

应当注意的是，依据根据本发明植物的上文定义，本发明涉及包含 QTL1和QTL3的芸苔属植物，包含QTL1和QTL5的植物以及包含QTL1、 QTL3和QTL5的植物，并且所述植物进一步包含QTL2、QTL4或QTL6， 因此包含QTL1、QTL3和QTL2;QTL1、QTL3和QTL4;QTL1、QTL3 和QTL6的植物;包含QTL1、QTL5和QTL2;QTL1、QTL5和QTL4; QTL1、QTL5和QTL6的植物以及包含QTL1、QTL3、QTL5和QTL2; QTL1、QTL3、QTL5和QTL4;QTL1、QTL3、QTL5和QTL6的植物; 以及包含QTL1至6或QTL1至5或QTL1至4的植物。

根据另一个优选实施方式，根据本发明的植物在其基因组中进一步包 含如上限定的数量性状遗传位点2(QTL2)、数量性状遗传位点4(QTL4) 和/或数量性状遗传位点6(QTL6)。

根据本发明的一个优选实施方式，本数量性状遗传位点1(QTL1)、 2(QTL2)、3(QTL3)、4(QTL4)、5(QTL5)和/或6(QTL6)的特征 为如上限定的每个标记物具有两种以上RAMP标记物。

根据本发明的一个优选实施方式，本数量性状遗传位点1(QTL1)、 2(QTL2)、3(QTL3)、4(QTL4)、5(QTL5)和/或6(QTL6)的特征 为如上限定的每个QTL具有三种以上RAMP标记物。

根据本发明的一个优选地实施方式，本数量性状遗传位点1(QTL1)、 2(QTL2)、3(QTL3)、4(QTL4)、5(QTL5)和/或6(QTL6)的特征 为如上限定的每个QTL具有四种以上RAMP标记物。

根据本发明的一个特别优选实施方式，本QTL1的存在通过如上限定 的5种RAMP标记物表明。

仍然根据本发明的特别优选实施方式，本QTLl的存在通过所限定的 所有标记物表明。

根据本发明的一个优选实施方式，植物是甘蓝植物。

根据本发明的进一步优选实施方式，植物是选自选自由以下所组成的 组中的芸苔属植物:B.oleracea convar.botrytis var.botrytis(花椰菜，罗马 花椰菜)、B.oleracea convar.botrtis var.cymosa(绿花椰菜)、B.oleracea  convar.botrytis var.asparagoides(嫩茎花椰菜)、B.oleracea convar.oleracea  var.gemnifera(孢子甘蓝)、B.oleracea convar.capitata var.alba(白球甘蓝、 牛心甘蓝)、B.oleracea convar.capitata var.rubra(红球甘蓝)、B.oleracea  convar.capitata var.sabauda(皱叶甘蓝)、B.oleracea convar.acehala var.sabellica(羽衣甘蓝)、B.oleracea convar.acehela var.gongyloides(球茎甘 蓝)和B.oleracea var.tronchuda syn.costata(葡萄牙甘蓝)。

上文所述的根据本发明的植物优选具有源于保藏号NCIMB41685或 NCIMB41686的植物的甘蓝根肿菌抗性，可获自NCIMB Ltd，Ferguson  Building,Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen AB219YA，England。

上文所述的根据本发明的植物优选具有保藏号为NCIMB41685或 NCIMB41686的植物中存在的甘蓝根肿菌抗性，其可获自NCIMB Ltd， Ferguson Building,Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen AB219YA， England。

上文所述的根据本发明的植物优选源自保藏号为NCIMB41685或 NCIMB41686的植物，其可获自NCIMB Ltd，Ferguson Building，Craibstone  Estate，Bucksburn，Aberdeen AB21 9YA，England。

根据本发明的有利的植物是保藏号为NCIMB41685或NCIMB41686 的植物，其可获自NCIMB Ltd，Ferguson Building,Craibstone Estate， Bucksburn，Aberdeen AB219YA，England。

