miR-17-5p及miR-20a在制备依托泊苷耐药逆转剂中的应用

摘要

本发明通过揭示肿瘤细胞对化疗药物依托泊苷（etoposide，又称VP-16、足叶乙甙）耐药性产生的机理，公开了诊断及逆转肿瘤细胞对依托泊苷耐药性的新方法。发明人通过检测对依托泊苷具有不同敏感性的肿瘤细胞中miRNA及凋亡相关蛋白的表达，发现miR-17-5p和miR-20a在对依托泊苷高度敏感的细胞中低表达，而其靶基因Bim-S促凋亡蛋白则呈现高表达。相反，在对依托泊苷具有耐药性的细胞中，miR-17-5p和miR-20a的表达量较高，而Bim-S蛋白则呈现低表达。使用miR-17-5p和/或miR-20a的抑制剂可以有效逆转肿瘤细胞对依托泊苷的耐药性。本发明提供了检测和/或预后癌症对依托泊苷耐药性的全新且简单有效的方法，并且提出逆转肿瘤细胞耐药性的手段，这在肿瘤的临床诊断和个性化治疗中具有潜在的巨大应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物领域，涉及肿瘤耐药性诊断和治疗，更具体涉及通过检测标志性微RNA和凋亡调控蛋白的表达预测肿瘤细胞对化疗药物依托泊苷的敏感性和/或耐受性的方法，以及通过改变miR-17-5p、miR-20a微RNA的表达和Bim-S促凋亡蛋白的表达而降低肿瘤对依托泊苷耐药性的应用。

背景技术

化疗是肿瘤临床治疗的主要手段之一。然而，肿瘤细胞的耐药性常常使得化疗药物的疗效被大大削弱，其结果是肿瘤病人对药物治疗不再敏感，并导致肿瘤复发。因此，在临床诊断中检测或预后肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，并开发逆转肿瘤耐药性的药物，是提高化疗疗效及肿瘤治愈率的关键环节。

目前研究发现肿瘤耐药的分子机制非常复杂，主要包括药物靶基因突变或扩增、药物外排作用相关蛋白表达增强、细胞凋亡途径异常和DNA损伤修复基因表达增强等。最近的研究表明细胞凋亡和抗凋亡关键途径的异常是肿瘤耐药发生和发展的关键因素之一。由于化疗主要是通过诱导凋亡的方式治疗肿瘤，因此肿瘤细胞凋亡途径的缺陷将使得凋亡程序无法被启动，导致肿瘤细胞对治疗产生抗性。肿瘤细胞对化疗药物诱导的凋亡产生抗性主要与以下几个方面有关：（1）促凋亡蛋白失活，其中线粒体凋亡途径的激发者Bim和执行者Bax起着至关重要的作用。例如，Bax的低表达可导致转移性乳腺癌患者对化疗药物的抗性以及低生存率。非小细胞肺癌细胞株对紫杉醇诱导的凋亡的敏感性与Bim而非Bcl-2家族其他成员的表达相关。过表达Bim可以使原本对紫杉醇不敏感的细胞转变成敏感的细胞，而敲低Bim的表达则可以降低紫杉醇诱导的凋亡。类似的结果在乳腺癌和前列腺癌细胞株中都可以观察到。另外，Bim的缺失可影响BMK负瘤小鼠对于紫杉醇的敏感性。（2）过表达抗凋亡基因，如Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1等。（3）p53的缺失或位点突变。

针对肿瘤耐药产生的原因，逆转耐药性常用的策略包括对药物与靶基因结合的位点进行修饰、采用钙离子通道阻滞剂、增强细胞凋亡程度等。由于微RNA （miRNA）对细胞内基因转录后表达的广泛调控，其在肿瘤治疗中的应用也是近年来的研究热点，尤其是微RNA在逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐受性方面表现出了良好的运用前景。例如，在胆管癌病人中miR-21高表达，通过抑制miR-21的表达水平可提高胆管癌细胞对化疗药物吉西他滨的敏感性。在乳腺癌细胞中miR-21的表达高于正常乳腺细胞，用反义寡核苷酸降低MCF-7乳腺癌细胞中miR-21的表达，可以抑制MCF-7的体外和体内增殖并提高MCF-7对化疗药物托泊替康的敏感性。关于微RNA与肿瘤化疗耐药性的相关性研究正如火如荼，有望为成为逆转肿瘤耐药性的新疗法。

依托泊苷又称VP-16或足叶乙甙，是一种细胞周期特异性的抗肿瘤药物，主要作用于DNA拓扑异构酶II，形成药物-酶-DNA稳定的可逆性复合物从而阻碍DNA修复。依托泊苷被广泛应用于癌症的化疗方案，但由于化疗存在着比较严重的骨髓抑制、胃肠道反应和肝肾损伤等，故需与其他药物联合使用。另外，依托泊苷也存在耐药性问题，通过联合用药不仅可以降低化学药物的细胞毒性，减少副作用，也能增强化疗效果。

