抗CiP抗体在早期类风湿关节炎诊断中的应用

摘要

本发明名称为“抗CiP抗体在早期类风湿关节炎诊断中的应用”。本发明提供了一种CiP及其类似物用于早期RA检测的方法。这种多肽抗原可特异性的结合早期RA患者体内的特异性抗体，具有很高的敏感性和特异性；且在IgM-RF或抗CCP抗体以及AKA、APF检测结果为阴性的早期RA患者中具有较高阳性率，有利于对IgM-RF抗体阴性或抗CCP抗体阴性患者的辅助诊断。

说明书

技术领域

本发明涉及抗CiP抗体在检测早期类风湿关节炎中的应用。 

一、背景技术

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以多关节侵蚀性滑膜炎症为特征的系统性自身免疫病，患病率为0.33％，我国约有500万患者，且多为中青年女性，未经正规治疗致残率达75％。我国在2006年进行的第二次全国残疾人抽样调查中，致残性关节病在导致肢体残疾的21类病因中排第2位(20.1％)，仅次于脑血管病(20.6％)，其中79.4％为RA致残。RA病情进展迅速，骨质破坏在第1年中最快，因此针对早期RA的准确诊断至关重要。 

近年来的大量研究表明，瓜氨酸化修饰在RA自身抗原致病机制中具有重要意义，瓜氨酸化抗原作为RA最特异的一类抗原介导了RA自身免疫反应和抗体的产生。目前，RA的病因仍不明确，病原体的抗原可能由于存在与人体自身蛋白相似的结构，通过分子模拟机制引发RA的自身免疫反应。多项研究发现，RA发病和EB病毒、细小病毒、人类单纯孢疹病毒等病原密切相关。本发明人的研究发现，RA患者体内存在高滴度的针对人乳头瘤病毒CiP抗原肽的自身抗体，该抗体可通过一些较为简便的免疫学检测方法(如：酶联免疫吸附法)检测出来。并且对早期RA患者具有很高的敏感性和特异性。 

二、发明概述 

本发明的目的之一是提供能够有效检测早期RA的特异性抗原——CiP抗原肽。 

本发明的另一目的是提供了CiP及类似物抗体用于检测早期RA的方法。 

本发明所用术语“CiP”指具有共同序列KRGNTXGRGRGRQGRAGSSG(Lys-Arg-Gly-Asn-Thr-Cit-Gly-Ary-Gly-Arg-Gly-Arg-Gln-Gly-Arg-Ala-Gly-Ser-Ser-Gly甘胺酸-天冬酰胺-苏氨酸-瓜氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-精氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸)的氨基酸、多肽类似物及蛋白。 

我们在对人乳头瘤病毒蛋白的修饰及其抗原性的研究中发现了一段含有瓜氨酸的富含R-G序列的抗原肽序列。进一步研究发现，RA患者体内存在高滴度的针对该序列的抗体，命名为抗CiP抗体，该抗体可通过一些较为简便的免疫学检测方法(如：间接酶联免疫吸附法)检测出来，并且对早期RA的诊断具有很高的敏感性和特异性。 

本发明目是提供有效检测早期RA特异性抗原的检测方法，并应用于早期RA的诊断。基于以上研究，本发明人将CiP的19个氨基酸的多肽KRGNTXGRGRGRQGRAGSS(即 Lys-Arg-Gly-Asn-Thr-Cit-Gly-Ary-Gly-Arg-Gly-Arg-Gln-Gly-Arg-Ala-Gly-Ser-Ser-Gly赖氨酸-精氨酸-甘胺酸-天冬酰胺-苏氨酸-瓜氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-精氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸)做为抗原，用ELISA的方法检测早期RA，系统性红斑狼疮，干燥综合征，骨关节炎，皮肌炎/多发性肌炎，系统性硬化症及正常人血清中的抗CiP抗体，从而达到通过血清学的方法诊断早期RA的目的，为早期的临床诊断提供客观的实验室依据。 

本发明的抗抗体多肽及其类似物可通过酶联免疫吸附法对RA患者进行检测，其检测方法为本领域技术人员所熟知的。同时，检测的CiP抗体类型可为IgG型、IgA型、IgM型或其它类型的免疫球蛋白。 

本发明所述的CiP可以用本领域人员所熟知的固相合成法方法得到。 

附图说明

图1.酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗CiP抗体原理示意图。 

图2.注：抗Cit-HPV₄₇-E2^345-362抗体不同亚型在RA、其他风湿性疾病患者及健康对照滴度(AU值)比较。由图可见，ELISA方法检测抗CiP抗体(IgG、IgM、IgA)的AU值在早期RA血清中的平均水平明显高于其它风湿免疫病和正常人对照组(P均＜0.05或＜0.01)。 

具体实施方式

实施例1  抗CiP的设计及合成 

选取HPV47型转录调节蛋白E2蛋白的第345-362位氨基酸序列(E2^345-362)，以瓜氨酸替代其第348位上的精氨酸，合成CiP抗原多肽，以固相合成法合成，高效液相层析法进行纯化。 

其序列如下：KRGNTXGRGRGRQGRAGSSG 

(即Lys-Arg-Gly-Asn-Thr-Cit-Gly-Ary-Gly-Arg-Gly-Arg-Gln-Gly-Arg-Ala-Gly-Ser-Ser-Gly赖氨酸-精氨酸-甘胺酸-天冬酰胺-苏氨酸-瓜氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-精氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸)。研究表明：上述抗CiP抗体在早期RA患者血清中具有显著高于其他相关疾病的抗体滴度，敏感性和特异性较好，对早期RA的诊断具有重要的意义。 

