日本七鳃鳗基因重组蛋白rLj-RGD3在制备脑缺血再灌保护药物中的应用

摘要

本发明一种日本七鳃鳗基因重组蛋白rLj-RGD3在制备脑缺血再灌保护药物中的应用，实验结果证明日本七鳃鳗基因重组蛋白rLj-RGD3对缺血再灌注呈剂量依赖性降低神经功能损伤、呈剂量依赖性降低梗死面积比及可改善脑组织病理性形态学改变，日本七鳃鳗基因重组蛋白rLj-RGD3对缺血再灌注所引起的脑损伤有很好的保护作用，其保护作用优于依达拉奉和依非巴特，可应用于制备脑缺血再灌保护药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种日本七鳃鳗基因重组蛋白rLj-RGD3的新用途，尤其是日本七鳃鳗基因重组蛋白rLj-RGD3在制备脑缺血再灌保护药物中的应用。

背景技术

脑缺血性疾病严重威胁着人类的健康甚至生命，而缺血性脑中风已经成为人类死亡的主要原因之一。缺血性脑中风，又称脑梗死，是一种由于局部脑组织缺血、缺氧导致脑组织软化、坏死，进而在临床上表现为相应神经功能缺失症状的疾病。

整合素家族为细胞黏附分子家族的重要成员，主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互黏附，并介导细胞与 ECM 之间的双向信号传导。整合素介导的黏附作用调节着许多细胞功能，其中包括细胞凋亡、细胞增殖、细胞黏附与迁移、淋巴细胞归巢等。目前，细胞外基质蛋白和整合素受体结合的特异性识别位点已经确定，为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列，即含有RGD序列的多肽能够识别整合素受体蛋白并与之结合从而影响细胞的生物功能。

中国专利号为ZL200510083437.7、名称为“具抗肿瘤作用的日本七鳃鳗口腔腺RGD模体蛋白的基因克隆与表达”的发明专利公开了三种日本七鳃鳗基因重组蛋白，包括日本七鳃鳗基因重组蛋白rLj-RGD3。rLj-RGD3cDNA序列351bp长，其蛋白质由117个氨基酸组成，含有三个RGD模体，其以NdeI和HindIII酶切位点构建于pET23b载体表达的带有六个组氨酸标签的基因重组蛋白分子量为11.934 kDa，可通过分子生物学方法获得。目前，已有研究表明日本七鳃鳗基因重组蛋白rLj-RGD3具有抑制血管新生、抗血小板聚集的活性，但对其对急性脑缺血再灌注损伤的保护作用尚无研究报道。

发明内容

本发明是发现了日本七鳃鳗基因重组蛋白rLj-RGD3对大鼠脑缺血再灌注致脑及远隔器官损伤具有保护作用，从而发明了日本七鳃鳗基因重组蛋白rLj-RGD3在制备脑缺血再灌保护药物中的应用。

本发明的技术解决方案是一种日本七鳃鳗基因重组蛋白rLj-RGD3在制备脑缺血再灌保护药物中的应用。

实验结果证明日本七鳃鳗基因重组蛋白rLj-RGD3对缺血再灌注呈剂量依赖性降低神经功能损伤、呈剂量依赖性降低梗死面积比及可改善脑组织病理性形态学改变，日本七鳃鳗基因重组蛋白rLj-RGD3对缺血再灌注所引起的脑损伤有很好的保护作用，其保护作用优于依达拉奉和依非巴特，可应用于制备脑缺血再灌保护药物。

附图说明

图1是不同实验组大鼠MCAO/RF大脑中动脉闭塞/再灌注24 h后TTC染色结果图。

图2是不同实验组对大鼠MCAO/RF脑梗死体积的影响示意图。

图3是不同实验组大鼠MCAO/RF脑损伤组织HE染色图。

具体实施方式

1．实验组分组及给药：健康雄性SD大鼠 48只，体重280～320 g，实验室条件适应性喂养一周，术前禁食12 h，自由饮水，随机分为如下A~F组（每组8只）：A-假手术组、B-模型组、C-rLj-RGD3高（100.0 μg·kg^-1）、D-rLj-RGD3低（50.0 μg·kg^-1）剂量组、E-阳性对照药依达拉奉（1.5 mg·kg^-1）组和F-依非巴特（100 μg·kg^-1）组。各组大鼠经脑缺血2 h，恢复缺血区血流进行再灌注10 min后自舌下静脉给药，而假手术组和模型组给予等容量生理盐水。