研究表明微RNA与依托泊苷的耐药性密切相关，在MCF-7/VP-16乳腺癌耐药细胞中miR-326表达下降，而在多药耐药（包括依托泊苷、顺铂、阿霉素等）的小细胞肺癌中miR-134表达下降，这两个微RNA都是以多药耐药相关蛋白MRP-1为靶点而起作用的。寻找凋亡相关的微RNA作为依托泊苷耐药性诊断的标志物，并通过将微RNA模拟物或抑制剂与依托泊苷联合用药来逆转肿瘤细胞的耐药性，对肿瘤的个性化诊断和治疗具有非常重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供诊断肿瘤细胞对依托泊苷耐药性的新试剂和新方法。

本发明具体的思路是提供了miR-17-5p和/或miR-20a在诊断肿瘤细胞对依托泊苷敏感性和/或耐受性中的应用，Bim-S促凋亡蛋白在诊断肿瘤细胞对依托泊苷敏感性和/或耐受性中的应用；以及逆转肿瘤细胞对依托泊苷耐药性的新手段，具体为将miR-17-5p和/或miR-20a的抑制剂与依托泊苷联合用于肿瘤治疗。

申请人经过大量研究发现，miR-17-5p和miR-20a在对依托泊苷高度敏感的肿瘤细胞中低表达，而其靶基因Bim-S促凋亡蛋白则呈现高表达。相反，在对依托泊苷具有耐药性的肿瘤细胞中，miR-17-5p和miR-20a的表达量较高，而Bim-S蛋白则呈现低表达。通过使用miR-17-5p和/或miR-20a的抑制剂，可以有效逆转肿瘤细胞对依托泊苷的耐药性。两种药物联合使用对肿瘤细胞的生长抑制作用和凋亡诱导作用显著大于单一药物的效果或者两种药物单独使用效果的简单加和。

发明提供了以下多个技术方案：

miR-17-5p和/或miR-20a在制备检测和/或预后肿瘤细胞对依托泊苷敏感性和/或耐受性的试剂中的应用。

miR-17-5p和/或miR-20a表达水平测定试剂在制备检测和/或预后肿瘤细胞对依托泊苷敏感性和/或耐受性的试剂中的应用。

Bim-S促凋亡蛋白在制备检测和/或预后肿瘤细胞对依托泊苷敏感性和/或耐受性的试剂中的应用。

Bim-S促凋亡蛋白表达水平测定试剂在制备检测和/或预后肿瘤细胞对依托泊苷敏感性和/或耐受性的试剂中的应用。

Bim-S促凋亡蛋白表达促进剂在提高肿瘤细胞对依托泊苷的敏感性药物上的应用。

miR-17-5p和/或miR-20a的抑制物在制备逆转肿瘤细胞对依托泊苷耐受性药物中的应用。所述miR-17-5p或miR-20a的抑制物是针对miR-17-5p或miR-20a的反义寡核苷酸或其他小分子化合物。

miR-17-5p和/或miR-20a的抑制物与依托泊苷联合在制备肿瘤治疗药物上的应用。所述的肿瘤治疗药物为抑制肿瘤生长和/或诱导肿瘤凋亡的药物。

上述所说的肿瘤可以为miR-17及miR-20a高表达的肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、肺癌、肝癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌等。

同时，发明提供了以下方法：

（I）通过检测肿瘤细胞中的miR-17-5p和/或miR-20a的成熟体的表达水平检测和/或预后肿瘤细胞对依托泊苷的敏感性和/或耐受性。miR-17-5p和/或miR-20a成熟体表达水平高的肿瘤细胞对依托泊苷具有耐受性，miR-17-5p和/或miR-20a成熟体表达水平低的肿瘤细胞对依托泊苷不具有耐受性。miR-17-5p和/或miR-20a的成熟体的表达水平的检测方法可以为半定量RT-PCR、定量RT-PCR等。

（II）Bim-S促凋亡蛋白在检测和预后肿瘤细胞对依托泊苷敏感性和/或耐受性中的应用。通过检测肿瘤细胞中的Bim-S的蛋白表达水平检测和/或预后肿瘤细胞对依托泊苷的敏感性和/或耐受性。Bim-S蛋白表达水平低的肿瘤细胞对依托泊苷具有耐受性，Bim-S蛋白表达水平高的肿瘤细胞对依托泊苷不具有耐受性。Bim-S蛋白表达水平的检测方法可以为蛋白免疫印记、免疫组化等。

