骨膜蛋白基因及骨膜蛋白抗体在药物制备中的应用

摘要

本发明涉及医药制备领域，特别涉及骨膜蛋白基因及骨膜蛋白抗体在药物制备中的应用，本发明通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠肝脏中，Periostin基因的表达显著上调、脂肪肝病人的Periostin的表达显著升高，且，Periostin与肝脏TG含量、血清TG含量呈现明显的正相关，说明Periostin基因表达与NAFLD、高脂血症的发生、发展有着密切的联系关系，可用于制备筛选NAFLD试剂和高脂血症试剂。本发明制备的Periostin抗体可用于中和肥胖小鼠体内的Periostin，显著降低肝脏/体重比、肝脏和血清TG含量，因而Periostin抗体具有显著改善NAFLD发展和降低血清中TG含量的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及医药制备领域，特别涉及骨膜蛋白基因及骨膜蛋白抗体在药物 制备中的应用。

背景技术

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）已成为一个重要的公共卫生问题。在过去的 十年内，西方国家NAFLD的患病率已上升到20-30%，而肥胖人群NAFLD的发病 率甚至超过50%。近年来，随着人们生活方式和饮食结构的改变，我国部分地 区成人NAFLD的患病率也已超过15%，且渐趋低龄化，严重危害人们的健康。 除了NAFLD本身所造成的健康和心理问题外，其伴随的多种相关疾病如2型糖 尿病、心脑血管疾病、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等，如果不及时诊断和治疗 的话，该疾病会严重威胁人类身心健康和生活质量，也大大增加了家庭和社会 的经济负担。

NAFLD的实质是肝脏内甘油三酯（TG）的过量堆积。肝细胞内甘油三酯主 要来自于肝细胞的摄取和自身的生物合成。另一方面，肝脏内甘油三酯的去路 主要为β-氧化和合成VLDL释放入血。上述任一环节的异常均可导致甘油三酯 在肝脏内的过量堆积。

高脂血症是指人体血脂水平过高，可直接引起一些严重危害人体健康的疾 病，如动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等。高脂血症是一种常见病症，在中老 年人当中发病率高，可分为原发性和继发性两类。原发性与先天性和遗传有关， 而继发性多发生于代谢性紊乱疾病（糖尿病、高血压、黏液性水肿、甲状腺功 能低下、肥胖、肝肾疾病、肾上腺皮质功能亢进），或与其他因素年龄、性别、 季节、饮酒、吸烟、饮食、体力活动、精神紧张、情绪活动等有关。在通常情 况下，多数患者并无明显症状和异常体征，不少人是由于其他原因进行血液生 化检验时才发现有血浆脂蛋白水平升高，所以如果能及时诊断出高脂血症，可 以让患者得到更好的治疗。

骨膜蛋白（Periostin）是由成骨细胞或成纤维细胞分泌的一种细胞外基 质蛋白，属于束蛋白（fasciclin）家族成员。根据目前的研究表明，Periostin 在多种病理情况下表达上调，包括结肠癌、乳腺癌的骨转移等，但是Periostin 在NAFLD和高脂血症中的作用尚未有相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供骨膜蛋白（Periostin）基因在制备筛选非酒精性脂肪 肝病（NAFLD）试剂和高脂血症试剂中的应用，通过该诊断试剂的临床应用， 能及时诊断出NAFLD患者，以便及时治疗，提高患者的治愈率。

本发明的另一个目的是提供一种Periostin抗体，该Periostin抗体具有显著 改善NAFLD进展和降低血清中甘油三酯（TG）含量的作用。

本发明的另一个目的是提供上述Periostin抗体在制备治疗NAFLD药物中的 应用。

本发明的另一个目的是提供上述Periostin抗体在制备治疗高脂血症药物 中的应用。

本发明通过基因表达谱芯片技术，比较了高脂和低脂饮食喂养的两组 C57BL/6小鼠肝脏基因的表达差异，从中发现：在高脂饮食诱导的肥胖小鼠肝 脏中，Periostin基因的表达显著上调(p<0.05)。

进一步我们通过Real-time PCR和ELISA实验，证实了Periostin在肥胖小 鼠肝脏中的异常表达。此外，在瘦素受体缺乏的db/db肥胖小鼠和瘦素受体缺 乏的ob/ob肥胖小鼠中也得到相同的结果，即：肥胖时，肝脏Periostin的表达 显著上调。