鉴于本发明芸苔属植物存在的有利的抗性，根据又一个方面，本发明 还涉及包含上文限定的数量性状遗传位点1(QTL1)和数量性状遗传位点 3(QTL3)和/或数量性状遗传位点5(QTL5)的本芸苔属植物的种子、 果实和/或植物部分。

根据该方面的一个实施方式，本芸苔属植物的该种子、果实和/或植 物部分还包含上文限定的数量性状遗传位点2(QTL2)、数量性状遗传位 点4(QTL4)和/或数量性状遗传位点6(QTL6)。

根据又一个方面，本发明还涉及用于提供抗甘蓝根肿菌甘蓝的方法， 包括在芸苔属植物中上文限定的数量性状遗传位点1(QTL1)和数量性状 遗传位点3(QTL3)和/或数量性状遗传位点5(QTL5)的基因渗入 (introgression)、或基因组组合（genomic combination)。

根据该方面的特别推荐的实施方式，该方法进一步包括在芸苔属植物 中上文限定的数量性状遗传位点2(QTL2)和数量性状遗传位点4(QTL4) 和/或数量性状遗传位点6(QTL6)的基因渗入、或基因组组合。

根据该方面另一个优选的实施方式，本方法进一步包括用于测定在芸 苔属植物中存在上文限定的一种或多种RAMP标记物的分子生物技术。

根据该方面优选实施方式，芸苔属植物对与数量性状遗传位点1 (QTL1)、3(QTL3)和5(QTL5)是纯合的。

仍根据另一方面，本发明涉及上文限定的数量性状遗传位点1 (QTL1)、2(QTL2)、3(QTL3)、4(QTL4)、5(QTL5)和/或6(QTL6) 的用途，用来提供抗甘蓝根肿菌芸苔属植物，优选甘蓝植物，如根据本发 明的植物。

仍根据另一方面，本发明涉及选自由以下所组成的组中的一种或多种 引物的用途:SEQ ID NO:1-24（引物1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.1、2.2、 2.3、2.4、3.1、3.2、3.3、3.4、4.1、4.2、4.3、5.1、5.2、5.3、5.4、6.1、 6.2、6.3、和6.4)，用于提供抗根肿菌芸苔属植物，如根据本发明的植物。

仍根据另一方面，本发明涉及根据本发明的植物、或根据本发明的种 子、果实和/或植物部分的用途，用于提供抗根肿菌芸苔属植物。

下文将基于优选实施方式的实施例进一步描述本发明。然而，应当理 解的是仅是为了说明的目的提供该实施例，而不是以任何方式限制上述发 明。

实施例

针对甘蓝中甘蓝根肿菌抗性的培育是一个复杂的过程。已经描述了甘 蓝根肿菌的多重病变型，而抗性在甘蓝中仅很少出现。

为了获得本文所述的对甘蓝根肿菌具有广泛抗性的甘蓝植物，利用 了具有显性抗性(dominant resistance)的基因源。此外，在使用的基因源 中的抗性是多基因决定的。通过问交程序将抗体引入到各种遗传背景(易 受感染的亲代系)中。

具有易感染植物的每个杂交后为近交代。该代的后代必须在温室试验 中测试它们的抗性水平。因此，对于一年生植物每代总是最少要花费两年 来观察新杂交的效果，而对于两年生植物(biannual plant)至少三年。

通过在生长和发育过程中将幼植的根与根肿病接种物接触实施抗性 试验。在测试开始的前一天，通过细微地研磨150克来自确定带有根肿病 感染的隔离群中的冷冻甘蓝根并将其与4000克盆栽堆肥混合来准备该接 种物。随后将水加入上述混合物直至完全渗透混合物。将该接种物在20°C 下保存1天，以便甘蓝根肿菌(P.Brassicae)孢子能够有效地传播通过土/ 水混合物。在接种那天，将5天大的待测试物质的幼苗移植到1cc的土/ 水/甘蓝根肿菌(P.Brassicae)混合物中。为了这个目的，在设计出该接种 物剂量后不久对设置在温室台上的10cm厚的盆栽堆肥层进行了移植操 作。随后将该植物在日夜节律分别为16和8小时且日夜温度为20/16°C的 有光照的温室(lit greenhouse)中培养6周。