（III）同时检测肿瘤细胞中的miR-17-5p和/或miR-20a的成熟体的表达水平以及Bim-S的蛋白表达水平检测和/或预后肿瘤细胞对依托泊苷的敏感性和/或耐受性。

（IV）miR-17-5p和/或miR-20a的抑制物在逆转肿瘤细胞对依托泊苷耐受性中的应用。miR-17-5p或miR-20a的抑制物可以是针对miR-17-5p或miR-20a的反义寡核苷酸或其他小分子化合物。通过使用miR-17-5p和/或miR-20a的抑制物降低miR-17-5p和/或miR-20a的表达，可以提高肿瘤细胞对依托泊苷的敏感性。通过使用miR-17-5p和/或miR-20a抑制物上调Bim-S促凋亡蛋白的表达，可以提高肿瘤细胞对依托泊苷的敏感性。

（V）将miR-17-5p和/或miR-20a的抑制物与依托泊苷联合用于肿瘤治疗能够显著增强对肿瘤细胞的生长抑制作用和凋亡诱导作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了检测和/或预后癌症对依托泊苷耐药性的方法，其中miR-17-5p和miR-20a成熟体的表达可通过定量PCR等方法进行检测，Bim-S蛋白的表达可通过免疫印迹或免疫组化等方法进行检测，技术简单易行，检测周期短，可操作性强，临床意义十分重大。

本发明提供了使用miR-17-5p和miR-20a的抑制剂逆转依托泊苷耐药性的方法，为靶向治疗肿瘤提供了思路，对依托泊苷耐受肿瘤的临床治疗具有潜在的巨大应用价值。

附图说明

图1. 实施例1中依托泊苷对K562细胞和HL60细胞生长和凋亡的影响，其中A为不同浓度VP-16处理下细胞的存活率；B为Annexin V/PI双染得到的细胞凋亡率。

图2. 实施例2中K562细胞和HL60细胞中miR-17-5p、miR-20a以及Bim-S蛋白的表达差异，其中A为miR-17-5p和miR-20a的相对表达水平；B为Bim-S蛋白的表达检测。

图3. 实施例3中miR-17-5p、miR-20a抑制剂或Bim-S表达载体对K562细胞凋亡的影响，其中A为转染miR-17-5p、miR-20a抑制剂后Annexin V/PI双染法指示细胞凋亡；B为免疫印迹确认Bim蛋白表达载体在细胞内的表达；C为转染Bim-S蛋白表达载体后Annexin V/PI双染法指示细胞凋亡。

图4. 实施例4 miR-17-5p或miR-20a的抑制剂增强K562细胞对VP-16的敏感性，其中A为不同miRNA抑制剂对Bim-S蛋白表达影响；B为转染miR-17-5p或miR-20a的抑制剂后K562细胞在不同浓度依托泊苷处理下的存活抑制率；C为转染miR-17-5p或miR-20a的抑制剂后K562细胞在依托泊苷处理下的细胞凋亡率。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步解释本发明。实施例中用到的主要材料如下：

依托泊苷：购自Sigma公司，使用二甲基亚枫（DMSO）配置成100 mmol/L的储液，冻于-20度，每次使用时用培养基稀释至工作浓度。

细胞系：实施例中所用细胞系均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

抗体：Bim抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

miRNA抑制剂：实施例中所用miRNA抑制剂均购自美国Dharmacon公司。

miRNA定量PCR试剂盒：购自丹麦Exiqon公司。

Neon电转染系统：购自美国Invitrogen公司。

实施例1 K562细胞和HL60细胞对化疗药物依托泊苷的敏感性差异

将K562细胞和HL60细胞按3×10⁵/mL的密度接种于96孔板，培养24小时后分别加入0.1~100 μmol/L 依托泊苷处理24小时（以DMSO作为对照），然后采用MTT检测细胞活性。实验结果见图1A，在各个测试浓度下，依托泊苷均不能有效降低K562细胞的存活率，100 μmol/L 依托泊苷仅能使K562细胞的存活率降低约10%。相反，依托泊苷对HL60细胞的抑制作用与药物剂量呈现正相关性，100 μmol/L 依托泊苷即可使HL60细胞的存活率降低至40%以下。

将K562细胞和HL60细胞按3×10⁵/mL的密度接种于48孔板，培养24小时后分别加入10~100 μmol/L 依托泊苷处理24小时（以DMSO作为对照）。24小时后收集细胞通过AnnexinV-FITC/PI染色检测细胞凋亡。在各个测试浓度下，依托泊苷均不能有效诱导K562细胞发生凋亡（图1B）。相反，低浓度（10 μmol/L）的依托泊苷即可使90%以上的HL60细胞发生凋亡。这些结果表明K562细胞对依托泊苷具有耐药性，而HL60细胞则对依托泊苷具有很高的敏感性。