更进一步，我们发现脂肪肝病人的Periostin的表达显著升高，且与肝脏 TG含量呈现明显的正相关。由此可见，Periostin的高表达是NAFLD的一个特征 性变化。

为探讨Periostin在NAFLD发生发展中的作用，实验通过腺病毒介导的过表 达系统，在C57BL/6小鼠肝脏中特异性过表达Periostin。与过表达绿色荧光蛋 白(GFP)组小鼠相比，Periostin过表达后肝脏TG含量增加，肝脏/体重比增加， 血清中甘油三酯（TG）尤其是低密度脂蛋白-TG(VLDL-TG)含量升高。

肝脏组织石蜡切片的伊红-苏木精染色(H&E)和油红染色(Oil Red O)也证 实：Periostin过表达后，肝细胞呈现气球样变性。此外，体外培养的人源肝癌 细胞株HepG2和小鼠原代肝细胞(MPH)中加入纯化的Periostin蛋白，亦发现： Periostin能促进细胞内甘油三酯的沉积。

我们制备了Periostin抗体用于中和肥胖小鼠体内的Periostin。给予db/db小鼠 尾静脉注射抗体两周后(5mg/kg)，同对照组(注射IgG)相比,Periostin中和抗 体并不影响肥胖小鼠的体重，但能显著降低肝脏/体重比，降低肝脏和血清TG含 量，升高血清β-羟丁酸水平，增加甘油三酯和脂肪酸β-氧化相关基因的表达。

本发明的小鼠的Periostin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

  1 mvpllplyal lllflcdinp anansyydkv lahsrirgrd qgpnvcalqq ilgtkkkyfs

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301 almkyhilnt lqcseaitgg avfetmegnt ieigcegdsi singikmvnk kdivtkngvi

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421 smdqrllkli lqnhilkvkv glsdlyngqi letiggkqlr vfvyrtaici enscmvrgsk

481 qgrngaihif reiiqpaeks lhdklrqdkr fsiflsllea adlkdlltqp gdwtlfaptn

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然后将其中的第761位至790位氨基酸片段(wkvtkfieggdghlfedeeik  rllqgdtpak)选定为抗原片段，然后进行抗原生产、动物免疫、融合和单体筛选、 腹水制备等步骤得到Periostin抗体。

本发明的有益效果为：

1、本发明制备的Periostin抗体可用于中和肥胖小鼠体内的Periostin，显 著降低肝脏/体重比、肝脏和血清TG含量，所以，Periostin抗体具有显著改善 NAFLD发展和降低血清中TG含量的作用，可应用于制备治疗NAFLD和高脂 血症药物。

2、通过实验，发现在高脂饮食诱导的肥胖小鼠肝脏中，Periostin基因的 表达显著上调，脂肪肝病人的Periostin的表达显著升高，且与肝脏TG含量、 血清TG含量呈现明显的正相关，说明Periostin基因可用于制备筛选NAFLD 药物。

3、本发明为临床上更合理的应用Periostin及Periostin抗体提供更多的实 验数据和科学依据，为临床上及早诊断和治疗NAFLD和高脂血症奠定了基础。

附图说明

图1是高脂喂养和低脂喂养的小鼠肝脏中的Periostin表达对比图。

图2是瘦素受体缺乏的db/db肥胖小鼠和瘦素缺乏的ob/ob肥胖小鼠肝脏 中的Periostin表达对比图。

图3是正常人和脂肪肝病人的Periostin的表达对比图，且与肝脏甘油三酯 含量呈现明显的正相关。

图4是通过腺病毒介导的过表达系统，在C57BL/6小鼠肝脏中特异性过表 达Periostin，对照组小鼠肝脏中过表达绿色荧光蛋白对比图，其中，A为肝脏 甘油三酯含量对比图，B为肝脏/体重比增加对比图，C为血清甘油三酯对比图。

图5是通过腺病毒介导的过表达系统，在C57BL/6小鼠肝脏中特异性过表 达Periostin，对照组小鼠肝脏中过表达绿色荧光蛋白，两组小鼠的肝脏组织石 蜡切片的伊红-苏木精染色和油红染色对比图。