在评估之前，小心的收获植物并清洗干净。由于这不包括黑白抗性反 应(black and white resistance reaction)，因此用定量的值{0(完全抵抗的) -9(完全易感染)的}描述该水平。种类9的根高度易感染并显示出严重 的肿胀。种类0的根完全没有肿胀。发现各种遗传背景中的抗性不仅表现 出简单的孟德尔行为(Mendelian behaviour)，而是在正态分布内表现出表 型等级。这种分布能够急剧地转移到易感染侧，这意味着来自抗性源和各 种易感染亲代系之间杂交的近亲交配的种群产生不同百分比的抗性植物。

基于种群中分离比率和植物的抗性水平差异发现，植物的抗性水平是 由多重遗传因子决定的。为了描绘DNA标记物的数量性状，通常利用QTL 分析。QTL是与潜在的基因配对的独立染色体结构域，其共同解释或确定 性状。

利用DNA标记物对具有不同遗传背景的甘蓝杂交种群进行基因组跨 越QTL分析(genome-spanning QTL analysis)。利用这些不同种群的植物 进行了温室试验，用于确定个体植物的抗性水平。通过结合标记物分析数 据和温室试验分数的数据，可以识别负责甘蓝根肿菌抗性的QTL。

已经识别了共有六种独立地可遗传ATL，这在不同程度上促进了抗 性水平。QTL的存在和/或缺失引起温室试验中观察到的植物间抗性水平 的变化。可以将这些QTL中的一个指定为主QTL(QTLl)，主QTL必须 总是存在以获得任一广泛有效的抗性。

正如QTL1，QTL3和5促进抗性水平，并且虽然这种促进不如主 QTL的促进大，但也独立于遗传背景。其他三种QTL(QTL2、4和6) 可能具有引起抗性水平变化的修饰作用。

已经可以利用与QTL1至6结合的DNA标记物来选择抗甘蓝根肿菌 的植物。选择位于多重区域的性状需要大的选择种群。在由源自抗性植物 和易感染植物之间杂交的个体组成的近交种群中，植物实际存在来自源的 三种最重要的纯合QTL的几率是1:64。

DNA标记物的选择提供了进行重复回交的选择权，其中对与根肿病 抗性有关的QTL进行选择(标记物辅助循环回交(Marker Assisted  Recurrent Backcross)，MARB)。以此方式，一或两年得到每个杂交代，这 就意味着繁殖程序上加速了10至20年。

从疾病试验可以得到具有高水平抗性的植物，但哪个具有一个以上杂 合形式的QTL。DNA标记物的利用提供了分析来自繁殖程序种群的抗甘 蓝根肿菌的植物和对所需植物进行预选的可能性。

选择具有所需园艺质量性状的植物作为该预选的原材料。这些植物是 部分杂合的;为了它们可以作为杂交品种的亲代，必须将它们制成完全纯 合的。

使受体植物中所有QTL基因渗入为纯合的方法是通过双单倍体的诱 导。各种出版物都描述了用于诱导芸苔属植物中双单倍体的方法(参见用 于几个实施例的ref.1和ref.2)。