实施例2 抗CiP抗体对早期RA患者血清中抗体的检测 

本研究采用酶联免疫吸附法(即ELISA法)对早期RA，系统性红斑狼疮，干燥综合征，骨关节炎，皮肌炎/多发性肌炎，系统性硬化症及正常人血清中的抗CiP抗体进行检测，以评价该多肽抗体在各种疾病中的分布。 

首先将CiP包被于酶联免疫吸附微孔板上，与待测血清一起孵育，如果血清中存在的抗CiP抗体，该抗体就会与包被的固相抗原结合，形成抗原-抗体复合物。将未结合的抗体及其它成分冲洗干净后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG抗体(IgG-HRP)一起孵育，此时IgG-HRP就会与抗原-抗体复合物结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，洗去未结合的成分，加入底物，若血清中含有抗CiP抗体，则会显出特定的颜色，且抗体滴度越高颜色越深。加终止液后在450nm波长下测定OD值。检测原理示意图见说明书附图1。 

本研究共检测102例早期类风湿关节炎(RA)，31例系统性红斑狼疮(SLE)，30例原发性干燥综合征(pSS)，38例骨关节炎(OA)，20例皮肌炎/多发性肌炎(DM/PM)，30例系统性硬化症(SSC)以及40例正常人血清中的抗CiP抗体。每板均设阳性对照、阴性对照。根据ROC曲线选择诊断RA的最佳临界点。AU值＝(A_肽-A_{非特异背景})_待测血清/(A_肽-A_{非特异背景})_标准血清×100，标准血清为阳性标准血清。 

本实施例主要通过以下几个方面阐明本发明多肽在早期RA患者诊断中的意义： 

1、抗CiP抗体阳性率在早期类风湿关节炎、其他结缔组织病及正常人的比较。 

本研究用ELISA方法检测了抗CiP抗体在各组病人及正常人的阳性率，见表1。应用t检验比较各组数据，结果显示，CiP抗体在早期RA中的的阳性率显著高于其他结缔组织病和 正常人，p值均＜0.05。各对照组血清中的CiP抗体的阳性率相近，无统计学差异(p＞0.05)。 

表1  抗CiP抗体在不同疾病中的阳性率比较 

2、抗CiP多肽抗体在不同疾病中的滴度比较： 

抗CiP抗体(IgG，IgM，IgA)在E-RA、SLE、OA、pSS、SSc、DM/PM患者以及健康对照组的滴度(AU)均值分别为IgG(104.8、22.7、30.8、34.4、29.9、27.9及34.3)，IgM(66.1、23.2、33.5、27.4、26.2、27.0及30.5)，IgA(53.0、28.1、39.3、27.4、38.9、25.0及39.3)，RA患者不同亚型抗CiP抗体(IgG，IgM，IgA)水平明显高于其他风湿性疾病组以及健康对照组(P均＜0.05)如说明书附图2所示。 

3、抗CiP不同抗体亚型、抗CCP抗体、IgM-RF敏感性、特异性比较：经X2检验，早期RA组所检测抗体阳性率均显著高于其他对照组(P＜0.05)，各项检验灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值比较见表2。综合研究结果：所评价的指标中IgG、IgM型抗CiP抗体对E-RA诊断的灵敏度、特异度与抗CCP抗体相当，无显著差异。 

表2 抗CiP抗体及抗CCP抗体、IgM-RF对RA的诊断价值比较 

4抗CiP抗体在主要RA自身抗体检测为阴性的早期RA诊断中的意义： 

表3示，抗CiP抗体IgG型、IgM型在IgM-RF检测为阴性的早期RA患者中的阳性率分别是59.4％和71.9％，明显高于抗CCP抗体在该组病人中阳性率(31.2％、34.4％，P均＜0.05)；在AKA、APF和IgM-RF均为阴性的早期RA患者中，抗CiP抗体IgG型、IgM型阳性率分别为54.5％和72.7％，同样高于抗CCP抗体阳性率。在抗CCP抗体阴性的早期RA患者中，抗CiP抗体IgG型、IgM型的阳性 率分别是39.4％、51.5％。由此可见，检测IgG型、IgM型抗CiP抗体对尚处于发病早期阶段，IgM-RF、AKA、APF及抗CCP等自身抗体检测为阴性的E-RA的诊断具有很好的补充意义。 

表3 抗CiP抗体与抗CCP抗体在RA相关自身抗体阴性患者中的比较 

5抗CiP抗体与E-RA的临床和实验室指标之间的关系 

如表4、表5示：在早期RA患者中，抗CiP抗体各亚型阳性组与阴性组在性别、年龄、病程、晨僵、皮下结节及肺部损害上差异无统计学意义。IgG型、IgM型抗CiP抗体阳性组患者的疾病活动指数DAS28评分均高于阴性组(P＜0.05)，且成线性相关(IgG型r＝0.342，P＜0.001；IgM型r＝0.347，P＜0.001)。此外，抗CiP抗体各亚型阳性组中X线发生III期以上改变的患者比例也显著高于阴性组(P均＜0.05)。抗CiP抗体阳性组的抗CCP抗体阳性率、ESR水平均显著高于阴性组(P均＜0.05)。两组间抗角蛋白抗体(AKA)、抗核周因(APF)及IgM-RF、IgA、IgM及IgG等差异均无统计学意义。 

表4 抗CiP抗体与RA相关临床指标之间的关系 

表5 抗CiP抗体与RA实验室指标之间的关系