图6是在培养的人源肝癌细胞株HepG2和小鼠原代肝脏原代细胞中加入 纯化的Periostin蛋白，证明了Periostin能促进细胞内甘油三酯的沉积。

图7是制备的Periostin抗体用于中和肥胖小鼠的对比图，其中，图7A为 三种基因型小鼠肝脏原代细胞的蛋白质免疫印迹实验对比图；7B为瘦素受体 缺乏的db/db肥胖小鼠给予Periostin抗体处理2周后，同对照组IgG组相比， 血清Periostin含量对比图。

图8是给予瘦素受体缺乏的db/db肥胖小鼠尾静脉注射Periostin抗体和注 射IgG两周后的对比图，其中，图8A为肝脏/体重比对比图，图8B为肝脏甘 油三酯含量对比图，图8C为血清甘油三酯含量对比图，图8D为血清β-羟丁 酸水平对比图。

图9是给予瘦素受体缺乏的db/db肥胖小鼠尾静脉注射Periostin抗体和注 射IgG两周后的脂肪酸β-氧化相关基因的表达对比图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

小鼠：C57BJ/6野生型雄性小鼠(8-12周龄)，购自上海斯莱克实验动物有限 公司。db/db、ob/ob小鼠(8-12周龄)，购自南京大学模式生物中心。小鼠饲养在 上海市内分泌代谢病研究所清洁级动物房，饲养温度为21±1℃，湿度55±10%， 光照时间为8:00AM-8:00PM。

普通饲料购自上海斯莱克实验动物有限公司，含有10Kcal%脂肪，70Kcal% 碳水化合物，20Kcal%蛋白质。

高脂饲料购自美国Research Diet公司(D12492)，60Kcal%脂肪，20Kcal%碳 水化合物，20Kcal%蛋白质。

细胞：人源肝癌细胞株HepG2购自中科院上海生命科学院细胞库，采用 DMEM培养液培养，培液中添加10%胎牛血清及100U/ml青霉素和100g/ml链霉 素。细胞每2传代一次。

实施例1

将C57BL/6小鼠分成两组，一组是高脂喂养12周，另一组是低脂喂养12周， 通过基因表达谱芯片技术，比较了高脂组和低脂喂养组的两组小鼠肝脏基因的 表达差异，从中发现：在高脂饮食诱导的肥胖小鼠肝脏中，表达显著上调 (p<0.05)。通过Real-time PCR和ELISA实验，检测Periostin基因在高脂喂养组的 肥胖小鼠、瘦素受体缺乏的db/db肥胖小鼠、瘦素缺乏的ob/ob肥胖小鼠和脂肪肝 病人中的表达，结果表明：Periostin基因在高脂喂养组的肥胖小鼠肝脏中的异常 表达，具体如图1所示；对于瘦素受体缺乏的db/db肥胖小鼠和瘦素缺乏的ob/ob 肥胖小鼠，两组肥胖小鼠肝脏Periostin的表达显著上调，具体如图2所示；在脂 肪肝病人中，Periostin的表达显著升高，且与肝脏TG含量呈现明显的正相关，具 体见图3所示。

实验通过腺病毒介导的过表达系统，在C57BL/6小鼠肝脏中特异性过表达 Periostin，同时，以C57BL/6小鼠肝脏中特异性过表达绿色荧光蛋白(GFP)作为 对比实验进行检测，检测结果为：与过表达绿色荧光蛋白(GFP)组小鼠相比， Periostin过表达后小鼠肝脏TG含量增加、肝脏/体重比增加，血清中TG含量增 加，尤其是血清中低密度脂蛋白-TG(VLDL-TG)含量升高，具体见图4A-4C所 示。同时，将特异性过表达Periostin小鼠肝脏组织和特异性过表达GFP小鼠肝 脏组织进行石蜡切片的伊红-苏木精染色(H&E)和油红染色(Oil Red O)实验，实验 证实：Periostin过表达后，肝细胞呈现气球样变性，如图5所示。

在体外培养的人源肝癌细胞株HepG2和小鼠原代肝细胞(MPH)中加入纯 化的Periostin蛋白，具体如图6所示，发现：Periostin能促进细胞内甘油三酯 的沉积。