所用rLj-RGD3为按照上述专利方法所获得的日本七鳃鳗基因重组蛋白rLj-RGD3。

2．模型制备：10 %水合氯醛（0.35 mg·kg^-1）腹腔注射麻醉后，将大鼠仰卧位固定于手术台上，备皮，沿颈部正中切开皮肤，钝性分离皮下组织。参照Zea Longal的大鼠大脑中动脉内栓线阻断法（MCAO），用线栓法阻断大脑中脉，造成大脑中动脉供应区血流中断，局灶性脑缺血。缺血2 h后，将栓线缓慢抽出，恢复缺血区血流进行再灌注24 h。假手术组只进行麻醉分离、暴露和结扎血管，不导入栓线。

大鼠经脑缺血2 h再灌注24 h后，以10 %水合氯醛（0.35 mg·kg^-1）腹腔注射麻醉，自腹主动脉取血，制备血清待测；快速断头取脑进行TTC染色及HE染色。

 3．观察指标

3.1 TTC染色: 取脑后并用生理盐水冲洗残血，切除嗅球、小脑以及低位脑干，间隔2 mm冠状切成5个连续脑片（第一刀于脑前极与视交叉连线中点处；第二刀于视交叉处；第三刀于漏斗柄部位；第四刀于漏斗柄与叶尾核之间），置于2 %TTC缓冲溶液中，37 ℃避光，水浴20 min，期间每隔7～8 min翻动一次使脑片染色均匀。TTC可被线粒体过氧化氢酶还原，会将正常脑组织染成红色，缺血梗死区因无此反应而呈白色。

结果如图1所示：图1中A组：脑组织未见梗死灶，全脑均为红色；B组：脑梗死体积最大；C -D各给药组与模型组相比梗死面积均有显著降低。

3.2  脑梗死体积比：脑切片经TTC染色后，于10 %甲醛中固定。对每片脑片正反两面进行拍照，利用Image Pro-Plus photoshop 6.0软件计算出梗死体积，并计算脑梗死体积比。计算公式如下：梗死体积比=[（各片正反面梗死体积之和/2）×片厚/（各片正反面总面积之和/2）×片厚] ×100%。结果如图2所示：C、D和E、F组对脑梗死体积的影响与模型组比较均显著降低(p<0.05)，而且高剂量（100 μg·kg^-1）rLj-RGD3的作用与阳性药依达拉奉1.5 mg·kg^-1作用相当（p>0.05），低剂量组（50 μg·kg^-1）rLj-RGD3的作用与同类药依非巴特100 μg·kg^-1作用相当（p>0.05），表明rLj-RGD3比上述两种阳性药物作用均强。

3.3 组织形态学改变： HE染色后经光学显微镜下观察脑组织病理形态学变化并拍照，结果如图3所示：A组脑组织无水肿、充血等其他病理形态学损伤现象，细胞结构致密、边界清晰，神经元形态结构完整、排列整齐，细胞核无固缩现象；B组大鼠脑组织大脑皮层有充血现象，细胞间质水肿，细胞周围结构松散，神经元排列紊乱，部分神经元肿胀；C组、D组、E组、F组与模型组相比组织水肿减轻，细胞结构较致密，少量神经元肿胀，神经元损伤减轻，说明rLj-RGD3对缺血再灌注所引起的脑损伤有很好的保护作用，且其保护作用好于E组和F组。

通过实验，可以得出如下结论：

神经功能评分和梗死面积比：缺血/再灌注后（2 h、24 h），与假手术组相比，模型组大鼠有明显的神经功能缺陷（神经功能学评分8.88、7.50）；与模型组相比，rLj-RGD3呈剂量依赖性降低神经功能损伤（p<0.01，高、低剂量神经功能学评分分别为4.50、3.25和5.88、4.62）。缺血/再灌注24 h后模型组梗死面积比较假手术组明显升高(40.56 %)；与模型组相比，rLj-RGD3呈剂量依赖性降低梗死面积比（p<0.01）。

脑组织形态学改变：大鼠MCAO/RF缺血/再灌注后（2 h、24 h），模型组大鼠脑组织水肿明显，锥体细胞排列紊乱，细胞边界不清楚，而rLj-RGD3可改善脑组织病理性形态学改变。