测定各个再生植物的倍数性水平(Partec CA-II，Partec，Munster)并 仅保留双单倍体植物。

各个QTLs的特征是如表2列出的许多DNA标记物，这些标记物表 现出自源基因渗入的特征。

利用RAMP技术产生DNA标记物。RAMP技术，其中ISSR和RAPD- 引物结合，产生其中具有尤其是与抗性共分离的DNA片段的带型，借此 能够区分包含QTL基因渗入的个体和不包含QTL基因渗入的个体。通过 描绘RAMP片段和抗性分数的表型，识别形成QTL的紧密连锁的RAMP 标记物，表2给出了这些标记物的概述。相关‘连锁群'上QTL的位置和 QTL内标记物的彼此距离以厘摩(cM)给出。

下面概述中显示了DNA标记物产生的一般PCR条件。

用于RAMP反应的PCR混合

每个反应

～0.2ng/μl基因组植物DNA

75mM Tris-HCl(pH8.8)

2OmM NH₄SO₄

0.01%(v/v)吐温20

2.80mM MgCl₂

0.25mM dNTP

0.12μM正向引物

0.29μM反向引物

0，04单位/μl RedDNA聚合酶(ABgene，Epsom)

PAGE/Licor

为了分析RAMP模式，使用了“Gene ReadIR4200DNA analyzer” (Licor Inc.)。根据最适浓度为6.5%的丙烯酰胺，可以将片段分离成单个 碱基。为了使这个系统上的片段可见，必须了利用示踪的(IRDye标签) 引物。为了这个目的，通过具有相同序列的示踪引物取代前述引物三分之 一的质量。

标记物概述

表2中提及的引物用于产生表1中提及的DNA标记物。

表1:每个QTL的RAMP标记物的概述

表2:SEQ ID No概述

^*)Eurofins MWG Operon,Anzingerstraβe7a,85560Ebersberg Germany

具有各种引物组合物的PCR反应形成特定尺寸的QTL基因渗入片段 (参见表1)。这些DNA标记物是相关QTL所特有的。这些表现QTL特 性的DNA标记物的组合提供了存在来自抗甘蓝根肿菌源的QTL基因渗入 的不可置疑的证据。

定义

厘摩(cM):

用于标记物之间基因距离的单位，基于每一百个个体杂交筛除物的数 量。

DNA标记物:

与基因连接或位于基因组已知位置处的染色体片段上的DNA片段， 该DNA片段用于监测该基因或该片段的遗传性能。

凝胶电泳:

在电场影响下根据基质(琼脂糖或聚丙烯酰胺)中分子(DNA、RNA、 蛋白等)的尺寸、形状或电荷来分离分子的方法。

近交代(自花传粉):

用其自身花粉进行的个体受精

基因渗入:

可以通过杂交的方式引入到另一个系的系的染色体片段。

IRDye标签:

用于Licor显像系统的红外线标签，其检测在700nm或800nm发生。

连锁群:

组合遗传的一组基因。

MARB:

标记物辅助循环回交:具有质量系(quality line)的供体系(donor line) 重复回交的程序设置有标记物分析，以便在每代中选择仍具有用于测定的 抗性并与质量系遗传型对应最多的所有QTL的植物。

单基因的:

通过一个基因测定的。

聚合酶链反应(PCR):

一种用于繁殖特定DNA片段的体外扩增方法。该合成反应使用最小 量的一个与DNA片段杂交的寡聚核苷酸引物，然后，聚合酶在连续温度 循环过程中扩增侧翼区。

数量性状遗传位点(QTL):

与一个或多个基因配对的共同解释数量性状的染色体区域。

随机扩增的微卫星多态(RAMP):

基于RAPD和iSSR引物的DNA指纹技术，用该方法检测不同DNA 畸形生物间的多态性。

随机扩增的多态DNA(RAPD)引物:

具有“随机”序列的10-mer，其中GC含量处于60%至70%之间，并 且其中引物端不是自身互补的。

中间单序列重复(iSSR)引物:

设计在SSR(单序列重复)5'端的引物;由固定在5'端的具有4个 bp的2或3个核苷酸的副本组成的DNA片段。

回交:

个体与原始亲代之一的杂交。

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(该表不是国际申请的一部分并且不算作国际申请的表)

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