通过上述实验，说明了Periosin表达与NAFLD、高脂血症的发生、发展 有着密切的联系关系。

实施例2

Periostin抗体制作过程。

1）、小鼠Periostin蛋白的氨基酸序列（如SEQ IDNo.1所示）为：

  1 mvpllplyal lllflcdinp anansyydkv lahsrirgrd qgpnvcalqq ilgtkkkyfs

 61 scknwyqgai cgkkttvlye ccpgymrmeg mkgcpavmpi dhvygtlgiv gatttqhysd

121 vsklreeieg kgsytyfaps neawenldsd irrglennvn vellnalhsh mvnkrmltkd

181 lkhgmvipsm ynnlglfinh ypngvvtvnc arvihgnqia tngvvhvidr vltqigtsiq

241 dfleaeddls sfraaaitsd lleslgrdgh ftlfaptnea feklprgvle rimgdkvase

301 almkyhilnt lqcseaitgg avfetmegnt ieigcegdsi singikmvnk kdivtkngvi

361 hlidevlipd sakqvielag kqqttftdlv aqlglasslk pdgeytllap vnnafsddtl

421 smdqrllkli lqnhilkvkv glsdlyngqi letiggkqlr vfvyrtaici enscmvrgsk

481 qgrngaihif reiiqpaeks lhdklrqdkr fsiflsllea adlkdlltqp gdwtlfaptn

541 dafkgmtsee relligdkna lqniilyhlt pgvyigkgfe pgvtnilktt qgskiylkgv

601 netllvnelk skesdimttn gvihvvdkll ypadipvgnd qllellnkli kyiqikfvrg

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721 ekqtreerii tgpeikytri stgggetget lqkflqkevs kvtkfieggd ghlfedeeik

781 rllqgdtpak kipankrvqg prrrsregrsq

2）、抗原片段的选取：

将其中的第761位至790位氨基酸片段(wkvtkfieggdghlfedeeikrllqgdtpak) 选定为抗原片段。

3）、抗原生产：

通过基因片段合成、表达载体构建、阳性克隆鉴定、阳性克隆质粒提取及 表达菌转化、大量诱导蛋白表达产生、Ni柱亲和纯化步骤得到蛋白抗原用于免 疫。

4）、动物免疫：

将步骤3）中获得的抗原混合免疫鼠龄为8～12周的雌性BALB/c健康小鼠 3只。采取小鼠快速免疫方式，将3只小鼠的脾脏混合进行融合。

5)、融合和单抗筛选：

将免疫反应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合，融合后 的细胞经过稀释，分置于96孔培养板中培养，培养10-14天进行ELISA检测， 挑选OD值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆，直至阳性孔比率为100%， 得到建株成功的细胞株并进行扩大培养，细胞数按(1-2)x10⁶/管进行冻存。

6）、腹水制备：

将步骤5）中的细胞株采用小鼠腹腔接种法制备腹水，10-14天收集腹水， 采用Protein G柱纯化腹水，得到Protein抗体。

在野生型小鼠原代肝细胞、Periostin敲除型小鼠原代肝细胞、Periostin敲除 型小鼠原代肝细胞转染Perisotin腺病毒36小时的肝细胞中，通过蛋白质免疫印 迹实验，验证得到的Protein抗体的特异性，具体如图7A所示；瘦素受体缺乏 的db/db肥胖小鼠尾静脉注射给予Periostin抗体处理2周后，同对照组相比，血 清Periostin水平下降，见图7B所示。

实施例3

给予db/db小鼠尾静脉注射实施例2中制备的Periostin抗体两周，注射量 为5mg/kg，给予另一db/db小鼠尾静脉注射IgG两周，注射量为5mg/kg作为 对照组进行比较，检测结果如下：Periostin抗体注射小鼠组的肝脏/体重比显著 降低；肝脏和血清中的TG含量也明显降低；血清b-羟丁酸水平也大大升高， 具体如图8A-图8D所示。同时脂肪酸β-氧化相关基因的表达也增加了，如图9 所示。

通过上述实验，说明Periostin抗体具有显著改善NAFLD发展的作用，同 时对于高脂血症也有改善作用，可应用于制备治疗NAFLD和高脂血症的药物。