实施例2 K562细胞和HL60细胞中miR-17-5p、miR-20a以及Bim-S蛋白的表达差异

收集处于对数生长期的K562细胞和HL60细胞，使用Trizol Reagent（美国Invitrogen公司）进行细胞总RNA的提取。采用紫外分光光度计测定RNA浓度。然后将提取的总RNA用miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR（丹麦Exiqon公司）试剂盒进行逆转录（42 °C 1 hr，95 °C 5 min）及实时定量PCR反应，以U6 snRNA的表达水平作为内对照分析miR-17-5p和miR-20a成熟体miRNA在K562细胞和HL60细胞中的表达差异。结果表明，K562细胞中的miR-17-5p和miR-20a成熟体miRNA的表达水平均高于HL60细胞，约为HL60细胞的3倍（图2A）。

收集处于对数生长期的K562细胞和HL60细胞，使用RIPA细胞裂解液裂解细胞总蛋白，并用BCA Protein Assay Kit（美国Thermo Fisher公司）进行蛋白定量。取等量的K562总蛋白和HL60总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳和免疫印迹检测，以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）看家基因的蛋白产物的表达水平作为内对照分析促凋亡蛋白Bim-S在K562细胞和HL60细胞中的表达差异。如图2B所示，Bim-S蛋白在K562细胞中的表达水平显著低于其在HL60中的表达水平。

实施例3 抑制miR-17-5p、miR-20a或过表达Bim-S对细胞凋亡的影响

为了研究miR-17-5p和miR-20a在细胞凋亡中的作用，我们使用Neon电转染系统将单链的miR-17-5p或miR-20a的抑制剂转染进K562细胞。48小时后收集细胞通过AnnexinV-FITC/PI染色检测细胞凋亡。与阴性对照相比，miR-17-5p或miR-20a的抑制剂均可显著提高K562细胞发生凋亡的比例（图3A）。

为了研究Bim-S蛋白对细胞凋亡的影响，我们构建了过表达Bim-S的表达载体。首先使用如下引物（由广州英潍捷基有限公司合成）扩增K562细胞中的Bim cDNA：

上游引物：TTGGATCCCGCCACCATGGCAAAGCAACCTTCTGATG，

下游引物：TTGAATTCTCAATGCATTCTCCACACCAGG。

割胶回收大小符合Bim-S的DNA条带，使用BamHI和 EcoRI限制性内切酶进行双酶切并克隆至pcDNA3载体中，得到Bim-S表达载体并测序确认。使用Neon电转染系统将Bim-S表达载体转染进K562细胞。48小时后收集细胞，部分用于免疫印迹检测（图3B），部分通过AnnexinV-FITC/PI染色检测细胞凋亡（图3C）。与空载相比，Bim-S表达载体可显著提高K562细胞发生凋亡的比例（图3C）。

实施例4 miR-17-5p或miR-20a的抑制剂可逆转K562细胞对依托泊苷的耐药性

使用Neon电转染系统将miR-17-5p、miR-18、miR-19a、miR-19b或miR-20a的抑制剂转染进K562细胞。48小时后收集细胞，使用RIPA细胞裂解液裂解细胞总蛋白，并用BCA Protein Assay Kit进行蛋白定量。取等量的总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳和免疫印迹检测，以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）看家基因的蛋白产物的表达水平作为内对照分析各miRNA抑制剂对促凋亡蛋白Bim-S的表达水平的影响。结果显示仅miR-17-5p和miR-20a的抑制剂能上调Bim-S蛋白的表达（图4A）。

使用Neon电转染系统将miR-17-5p或miR-20a的抑制剂转染进K562细胞, 并将转染后的K562细胞接种于96孔板中。48小时后，分别加入10~80 μmol/L 依托泊苷处理细胞24小时（以DMSO作为对照），然后采用MTT检测细胞活性。如图4B所示，miR-17-5p或miR-20a的抑制剂可以增加依托泊苷对K562细胞存活率的抑制，并且这种抑制作用与依托泊苷的剂量呈现正相关性。

使用Neon电转染系统将miR-17-5p或miR-20a的抑制剂转染进K562细胞, 并将转染后的K562细胞接种于48孔板中。48小时后，分别加入40 μmol/L 依托泊苷处理细胞24小时（以DMSO作为对照），然后收集细胞通过AnnexinV-FITC/PI染色检测细胞凋亡。miR-17-5p或miR-20a的抑制剂均可提高K562细胞在依托泊苷下的凋亡率（图4C），这些结果说明通过miR-17-5p或miR-20a的抑制剂抑制miR-17-5p或miR-20a的表达，可以上调Bim-S促凋亡蛋白的表达并逆转K562细胞对依托泊苷的耐药性。